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Cancer Research

Enrichissement et la caractérisation des tumeur immunitaire et Non immuns micro-environnements dans les tumeurs murines sous-cutanée établis

doi: 10.3791/57685 Published: June 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Nous décrivons ici une méthode pour séparer et enrichir les composants du microenvironnement tumoral immunitaire et non immuns dans les tumeurs sous-cutanées établies. Cette technique permet l’analyse distincte d’infiltrat immunitaire de tumeur et fractions de tumeur non immuns qui peuvent permettre la caractérisation complète du microenvironnement immunitaire de la tumeur.

Abstract

Microenvironnement immunitaire de tumeur (temps) a récemment été reconnu comme un médiateur essentiel de la réponse au traitement dans les tumeurs solides, surtout pour les immunothérapies. Récents progrès cliniques en immunothérapie soulignent la nécessité de méthodes reproductibles avec précision et bien caractériser la tumeur et son infiltrat immune associée. Digestion enzymatique de tumeur et cytométrie permettent large caractérisation de nombreux sous-ensembles de cellules immunitaires et les phénotypes ; Cependant, profondeur d’analyse est souvent limitée par des restrictions de fluorophore sur planche de bord et la nécessité d’obtenir des échantillons de grande tumeur d’observer les rares populations immunitaires d’intérêt. Ainsi, nous avons développé une méthode efficace et haut débit de séparation et d’enrichir l’infiltrat immunitaire de tumeur des composants non immuns tumeur. La digestion de la tumeur décrit et séparation centrifuge axée sur la densité technique permet distincte caractérisation de la tumeur et tumeur immunitaires infiltrant fractions et préserve la viabilité cellulaire et offre donc une large caractérisation de la tumeur État immunologique. Cette méthode a été utilisée pour caractériser la vaste abri l’hétérogénéité spatiale des tumeurs solides, qui démontre également la nécessité pour les techniques de profilage immunologiques compatibles toute tumeur. Dans l’ensemble, cette méthode fournit une technique efficace et adaptable pour la caractérisation immunologique de sous-cutanée tumeurs murines solides ; à ce titre, cet outil peut servir à mieux caractériser les fonctions immunologiques tumorales ainsi que l’évaluation préclinique de nouvelles stratégies d’immunothérapie.

Introduction

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Le temps suppressif a récemment été reconnu comme une caractéristique du cancer et est connu pour jouer un rôle important dans le développement, la progression et la protection des cancers de tumeur solide mais aussi atténuer leur sensibilité à l’immunothérapie1. Le temps est composé de nombreux sous-ensembles cellulaires et les phénotypes, qui donnent un aperçu critique de l’État immunologique de la tumeur. Ces sous-ensembles immunologiques peuvent être encore divisés en cellules lymphocytaires ou origine myéloïde, qui constituent la majorité des réponses immunitaires innée et adaptative2,3. Les progrès récents dans le domaine de l’immunothérapie des cancers ont montré que des stratégies immunothérapeutiques (c.-à-d., les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire, récepteur de l’antigène chimérique T-cellules, etc.) sont susceptibles de provoquer le cancer durable régressions ; Cependant, ils restent relativement inefficaces dans les tumeurs solides cancer4,5. Plusieurs groupes ont montré l’obstacle essentiel que le temps peut jouer sur traitement succès6,7, et par conséquent, il reste nécessaire d’évaluer avec précision les nouvelles immunothérapies dans le paramètre préclinique en se concentrant spécifiquement sur leur capacité à moduler ou à surmonter le temps8.

