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Cancer Research

संवर्धन और ट्यूमर प्रतिरक्षा और गैर प्रतिरक्षा Microenvironments के लक्षण विस्थापन में स्थापित चमड़े के नीचे Murine ट्यूमर

doi: 10.3791/57685 Published: June 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम एक विधि का वर्णन करने के लिए अलग और ट्यूमर प्रतिरक्षा और गैर प्रतिरक्षा microenvironment के घटकों को समृद्ध स्थापित चमड़े के नीचे ट्यूमर. इस तकनीक ट्यूमर प्रतिरक्षा घुसपैठ और गैर प्रतिरक्षा ट्यूमर अंशों जो ट्यूमर प्रतिरक्षा microenvironment के व्यापक लक्षण वर्णन कर सकते है के अलग विश्लेषण के लिए अनुमति देता है ।

Abstract

ट्यूमर प्रतिरक्षा microenvironment (समय) हाल ही में ठोस ट्यूमर में उपचार प्रतिक्रिया के एक महत्वपूर्ण मध्यस्थ के रूप में मांयता प्राप्त किया गया है, विशेष रूप से immunotherapies के लिए । immunotherapy में हाल ही में नैदानिक प्रगति सही और अच्छी तरह से ट्यूमर और उसके जुड़े प्रतिरक्षा घुसपैठ की विशेषता के लिए reproducible तरीकों के लिए की जरूरत पर प्रकाश डाला । ट्यूमर एंजाइमी पाचन और प्रवाह cytometric विश्लेषण कई प्रतिरक्षा कोशिका उपसमुच्चय और phenotypes के व्यापक लक्षण वर्णन की अनुमति दें; हालांकि, विश्लेषण की गहराई अक्सर पैनल डिजाइन और बड़े ट्यूमर के नमूने प्राप्त करने के लिए ब्याज की दुर्लभ प्रतिरक्षा आबादी का पालन करने की आवश्यकता पर प्रतिबंध fluorophore द्वारा सीमित है । इस प्रकार, हम अलग और गैर प्रतिरक्षा ट्यूमर घटकों से ट्यूमर प्रतिरक्षा घुसपैठ को समृद्ध करने के लिए एक प्रभावी और उच्च प्रवाह विधि विकसित की है । वर्णित ट्यूमर पाचन और केंद्रापसारक घनत्व आधारित जुदाई तकनीक ट्यूमर और ट्यूमर प्रतिरक्षा घुसपैठ अंशों के अलग लक्षण वर्णन की अनुमति देता है और सेलुलर व्यवहार्यता को बरकरार रखता है, और इस प्रकार, ट्यूमर का एक व्यापक लक्षण वर्णन प्रदान करता है immunologic राज्य. इस विधि के लिए ठोस ट्यूमर है, जो आगे सुसंगत पूरे ट्यूमर immunologic तकनीक की जरूरत को दर्शाता में व्यापक स्थानिक प्रतिरक्षा विविधता विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया था । कुल मिलाकर, इस विधि चमड़े के नीचे ठोस murine ट्यूमर के immunologic लक्षण वर्णन के लिए एक प्रभावी और अनुकूलनीय तकनीक प्रदान करता है; जैसे, इस उपकरण के लिए बेहतर ट्यूमर immunologic सुविधाओं और उपंयास immunotherapeutic रणनीतियों के नैदानिक मूल्यांकन में विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