Les efforts actuels pour caractériser le temps généralement utilisent soit la microscopie ou cytométrie avec anticorps étiquetage des stratégies pour identifier les sous-ensembles cellulaires immunitaires et leurs caractéristiques9,10. Ces deux stratégies fournissent des informations particulièrement bien différentes, comme la microscopie permet de reconnaissance spatiale des sous-ensembles cellulaires et cytométrie offre un débit élevé et une quantification plus large des changements cellulaires. Malgré les améliorations récentes en immunohistochimie multiplexe fluorescent, optimisation des systèmes d’imagerie spectrales, qui maintenant peuvent prendre en charge jusqu'à 7 paramètres, taille du panneau limité est difficile niveau large abri de profilage et cette technique est donc souvent réservé aux plus axé sur les analyses. En conséquence, cytométrie de flux reste l’un du plus largement utilisé immunitaire techniques de profilage. Malgré son utilisation répandue dans la caractérisation de l’époque, les méthodes utilisées pour le traitement et la coloration sont très variables. Le plus souvent de protocoles utilisent une tumeur dissociation enzymatique (c.-à-d., collagénases, DNase, etc.) et méthodes de dissociation manuel pour réaliser des suspensions de cellules individuelles, suivie d’anticorps coloration et analyse7. Malgré les avantages de chaque méthode, plusieurs groupes ont montré la variabilité importante qui peut être induite par le biais de ces techniques11. Cela rend les comparaisons de croix-étude du profilage de microenvironnement tumoral extrêmement difficile, même lors de l’évaluation le même modèle de tumeurs murines. En outre, ces méthodes fournissent un potentiel limité pour évaluer la tumeur cellulaire et immunitaire tumeur infiltrer composants séparément, étant donné que les deux composants sont intercalés après digestion. Quantité d’échantillon limite puis MultiPanel coloration et analyse, qui devient un enjeu majeur lors de la tentative de caractériser les sous-ensembles immunologiques rares (c.-à-d. spécifique lymphocytes)12. Techniques plus récentes comme masse cytométrie en flux, ou cytométrie par temps de vol (CyTOF), permettent une analyse phénotypique haute dimension de sous-ensembles cellulaires avec certains systèmes supportant les conceptions du panneau supérieur à 42 paramètres indépendants13. Malgré la formidable puissance de la technologie CyTOF dans profilage immunitaire, il reste limité en raison de la dépense, expertise de l’analyse et l’accès à l’équipement. En outre, plusieurs protocoles de CyTOF recommandent purification des sous-ensembles immunitaires afin d’améliorer les rapports signal sur bruit14et ainsi, nous suggérons que notre méthode d’enrichissement pourrait être utilisée en amont de l’analyse CyTOF pour améliorer la qualité des données.

Nous décrivons ci-après une digestion microenvironnement tumoral et analyse méthode qui incorpore immunitaire tumeur s’infiltrer dans la séparation. Le but de cette méthode est de permettre à haut débit indépendant profilage des fractions cellulaires tumorales pour une caractérisation plus large du microenvironnement tumoral et infiltrat immunisée tumoral. En utilisant cette méthode, par ailleurs démontrent l’importance d’effectuer des analyses de toute tumeur, comme un modèle de tumeur solide sous-cutanée a été constaté que l’hétérogénéité spatiale immunologique significative. Dans l’ensemble, cette méthode peut plus précisément et uniformément comparer entre les échantillons car elle enrichit pour des sous-ensembles cellulaires immunitaires au sein de la tumeur et permet pour le profilage indépendante de la cellule tumorale et immunitaires fractions d’une tumeur.

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Protocol

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Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) du Baylor College of Medicine.

1. digestion et récolte tumeur

NOTE : Le temps requis pour la récolte est environ 3-5 min/tumeur et le temps nécessaire à la transformation est ~ 1 h + 2-3 min/tumeur.

  1. Euthanasier souris par inhalation de dioxyde de carbone et vaporiser chaque souris vers le bas avec l’éthanol à 70 % avant la récolte pour éviter la contamination de cheveux. Chirurgicalement enlever des tumeurs sous-cutanées des souris et faire en sorte que les tumeurs sont exempts de tout contaminant tissu (c'est-à-dire, cheveux, peau, péritoine, etc.). Placer chaque tumeur dans 1,8 mL de base RPMI 1640 médias sans sérum fœtal (SVF) dans une plaque 24 puits. Pour plus grandes récoltes, garder plaques froid sur la glace afin de préserver la viabilité cellulaire.
    Remarque : Si la stérilité est nécessaire, toutes les dissections tumorales devra sera effectué dans une cabinet avec des outils chirurgicaux stériles (c.-à-d., ciseaux, pinces, etc.), ainsi que d’autres mesures de biosécurité. Tumeurs avec le plus long diamètre entre 0,5 - 1 cm sont optimales, et des tumeurs plus ou moins importants devront être mise à l’échelle des réactifs.
  2. Utiliser des ciseaux pour couper les tumeurs dans moins de 1 mm3 pièces dans chaque puits.
  3. Préparer un 10 x digestion cocktail en dissolvant la collagénase j’à 10 mg/mL, collagénase IV 2 500 U/mL, et DNase I à 200 U/mL dans les médias de RPMI 1640 base (sans FBS).
    Remarque : La cocktail de la digestion peut être préparée un jour à l’avance et conservée à-20 ° C ; Toutefois, un stockage prolongé n’est pas recommandé comme enzymes vont perdre leur activité au fil du temps une fois dissous.
  4. Ajouter 200 µL de 10 x dissociation cocktail contenant collagénase I, IV de la collagénase et DNase I de chaque puits avec les morceaux de3 mm 1.
  5. Laisser les échantillons à digérer pendant 1 h à 37 ° C en agitant légèrement à 60-100 tr/min à l’aide d’un agitateur orbital plaque.
    Remarque : L’élévation de la température à 37 ° C au cours de la digestion enzymatique peut causer activation de cellules immunitaires.
  6. Après 1 h, neutraliser la réaction en ajoutant 1 mL de milieu RPMI 1640 milieux supplémentés avec EDTA FBS et 2 mM de 5 % dans chaque puits.
  7. Pipetter, dans un tamis de cellule de 40 µm assis au sommet d’un tube à centrifuger 50 mL, la digestion de la tumeur et les pièces restantes de la tumeur.
    NOTE : Couper l’extrémité d’une pipette de 1 mL pour faciliter le transfert de la digestion de la tumeur à la crépine.
  8. Un piston de seringue de 10 mL permet de ventiler mécaniquement les pièces de la tumeur par l’intermédiaire de la crépine. Rincer périodiquement le filtre avec 2 mL de milieu RPMI 1640 médias (contenant 5 % FBS) et répétez jusqu'à ce que la crépine de la cellule résulte de la tumeur.
    NOTE : Environ 4 à 10 mL de médias totales doit être suffisant pour bien rincer la crépine de la tumeur.
    NOTE : Placer les échantillons sur la glace avant d’avoir terminé cette étape pour tous les échantillons afin de préserver la viabilité cellulaire.
  9. Ajuster chaque tube à centrifuger 50 mL sur le même volume à partir du support de RPMI 1640 complété.
    Remarque : Le réglage du volume est essentiel pour l’équilibrage de la centrifugeuse. Sauter cette étape pourrait entraîner centrifugeuse des dommages ou des blessures.
  10. Centrifuger les suspensions cellulaires (5 min, 805 x g, 4 ° C), jeter le surnageant et remettre en suspension dans 2 mL de milieu RPMI 1640 médias.
    Remarque : Un agrégat de cellules peut se former après la centrifugation qui est difficile à remettre en suspension. Utiliser une pipette sérologique de 5 mL et mélanger rapidement pour casser vers le haut avant de procéder.

2. séparation des Fractions cellulaires immunitaires et tumorales

NOTE : Le temps nécessaire à cette étape est d’environ 1 h.

  1. Ajouter 3 mL de milieu de gradient de densité au fond d’un tube à centrifuger 15 mL. Préparer et étiqueter assez tubes pour chaque tumeur.
  2. Superposez les 2 mL de suspension cellulaire tumorale sur le dessus du milieu de gradient de densité de pipetage lentement vers le bas de la paroi du tube pour empêcher le mélange des deux couches.
  3. Placer soigneusement les tubes multicouches dans la centrifugeuse et un essorage pendant 20 min à 805 x g, 20 ° C, avec aucun frein.
    Remarque : Il est extrêmement important de vérifier l’équilibrage approprié et d’assurer qu’aucun frein n’est utilisé lors de la centrifugation. Toute perturbation de ce processus aboutira à la couche de mélange et la récupération de l’échantillon complet sera difficile.
  4. Transvaser avec soin la tumeur infiltration leucocytaire (TIL) couche et la couche de médias haut de la page dans un nouveau tube de 15 mL à l’aide d’une pipette de transfert. Jetez tous les restants moyen gradient de densité et Resuspendre le culot de tumeur au bas du tube dans 2 mL de milieu RPMI-1640.
    Remarque : Après centrifugation il y aura quatre calques visibles du haut en bas, qui correspondent respectivement à : médias, TILs, milieu de gradient de densité et culot cellulaire tumorale. Voir la Figure 2A pour obtenir un exemple des différentes couches.
  5. Centrifuger les deux le TIL et des échantillons de tumeur à séparent les tubes (5 min, 805 x g, 4 ° C) et éliminer le surnageant.
  6. Remettre en suspension l’échantillon TIL dans 200 µL et le culot de tumeur dans 2 mL de milieu RPMI 1640 médias. Rester sur la glace afin de préserver la viabilité.

3. placage et coloration

Remarque : Le temps requis pour l’électrodéposition est 30 s/tumeur ; le temps requis pour la coloration de surface est de 1 h ; le temps requis pour la coloration intracellulaire est 40 min ; le temps requis pour l’analyse en cytométrie en flux est 1 - 4 min/tumeur.