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दमन समय हाल ही में कैंसर की एक बानगी के रूप में मांयता प्राप्त किया गया है, और के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा जाना जाता है, प्रगति, और ठोस ट्यूमर के कैंसर के संरक्षण के रूप में अच्छी तरह के रूप में1immunotherapy को अपने संवेदनशीलता को कम । समय कई सेलुलर सबसेट और phenotypes, जिनमें से सभी ट्यूमर के immunologic राज्य में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान से बना है । इन immunologic सबसेट लिम्फोसाइट या माइलॉयड मूल है, जो एक साथ जंमजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं2,3के बहुमत का गठन की कोशिकाओं में और अधिक स्तरीकृत जा सकता है । कैंसर immunotherapy के क्षेत्र में हाल ही में अग्रिमों का प्रदर्शन किया है कि immunotherapeutic रणनीतियों (यानी, प्रतिरक्षा चौकी अवरोधकों, chimeric प्रतिजन रिसेप्टर टी कोशिकाओं, आदि) के लिए टिकाऊ कैंसर पैदा करने की क्षमता है हीनताओं हालांकि, वे ठोस ट्यूमर कैंसर में अपेक्षाकृत अप्रभावी रहना4,5. कई समूहों के महत्वपूर्ण बाधा है कि समय के उपचार6,7पर खेल सकते है दिखाया है, और इस प्रकार, वहां एक के लिए सही पूर्व नैदानिक सेटिंग में नए immunotherapies मूल्यांकन की जरूरत है विशेष रूप से अपने पर ध्यान केंद्रित संग्राहक या8समय पर काबू पाने की क्षमता ।

वर्तमान समय विशेषताएं आमतौर पर या तो माइक्रोस्कोपी या प्रवाह cytometry एंटीबॉडी लेबलिंग रणनीतियों के साथ प्रतिरक्षा सेलुलर सबसेट की पहचान करने के लिए और उनकी सुविधाओं का उपयोग9,10। इन दो रणनीतियों विशिष्ट अलग जानकारी प्रदान करते हैं, के रूप में माइक्रोस्कोप सेलुलर उपसमुच्चय और प्रवाह cytometry के स्थानिक सराहना की अनुमति देता है उच्च प्रवाह और सेलुलर परिवर्तन के व्यापक ठहराव प्रदान करता है । फ्लोरोसेंट मल्टीप्लेक्स में हाल ही में सुधार के बावजूद immunohistochemistry अनुकूलन वर्णक्रमीय इमेजिंग सिस्टम है, जो अब तक 7 मापदंडों का समर्थन कर सकते हैं, सीमित पैनल आकार व्यापक स्तर की प्रतिरक्षा मुश्किल और इस प्रकार इस तकनीक की रूपरेखा बनाता है अक्सर अधिक ध्यान केंद्रित विश्लेषण के लिए आरक्षित । एक परिणाम के रूप में, प्रवाह cytometry सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल प्रतिरक्षा रूपरेखा तकनीकों में से एक रहता है । समय लक्षण वर्णन में अपने व्यापक उपयोग के बावजूद, तरीकों प्रसंस्करण और धुंधला के लिए इस्तेमाल किया काफी चर रहे हैं । अक्सर प्रोटोकॉल एक ट्यूमर dissociating एंजाइम का उपयोग (यानी, collagenases, DNase, आदि) और मैनुअल पृथक्करण तरीकों एकल सेल निलंबन को प्राप्त करने के लिए, एंटीबॉडी धुंधला और विश्लेषण के बाद7। प्रत्येक विधि के लाभों के बावजूद, कई समूहों व्यापक परिवर्तनशीलता है कि इन तकनीकों11के माध्यम से प्रेरित किया जा सकता है दिखाया गया है । यह भी एक ही murine ट्यूमर मॉडल का आकलन करते समय, बहुत मुश्किल रूपरेखा microenvironment के पार अध्ययन तुलना करता है. इसके अलावा, इन तरीकों को सीमित क्षमता प्रदान करने के लिए ट्यूमर सेलुलर और ट्यूमर प्रतिरक्षा घुसपैठ घटकों का आकलन स्वतंत्र रूप से, के बाद से दोनों घटकों पाचन के बाद interspersed हैं । नमूना मात्रा तो बहु पैनल धुंधला और विश्लेषण, जो दुर्लभ immunologic उपसमुच्चय (यानी, ट्यूमर विशिष्ट टी कोशिकाओं)12की विशेषता का प्रयास करते समय एक प्रमुख मुद्दा बन जाता है सीमा । ऐसे मास cytometry, या उड़ान के समय से cytometry के रूप में हाल ही में तकनीक (CyTOF), कुछ उच्च ४२ से अधिक स्वतंत्र मानकों13के पैनल डिजाइन का समर्थन प्रणालियों के साथ सेलुलर सबसेट के आयामी phenotypic विश्लेषण की अनुमति । प्रतिरक्षा रूपरेखा में CyTOF प्रौद्योगिकी के जबरदस्त शक्ति के बावजूद, यह खर्च की वजह से सीमित रहता है, विश्लेषण विशेषज्ञता, और उपकरणों के लिए उपयोग । इसके अलावा, कई CyTOF प्रोटोकॉल प्रतिरक्षा सबसेट की शुद्धि की सिफारिश करने के लिए संकेत में सुधार-शोर अनुपात14, और इस प्रकार हम सुझाव है कि हमारे संवर्धन विधि CyTOF विश्लेषण के ऊपर इस्तेमाल किया जा सकता है डेटा की गुणवत्ता में सुधार होगा ।

इस के साथ साथ हम एक ट्यूमर microenvironment पाचन और विश्लेषण विधि का वर्णन है कि ट्यूमर प्रतिरक्षा घुसपैठ जुदाई शामिल है । इस विधि के प्रयोजन के ट्यूमर प्रतिरक्षा घुसपैठ और ट्यूमर microenvironment के व्यापक लक्षण वर्णन के लिए सेलुलर भागों के स्वतंत्र उच्च प्रवाह की रूपरेखा की अनुमति है । इस विधि का उपयोग करना, हम आगे पूरे ट्यूमर विश्लेषण प्रदर्शन के महत्व को प्रदर्शित करता है, एक चमड़े के नीचे ठोस ट्यूमर मॉडल के रूप में महत्वपूर्ण स्थानिक immunologic विविधता पाया गया था । कुल मिलाकर, इस विधि और अधिक सही और लगातार नमूने के बीच तुलना कर सकते हैं क्योंकि यह ट्यूमर के भीतर प्रतिरक्षा सेलुलर सबसेट के लिए समृद्ध करता है और ट्यूमर सेल और एक ट्यूमर की प्रतिरक्षा भागों की स्वतंत्र रूपरेखा के लिए अनुमति देता है ।

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Protocol

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यहां बताए गए सभी तरीकों को Baylor कॉलेज ऑफ मेडिसिन की संस्थागत एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी (IACUC) ने मंजूरी दी है ।

1. ट्यूमर फसल और पाचन

नोट: फसल के लिए आवश्यक समय ~ 3-5 मिनट/ट्यूमर है, और प्रसंस्करण के लिए आवश्यक समय ~ 1 ज + 2-3 मिनट/