  1. Préparer et plaque 96 puits U fond d’étiquette pour chaque immunitaire coloration panneau et une plaque supplémentaire pour cellule compte.
    Remarque : En règle générale, trois plaques sont préparés au total : une plaque de panneau axés sur les lymphocytes et une plaque de panneau myéloïde axé sur une plaque de comptage de cellules.
  2. Aliquote les suspensions unicellulaires dans chacun de la coloration panel plaques et un volume dans la plaque de comptage.
    Remarque : La plaque de comptage est utilisée pour calculer le nombre total de cellules ajoutées à chaque panneau coloration, permettant ainsi aux chiffres de population de cellules précises. Un cytomètre en flux avec capacités de plaque à 96 puits d’échantillonnage et d’analyse volumétrique peut fournir le nombre de cellules par µL de chaque échantillon et donc calculer le nombre de cellules ajoutées à chaque panneau de coloration. Plaques de numération peuvent être acquises le jour suivant après fixation nuit à 4 ° C, rinçage avec du tampon de FACs (tampon phosphate salin (PBS) avec 2 % FBS) et resuspendant dans un volume de tampon de FACs.
  3. Laver les cellules deux fois avec 200 µL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (SPD) par exemple par centrifugation (5 min, 805 x g, 4 ° C) et jeter le surnageant entre chaque rinçage pour enlever toute FBS gratuit.
  4. Ajouter 50 µL de bloc Fc, mélanger les échantillons à l’aide d’une pipette multi-canaux et incuber pendant 20 min à 4 ° C.
  5. Ajouter 50 µL de 2 x concentré anticorps ciblant extracellulaire et viabilité fixable tache mélange, mélanger à l’aide d’une pipette multi-canaux et incuber 30 min à l’obscurité à RT ou 4 ° C.
    Remarque : Les conditions exactes de coloration pour l’anticorps dépendent du fabricant. Coloration de toutes les dilutions doivent être en SPD, avec aucun FBS ajouté pour éviter la saturation de la teinture de viabilité réparable. S’il vous plaît voir Table des matières, équipements pour les dilutions optimales du panneau coloration utilisée dans ce manuscrit. Anticorps et viabilité fixable solution de coloration est disposée à une concentration de 2 x à fournir une finale 1 x concentration dans 100 µL du volume total de coloration lors de l’ajout au bloc Fc de coloration.
  6. Laver les échantillons deux fois avec le tampon de FACs par centrifugation (5 min, 805 x g, 4 ° C) et en jetant les surnageants entre chaque rinçage.
  7. Resuspendre dans 200 µL de solution de fixation/perméabilisation 1 x et incuber une nuit à 4 ° C, abri de la lumière.
    Remarque : L’expérience peut être interrompue du jour au lendemain à ce stade : conserver les échantillons à 4 ° C, abri de la lumière.
  8. Le lendemain, centrifuger les plaques (5 min, 805 x g, 4 ° C) et éliminer le surnageant.
  9. Rincez une fois avec 200 µL de 1 x tampon de perméabilisation, centrifugeuse (5 min, 805 x g, 4 ° C) et éliminer le surnageant.
  10. Ajouter 100 µL de 1 panneau x concentré anticorps intracellulaire coloration préparé dans du tampon 1 x perméabilisation et incuber 30 min à l’obscurité à RT ou 4 ° C (cela dépend de coloration des recommandations du fabricant).
  11. Rincez une fois avec perméabilisation 1 x tampon (5 min, 805 x g, 4 ° C), éliminer le surnageant et rincez une deuxième fois avec le tampon de FACs (PBS contenant 2 % FBS).
  12. Remettre en suspension les échantillons dans 300 µL de tampon de FACs (PBS contenant 2 % FBS), transférer les échantillons aux tubes de cytométrie en flux et effectuer l’analyse en cytométrie en flux.

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Representative Results

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Nos résultats démontrent l’avantage significatif de TIL la séparation des éléments de tumeur non immunisés, comme cela est expliqué dans le protocole. En outre, à l’aide de la méthode décrite, nous démontrons l’hétérogénéité immunologique significative des tumeurs solides établies.