  1. कार्बन डाइऑक्साइड सांस लेना और स्प्रे द्वारा चूहों Euthanize प्रत्येक माउस ७०% इथेनॉल के साथ नीचे कटाई से पहले बाल संदूषण को रोकने के लिए । शल्य चिकित्सा चूहों से चमड़े के नीचे ट्यूमर को दूर करने और यह सुनिश्चित करें कि ट्यूमर किसी भी दूषित ऊतक से मुक्त कर रहे हैं (यानी, बाल, त्वचा,, आदि) । एक 24 अच्छी तरह से थाली में भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के बिना आधार RPMI के १.८ मिलीलीटर-१६४० मीडिया में प्रत्येक ट्यूमर प्लेस । बड़ी फसल के लिए, प्लेटें बर्फ पर ठंडा रखने के लिए सेलुलर व्यवहार्यता को संरक्षित ।
    नोट: बाँझता की आवश्यकता है, तो सभी ट्यूमर विच्छेदों बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरण (यानी, कैंची, संदंश, आदि), साथ ही किसी भी आगे के कदम के साथ एक सुरक्षा के मंत्रिमंडल में किया जा करने की आवश्यकता होगी. ०.५-1 सेमी के बीच सबसे लंबे समय तक व्यास के साथ ट्यूमर इष्टतम कर रहे हैं, और बड़े या छोटे ट्यूमर रिएजेंट के स्केलिंग की आवश्यकता होगी ।
  2. एक अच्छी तरह से कम 1 मिमी3 टुकड़ों में ट्यूमर को काटने के लिए कैंची का प्रयोग करें ।
  3. collagenase मैं 10 मिलीग्राम/एमएल, collagenase IV पर २,५०० u/एमएल में भंग करके एक 10x पाचन कॉकटेल तैयार करें, और DNase मैं २०० u/एमएल में बेस RPMI-१६४० मीडिया (FBS के बिना) ।
    नोट: पाचन कॉकटेल अग्रिम में एक दिन तैयार किया जा सकता है और-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत; हालांकि, लंबे समय तक भंडारण एंजाइमों गतिविधि खो बार के रूप में एक बार भंग हो जाएगा के रूप में अनुशंसित नहीं है ।
  4. collagenase मैं, collagenase IV युक्त 10x पृथक्करण कॉकटेल के २०० µ एल जोड़ें, और 1 मिमी3 टुकड़े के साथ मैं एक अच्छी तरह से करने के लिए DNase ।
  5. नमूनों की अनुमति दें 1 ३७ डिग्री सेल्सियस पर एच के लिए पचा जबकि हल्के ६०-१०० rpm को एक कक्षीय प्लेट शेखर का उपयोग में मिलाते हुए ।
    नोट: एंजाइमी पाचन के दौरान ३७ डिग्री सेल्सियस के तापमान की ऊंचाई प्रतिरक्षा कोशिका सक्रियण का कारण हो सकता है ।
  6. 1 ज के बाद, RPMI के 1 मिलीलीटर-१६४० मीडिया 5% FBS और 2 मिमी EDTA के साथ एक अच्छी तरह से पूरक जोड़कर प्रतिक्रिया बेअसर ।
  7. पिपेट ट्यूमर पाचन और एक ४० µm सेल छलनी में शेष ट्यूमर टुकड़े एक ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब के शीर्ष पर बैठा है ।
    नोट: ट्यूमर पाचन के छलनी के लिए आसान हस्तांतरण के लिए एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप के बंद टिप में कटौती ।
  8. एक 10 मिलीलीटर सिरिंज गोताख़ोर का उपयोग करने के लिए यांत्रिक छलनी के माध्यम से ट्यूमर के टुकड़ों को समग्र । समय पर पूरक RPMI के 2 मिलीलीटर-१६४० मीडिया के साथ छलनी कुल्ला (5% FBS युक्त) और दोहराने जब तक सेल छलनी ट्यूमर का स्पष्ट है ।
    नोट: कुल मीडिया के लगभग 4-10 मिलीलीटर पर्याप्त रूप से ट्यूमर के छलनी कुल्ला करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए ।
    नोट: यह चरण सभी नमूनों के सेलुलर व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए पूरा होने तक बर्फ पर नमूने रखें ।
  9. एक ही मात्रा में पूरक RPMI-१६४० मीडिया का उपयोग कर प्रत्येक ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब समायोजित करें ।
    नोट: वॉल्यूम का समायोजन संतुलन केंद्रापसारक के लिए महत्वपूर्ण है । इस कदम लंघन परिणाम हो सकता है में नुकसान या व्यक्तिगत चोट ।
  10. सेल निलंबन केंद्रापसारक (5 मिनट, ८०५ x जी, 4 डिग्री सेल्सियस), supernatants त्यागें, और पूरक RPMI के 2 मिलीलीटर में फिर से निलंबित-१६४० मीडिया ।
    ध्यान दें: एक सेल समग्र है कि reसस्पेंड करने के लिए मुश्किल है केंद्रापसारक निंनलिखित फार्म कर सकते हैं । एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग करें और तेजी से इसे तोड़ने के लिए आगे बढ़ने से पहले मिश्रण ।

2. प्रतिरक्षा और ट्यूमर सेलुलर भागों की जुदाई

नोट: इस चरण के लिए आवश्यक समय लगभग 1 h है ।

  1. एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब के नीचे करने के लिए घनत्व ढाल मध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें । तैयार है और प्रत्येक ट्यूमर के लिए पर्याप्त ट्यूबों लेबल ।
  2. परत दो परतों के मिश्रण को रोकने के लिए ट्यूब के पक्ष धीरे नीचे pipetting द्वारा घनत्व ढाल माध्यम के शीर्ष पर ट्यूमर सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर ।
  3. ध्यान से केंद्रापसारक में स्तरित ट्यूबों जगह और 20 मिनट के लिए स्पिन ८०५ x g, 20 ° c, कोई ब्रेक के साथ ।
    नोट: यह उचित संतुलन सत्यापित करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है और यह सुनिश्चित करें कि कोई ब्रेक केंद्रापसारक के दौरान प्रयोग किया जाता है । इस प्रक्रिया के किसी भी व्यवधान परत मिश्रण में परिणाम और पूर्ण नमूना वसूली मुश्किल हो जाएगा ।
  4. ध्यान से ट्यूमर घुसपैठ ल्युकोसैट (तिल) परत और एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करने के लिए शीर्ष मीडिया परत हस्तांतरण । छोड़ सभी शेष घनत्व ढाल मध्यम और पूरक RPMI-१६४० के 2 मिलीलीटर में ट्यूब के तल पर ट्यूमर गोली reसस्पेंड ।
    नोट: के बाद केंद्रापसारक वहां ऊपर से नीचे तक चार दिखाई परतों जो क्रमशः के अनुरूप होगा: मीडिया, TILs, घनत्व ढाल मध्यम, और ट्यूमर सेल गोली । विभिंन परतों का एक उदाहरण के लिए चित्रा 2 देखें ।
  5. दोनों तिल और अलग ट्यूबों (5 मिनट, ८०५ एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस) में ट्यूमर के नमूनों के केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
  6. २०० µ एल में तिल का नमूना और पूरक RPMI के 2 मिलीलीटर में ट्यूमर गोली-१६४० मीडिया reसस्पेंड । व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए बर्फ पर रखें ।

3. चढ़ाना और धुंधला होना

नोट: चढ़ाना के लिए आवश्यक समय 30 s/ सतह धुंधला के लिए आवश्यक समय 1 ज है; intracellular धुंधला के लिए आवश्यक समय ४० मिनट है; प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए आवश्यक समय 1-4 मिनट/