Un problème important avec nombreuses techniques de dissociation de tumeur est la perte de viabilité de l’échantillon, plus souvent en raison des conditions rudes de la digestion (c.-à-d. élevée des températures, l’apport en nutriments insuffisante, etc.). Utilisation de la méthode de digestion décrit, avec ou sans densité enrichissement moyen dégradé, fournit environ 70-90 % total viabilité cellulaire tel qu’évalué par cytométrie en flux (Figure 1A). Viabilités similaires ont été observées chez le TIL enrichi et tumeur enrichi de fractions, ce qui suggère que cette méthode provoque une toxicité globale minimale (Figure 1, Figure 2C). En outre, l’enrichissement moyen gradient de densité favorisé une plus grande que 2 fois augmentation du CD45 positif TIL fraction chez les cellules viables totales analysé les digestions de tumeur par rapport aux non enrichi (Figure 1B, C). En outre, l’enrichissement s’est avéré pour améliorer de nombreux sous-ensembles de cellules immunitaires communément évalués dans des études microenvironnement immunitaire, y compris les cellules myéloïdes dérivés suppresseur (MDSCs), les cellules dendritiques (CD), macrophages, lymphocytes T CD8 et CD4 T-cellules ( Figure 1D, E). Cela suggère que l’enrichissement moyen gradient de densité favorise l’enrichissement global immunocyte et n’isole pas les lymphocytes spécifiques ou des populations myéloïdes (voir Figure supplémentaire 1 a, B pour la cytométrie en flux Gate méthode utilisée pour identifier populations de cellules spécifiques). Il est à noter cependant, que plusieurs médias séparation gradient de densité disponible dans le commerce permettent une fraction significative des érythrocytes et granulocytes de passer par la phase de séparation. Ainsi, si ces populations présentent un intérêt, outre optimisation de protocole peut être nécessaire.

Figure 1
Figure 1 : Enrichissement douce et efficace d’infiltrat immunitaire tumeur. Tumeurs de MEER établis ont été excisées et digéré à l’aide de la méthode décrite. Après digestion, des suspensions de cellules individuelles ont été divisées tels que la moitié a subi une enrichissement moyen gradient de densité et l’autre que moitié ont été directement colorées. (A) évaluation de cytométrie en flux cumulés de la viabilité cellulaire pour les digestions de tumeur avec ou sans enrichissement moyen gradient de densité. (B) représentant écoulement cytometry déclenchement d’emplacements montrant l’enrichissement des cellules immunitaires positive CD45 d’une digestion de tumeur unique avec et sans enrichissement moyen gradient de densité. (C) Cumulative écoulement cytometry CD45 positif cellulaire pourcentages parmi les cellules viables totales de digestions tumeur avec ou sans enrichissement moyen gradient de densité. (D) ratios d’enrichissement des divers myéloïde et immunitaires populations de lymphocytes. Les tumeurs ont été digérées en suspension monocellulaire avant d’être teinté directement ou en cours d’enrichissement gradient de densité avant coloration et écoulement cytometry analyse. Chaque rapport d’enrichissement de type cellulaire a été calculée en divisant un pourcentage de cellules-population donnée (entre les cellules viables totales évaluée) de la digestion de tumeur enrichi gradient de densité par son homologue non enrichi. Bar les lignes représentent la médiane et les bords de la barre les ratios minimums et maximums. Tableau (E) de l’expression de marqueurs cellulaires immunitaires utilisée pour identifier chaque population de cellules immunitaires analysée. Signification statistique a été déterminée avec un t-test non apparié ou le test de Mann Whitney. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ***p < 0,0001, (n = 20 tumeurs, N = 2 pour tous les graphes). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Un des avantages plus importants que cette méthode fournit est la capacité à profil indépendamment la fraction de tumeur non immuns. Après l’isolement de la fraction de granulés non immuns tumeur qui traverse la phase moyenne gradient de densité, tumeur complexe panneaux de profilage peut être effectuée qui précédemment peut avoir été limitée par nombre de fluorophore et limites de quantité d’échantillon. Figure 2 A montre un exemple de la caractérisation de cytométrie de flux tumeur avec plus 70 % de viabilité et d’enrichissement de 99 % CD45 cellule négative. La fraction négative CD45 peut alors que nous vous présentons de nombreuses caractéristiques de la tumeur comme la viabilité globale de tumeur ou apoptose (c.-à-d., caspase 3, annexine V, etc.), capacité de prolifération (c.-à-d., Ki67) et l’expression de diverses marqueurs immunosuppresseurs (c.-à-d., programmé mort-ligand 1 (PD-L1) ou PD-L2). Toutefois, il convient de noter que la fraction négative CD45 comprend les cellules tumorales comme autres éléments vasculaires et stromales du microenvironnement tumoral. Ainsi, si la caractérisation de cellules tumorales direct est nécessaire, un marqueur spécifique de cellules de tumeur devra être utilisée (c'est-à-dire, cytokératine, antigène spécifique associé aux tumeurs, etc.). De même, autres éléments de tumeur stromale pourraient être facilement identifiés et caractérisés après marquage avec un marqueur spécifique de type cellulaire comme les cellules endothéliales vasculaires tumeur (CD31) et le cancer associés fibroblastes (actine muscle lisse-α). Néanmoins, le niveau de viabilité et d’enrichissement de cellules négatives CD45 est très constante dans les échantillons répétés, indiquant la robustesse de la technique de séparation de gradient de densité pour l’enrichissement de composant non immuns tumorale (Figure 2B, C ).

Figure 2
Figure 2 : Enrichissement et profilage des caractéristiques tumorales non immuns composant. (A) image représentative d’un échantillon après enrichissement moyen gradient de densité avec couche multimédias visibles (rose), TIL couche (mince blanc glauque), couche moyenne gradient de densité (clair) et pellet tumeur au fond du tube. (B) représentant cytométrie gating stratégie utilisé pour le profilage de la composante tumorale non immuns, avec diagramme de dispersion de viabilité cellulaire (en haut), diagramme de dispersion enrichissement CD45 cellule négative (en bas à gauche) et trois marqueurs indépendants d’intérêt expression par l’intermédiaire de parcelles de l’histogramme (PD-L1 haut, PD-L2 moyen et bas Ki67). FMO histogramme représente un échantillon souillé avec toutes les autres couleurs du panneau, mais manque le marqueur d’intérêt. Évaluation de cytométrie en flux cumulés de viabilité cellulaire (C) et les pourcentages de cellules négatives CD45 (D) entre les cellules viables totales de la fraction de granule de tumeur après enrichissement moyen gradient de densité (n = 7 et 8 des tumeurs). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Malgré des efforts importants pour caractériser l’hétérogénéité génétique des tumeurs solides, peu de travaux a détaillé l’hétérogénéité spatiale des sous-ensembles immunologiques dans les tumeurs solides. Ainsi l’étude visait à déterminer comment myéloïde et sous-ensembles immunologique des lymphocytes considérablement variés tout au long d’une tumeur solide unique. Ainsi, une tumeur de MEER établie a été divisée en quatre parties égales avec grand soin afin de s’assurer que chaque section contenait environ égales tumorale intra régions, ainsi que des parties égale par voie cutanée et péritonéale-orientée (Figure 3A). Chaque morceau de la tumeur a été digéré séparément, puis enrichie par le milieu de gradient de densité et répartie entre un panneau myéloïde et lymphocytaire. Ceci a permis la quantification des diverses fonctionnalités dont un certain nombre de populations immunocyte communément mises en recouvrement : les lymphocytes T, lymphocytes t CD4 +, cellules T CD8 +, macrophages, DCs, MDSCs (voir Figure supplémentaire 1 a, B pour la cytométrie en flux Gate stratégie). Au sein d’une tumeur unique, variabilité cellulaire significative entre les partitions différentes tumeurs a été noté (Figure 3b). Par exemple, nombre total de cellules fois DC et les cellules T ont été trouvé à varier par autant que 4 à 5 fois entre pièces adjacentes de tumeur. Ces changements drastiques ont également été observés lorsque analyse des cellules des populations comme un pourcentage de cellules viables totales (complémentaire Figure 2 a) et ont été observés à des niveaux similaires dans les deux autres tumeurs indépendants (Figure supplémentaire 2 b, C). Ces résultats démontrent l’importance d’isoler et d’analyser la tumeur entière lorsque vous effectuez des analyses microenvironnement immunitaire qui peuvent sembler paradoxale si les protocoles actuels incluent divisant la tumeur pour permettre une analyse complémentaire par indépendant Méthodes (c'est-à-dire, histologie, quantification de RNA, etc.). En outre, ces données peuvent expliquer les écarts dans les analyses immunologiques des biopsies de tumeurs, comme régional intratumorale hétérogénéité immunologique pourrait fausser considérablement résultats de la biopsie.