  1. तैयार है और प्रत्येक प्रतिरक्षा धुंधला पैनल और सेल गिनती के लिए एक अतिरिक्त थाली के लिए एक ९६-well U-नीचे थाली लेबल ।
    नोट: आमतौर पर, तीन प्लेटें कुल में तैयार की जाती हैं: एक लिम्फोसाइट-केंद्रित पैनल प्लेट, एक माइलॉयड-केंद्रित पैनल प्लेट, और एक सेल काउंट प्लेट ।
  2. Aliquot एकल सेल निलंबन के धुंधला पैनल प्लेटों और गिनती थाली में एक निर्धारित मात्रा में से प्रत्येक में ।
    नोट: गिनती प्लेट प्रत्येक धुंधला पैनल में जोड़ा कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है, जिससे सटीक सेल जनसंख्या मायने रखता है की अनुमति. ९६ के साथ एक प्रवाह cytometer-अच्छी तरह से प्लेट नमूना और volumetric विश्लेषण क्षमताओं प्रत्येक नमूने में µ एल प्रति कोशिकाओं की संख्या प्रदान कर सकते हैं, और इसलिए, प्रत्येक धुंधला पैनल के लिए जोड़ा कोशिकाओं की संख्या की गणना. गिनती प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात निर्धारण के बाद अगले दिन प्राप्त किया जा सकता है, FACs बफर के साथ धोने (फास्फेट 2% FBS के साथ खारा (पंजाब)), और FACs बफर का एक सेट मात्रा में reसस्पैंड ।
  3. Dulbecco के फॉस्फेट (5 मिनट, ८०५ x g, 4 डिग्री सेल्सियस) और प्रत्येक कुल्ला के बीच supernatant खारिज करने के लिए किसी भी मुक्त FBS को हटाने के द्वारा नमूने प्रति नमूना (DPBS) के २०० µ एल के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें ।
  4. एफसी ब्लॉक के ५० µ एल जोड़ें, एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग कर नमूने मिश्रण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए गर्मी ।
  5. 2x केंद्रित extracellular लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी और fixable व्यवहार्यता मिश्रण, एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग कर मिश्रण के ५० µ एल जोड़ें, और आरटी या 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए मशीन ।
    नोट: एंटीबॉडी के लिए सटीक धुंधला करने की स्थिति निर्माता के निर्देशों पर निर्भर करती है । सभी धुंधला कमजोर पड़ने DPBS में होना चाहिए, कोई जोड़ा FBS के साथ fixable व्यवहार्यता डाई के संतृप्ति को रोकने के लिए । कृपया इस पांडुलिपि में प्रयुक्त दाग पैनल के इष्टतम कमजोर पड़ने के लिए सामग्री/उपकरण की तालिका देखें । एंटीबॉडी और fixable व्यवहार्यता धुंधला समाधान एक 2x एकाग्रता पर तैयार करने के लिए कुल धुंधला मात्रा के १०० µ एल में एक अंतिम 1x धुंधला एकाग्रता प्रदान जब एफसी ब्लॉक में जोड़ा है ।
  6. FACs बफर के साथ दो बार नमूनों को धोने (5 मिनट, ८०५ x g, 4 ° c) और प्रत्येक कुल्ला के बीच supernatants त्यागना ।
  7. 1x निर्धारण/permeabilization समाधान के २०० µ l में reसस्पैंड और प्रकाश से सुरक्षित 4 ° c पर रात भर मशीन ।
    नोट: प्रयोग इस बिंदु पर रातोंरात रोका जा सकता है: प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने रखें.
  8. अगले दिन, प्लेटें (5 मिनट, ८०५ x g, 4 डिग्री सेल्सियस) और supernatant को त्यागें ।
  9. 1x permeabilization बफर के २०० µ एल के साथ एक बार कुल्ला, केंद्रापसारक (5 मिनट, ८०५ x जी, 4 डिग्री सेल्सियस), और supernatant त्यागें ।
  10. जोड़ें १०० µ 1x केंद्रित intracellular एंटीबॉडी धुंधला 1x permeabilization बफर में तैयार पैनल और आरटी या 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए मशीन (यह निर्माता से दाग सिफारिशों पर निर्भर करता है) ।
  11. 1x permeabilization बफर के साथ एक बार कुल्ला (5 मिनट, ८०५ एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस), supernatant त्यागें, और FACs बफर के साथ एक दूसरी बार कुल्ला (2% FBS के साथ पंजाब) ।
  12. FACs बफर (2% FBS के साथ पंजाब) के ३०० µ एल में नमूने reसस्पेंड, नमूने cytometry ट्यूबों प्रवाह करने के लिए स्थानांतरण, और प्रवाह cytometry विश्लेषण करते हैं ।