Figure 3
Figure 3 : Évaluation de l’hétérogénéité immunitaire tumeur établie. (A) image représentative d’une tumeur de MEER établie après la résection chirurgicale (à gauche) et après que division égale en 4 adjacentes des pièces (à droite). Barre d’échelle est de 1 cm, représentée en noir sur chaque image. (B) pli change de divers myéloïde et lymphocytes numérations entre chacune des 4 parties adjacentes tumeur ; chaque section de la tumeur a subi le même digestion, procédure d’enrichissement moyen gradient de densité, coloration et analyse. Chaque partie de la tumeur est montré comme un changement de pli numération cellulaire, tel que déterminé en divisant le nombre de ses globules par la partie de la tumeur avec le comte de la plus faible des cellules analysées pour une population donnée cellulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplemental Figure 1
La Figure 1: cytométrie en flux représentatif gating stratégie utilisé pour le profilage de la composante immunitaire tumeur. (A) Gating stratégie avec des diagrammes respectifs utilisés pour le profil immunitaire lymphocytaire. (B) Gating stratégie avec diagrammes respectifs, utilisés pour le profilage immunitaire myéloïde de tumeur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplemental Figure 2
La Figure 2: cotisation supplémentaire d’hétérogénéité tumorale établies. (A) pourcentage cellulaire chez les cellules viables total pli changement de tumeur égale 4 pièces illustré à la Figure 3. (B) et (C) sont deux supplémentaires établies MEER tumeurs divisées en 4 parties adjacentes et analysés pour les système immunitaire hétérogénéité tumorale. Changements cellulaires comte pli (à gauche) et pourcentages cellulaire chez les cellules viables totales pli changements (à droite) pour chaque myéloïde et population de cellules lymphocytaires analysés montrant la variabilité de chacune des 4 parties adjacentes de tumeur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Le temps est composé de molécules et les composants cellulaires diverses et complexes. Récentes indiquent que la caractérisation précise de cet environnement peut fournir une meilleure compréhension de la réussite du traitement ou d’échec et peut même aider à identifier les mécanismes de résistance thérapeutique. Par exemple, intratumorale niveaux croissants de diverses cellules immunosuppresseurs (c.-à-d., MDSCs, les lymphocytes T régulateurs, etc.) peuvent atténuer les réponses immunes effectrices et abroger les effets immunothérapeutiques. En revanche, la présence d’intratumorale croissante des populations immunitaire effecteur (par exemple, les cellules T CD8 + spécifique, les cellules NK, cellules T auxiliaires) peut être puissants prédicteurs de la réussite du traitement. Une autre caractérisation qui continue de représenter avec précision l’état immunitaire de tumeur est les caractéristiques phénotypiques des cellules tumorales eux-mêmes. Cela inclut l’expression de divers ligands immunosuppresseurs, enzymes ou molécules visant à la diminution des réponses immunitaires effecteur (c.-à-d., PD-L1, PD-L2 indolamine 2,3 dioxygenase, monoxyde d’azote, etc.). Pris ensemble, cela démontre la nécessité pour la caractérisation précise et large des caractéristiques cellulaires le système immunitaire et la tumeur de tumeurs solides.

La technique que nous décrivons ci-après permet de séparation et l’enrichissement de la tumeur et immunitaire composants cellulaires de tumeurs sous-cutanées murines solides. Puis, profilage de cytométrie en flux indépendant peut être effectué afin que le temps plein et l’interaction des cellules tumorales avec le temps peut être apprécié. Suite à l’enrichissement, panneaux cytométrie en flux immunitaire vaste peut être optimisées afin de permettre la caractérisation de composants clés myéloïdes et lymphoïdes cellulaires, mais aussi une variété de caractéristiques décrivant leur état phénotypique. De même, tumeur une vaste cellule concentré panneau peut être utilisé indépendamment pour fournir la large caractérisation des caractéristiques des cellules tumorales ainsi. La relative simplicité de cette technique permet l’analyse simultanée d’un grand nombre de tumeurs murines, ce qui est essentiel pour l’observation des tendances malgré la variabilité biologique des modèles murins de tumeur. En outre, enrichissement immunitaire tumeur donne meilleure identification des sous-ensembles immunologiques rares (p. ex., tumeur spécifique les cellules T cytotoxiques), qui sont souvent nettement sous-représentées au sein de la tumeur par rapport à d’autres composants de la cellule non immuns . Optimisation de cette technique peut permettre à d’autres analyses en aval sur ces sous-ensembles isolées nécessitant d’enrichissement, notamment coculture ex vivo des essais, ARNm profilage ou études de transfert de cellule adoptifs.

En utilisant cette technique dans un modèle tumoral murin sous-cutanée, nous démontrons l’enrichissement significatif des sous-ensembles immunitaires globales et indépendants. Nous démontrons la tumeur non immuns profilage qui peut être réalisé à partir des mêmes échantillons de tumeur. Enfin, nous montrent l’importance de toute tumeur profilage immunologique, que nous avons observé une hétérogénéité significative immunologique dans les sections adjacentes d’une tumeur. Idéalement, cette technique de collagénase et axée sur la DNase digestion et axée sur le gradient de la séparation des fractions tumeur immunitaire et non immuns pourraient être appliquées à la majorité des modèles murins de tumeur, les deux orthotopique et sous-cutanée. Nous avons également observé que petites tumeurs non établis et moins modèles tumeur collagène dense (c.-à-d., B16, mélanome) souvent ne nécessitent pas une étape de digestion enzymatique pour générer des suspensions unicellulaires15; Toutefois, enrichissement immunitaire par gradient effectue également ainsi dans ces modèles de tumeur, plus valider sa polyvalence. Malgré les inquiétudes préalables sur la digestion de collagénase antigène sur des sous-ensembles cellulaires spécifiques11, il faut encore observer une perte notable de qualité pour toutes les marques que nous avons dressé un profil de coloration. Néanmoins, la sensibilité de l’antigène à ces conditions de digestion doit être évaluée en utilisant des échantillons de contrôle adéquat non digérés avant l’adoption générale de cette technique.

En conclusion, notre technique permet une caractérisation précise, large et haut-débit des composantes immunitaires et non immuns tumeur des tumeurs solides murines. En effectuant un profilage indépendant de ces sous-ensembles, chercheurs peuvent largement caractériser le temps et comprendre mieux mécaniste thérapies préclinique de tumeur solide. Cette méthode peut être facilement appliquée à la grande majorité des modèles murins de tumeur pour analyse à haut débit des lymphocytes et les chiffres de population immunocyte myéloïde et phénotypes par cytométrie en flux, ou autres épreuves en aval nécessitant un enrichissement de sous-ensemble.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

JMN reconnaît financièrement par le National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) et le National Institute of Dental & Craniofacial Research (F31DE026682) de la National Institutes of Health. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health. Ce projet a également bénéficié de la cytométrie en flux et noyau de tri cellulaire au Baylor College of Medicine financée par les NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 et S10 RR024574) et l’aide des experts de Joel M. Sederstrom.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 to 12 week old male C57BL/6 mice Jackson Laboratory  N/A Mice used in our tumor studies
MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line Acquired from collaborator  N/A E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line 
70% isopropyl alcohol  EMD Milipore  PX1840
Murine surgical tool kit World Precision Instruments MOUSEKIT Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. 
24-well plate  Denville Scientific Inc. T1024 Or any 24-well flat bottom plate. 
RPMI-1640 media Sigma-Aldrich R0883
Collagenase I  EMD Milipore 234153
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation LS004189
DNase I  Sigma-Aldrich 11284932001
Low Speed Orbital Shaker BioExpress (supplier: Genemate)  S-3200-LS Or any orbital shaker. 
Thermoregulating incubator Fisher Scientific 13-255-27 Or any other thermo-regulated incubator
FBS Sigma-Aldrich F8192
EDTA AMRESCO E177
1 mL Pipette and tips Eppendorf 13-690-032 Or any other pipette and tips
40 um Cell Strainers Fisher Scientific 22363547
50 mL Centrifuge Tubes Denville Scientific Inc. C1062-P
15 mL Conical Tubes Denville Scientific Inc. C1012
10 mL Luer-Lok Syringe without needles BD 309604
Lymphoprep Density Gradient Medium STEMCELL Technologies 7811
Transfer Pipettes Denville Scientific Inc. P7212
96-well U-bottom plates Denville Scientific Inc.
DPBS Sigma Aldrich  D8573
FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set  ThermoFisher Scientific 00-5523-00 Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer
Thermoregulated Centrifuge Eppendorf  5810 R
Attune NxT Flow Cytometer ThermoFisher Scientific N/A For 96-well cell volumetric counting 
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2  ThermoFisher Scientific 553141 Fc Block
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation ThermoFisher Scientific L34962 Fixable viability stain
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 ThermoFisher Scientific 47-0451-80
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC ThermoFisher Scientific 17-5961-82
CD8-α Antibody (KT15), PE Santa Cruz Biotechnology sc-53473 
CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 ThermoFisher Scientific 15-0041-81
MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 ThermoFisher Scientific 56-5321-82
CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 ThermoFisher Scientific 15-0114-82
F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 ThermoFisher Scientific 48-4801-80
CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC ThermoFisher Scientific 17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE ThermoFisher Scientific 12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 ThermoFisher Scientific 25-5982-80
CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 ThermoFisher Scientific 46-9972-82
Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 BD Biosciences 563755

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Enrichissement et la caractérisation des tumeur immunitaire et Non immuns micro-environnements dans les tumeurs murines sous-cutanée établis
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Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors. J. Vis. Exp. (136), e57685, doi:10.3791/57685 (2018).More

Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors. J. Vis. Exp. (136), e57685, doi:10.3791/57685 (2018).

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