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Representative Results

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हमारे परिणाम गैर प्रतिरक्षा ट्यूमर घटकों से तिल जुदाई का महत्वपूर्ण लाभ प्रदर्शन, के रूप में प्रोटोकॉल में बताया । इसके अतिरिक्त, वर्णित विधि का उपयोग हम स्थापित ठोस ट्यूमर के महत्वपूर्ण immunologic विविधता प्रदर्शन करते हैं ।

कई ट्यूमर पृथक्करण तकनीक के साथ एक महत्वपूर्ण समस्या नमूना व्यवहार्यता का नुकसान है, सबसे अधिक बार कठोर पाचन शर्तों का एक परिणाम के रूप में (यानी, ऊंचा तापमान, अपर्याप्त पोषक तत्वों की आपूर्ति, आदि) । वर्णित पाचन विधि का उपयोग, के साथ या बिना घनत्व ढाल मध्यम संवर्धन, लगभग प्रदान करता है ७०-९०% कुल सेलुलर व्यवहार्यता के रूप में प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन (चित्रा 1) । इसी तरह viabilities तिल समृद्ध और ट्यूमर समृद्ध भागों में मनाया गया, सुझाव है कि इस विधि न्यूनतम समग्र विषाक्तता का कारण बनता है (चित्रा 1, चित्रा 2सी). इसके अलावा, घनत्व ढाल मध्यम संवर्धन एक से अधिक 2-CD45 सकारात्मक कुल व्यवहार्य कोशिकाओं के बीच तिल अंश में वृद्धि गुना पदोंनत गैर-समृद्ध ट्यूमर डाइजेस्ट की तुलना में विश्लेषण (चित्रा 1बी, सी) । इसके अलावा, संवर्धन के लिए कई प्रतिरक्षा सेल सबसेट सामांयतः माइलॉयड-व्युत्पन्न दमन कोशिकाओं (MDSCs), वृक्ष कोशिकाओं (dc), मैक्रोफेज, सीडी 8 टी कोशिकाओं, और CD4 टी कोशिकाओं सहित प्रतिरक्षा microenvironment अध्ययन, में मूल्यांकन सेट बढ़ाने पाया गया था ( चित्रा 1डी, ई) । यह पता चलता है कि घनत्व ढाल मध्यम संवर्धन वैश्विक immunocyte संवर्धनों को बढ़ावा देता है और विशिष्ट लिम्फोसाइट या माइलॉयड आबादी को अलग नहीं करता है (देखें पूरक आंकड़ा 1a, cytometry गेटिंग के प्रवाह की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया विधि विशिष्ट कोशिका आबादी) । यह हालांकि टिप्पण लायक है, कि कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घनत्व ढाल जुदाई मीडिया एरिथ्रोसाइट्स और granulocytes का एक महत्वपूर्ण अंश जुदाई चरण के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देते हैं । इस प्रकार, अगर इन आबादी ब्याज की हैं, आगे प्रोटोकॉल अनुकूलन आवश्यक हो सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : ट्यूमर प्रतिरक्षा घुसपैठ के कोमल और प्रभावी संवर्धन । स्थापित मी्र ट्यूमर उत्पाद और वर्णित विधि का उपयोग कर पचा रहे थे । पाचन के बाद, एकल सेल निलंबन विभाजित किया गया है कि इस तरह के आधे से गुजर गया घनत्व ढाल मध्यम संवर्धन और दूसरे आधे सीधे दाग थे । () घनत्व ढाल मध्यम संवर्धन के साथ या बिना ट्यूमर पाचक के लिए सेलुलर व्यवहार्यता के संचई प्रवाह cytometry आकलन । () प्रतिनिधि प्रवाह cytometry गेटिंग भूखंडों के साथ और घनत्व ढाल मध्यम संवर्धन के बिना एक एकल ट्यूमर पाचन के CD45 सकारात्मक प्रतिरक्षा कोशिका संवर्धन दिखा । () के साथ या घनत्व ढाल मध्यम संवर्धन के बिना ट्यूमर पाचक से कुल व्यवहार्य कोशिकाओं के बीच संचयी प्रवाह cytometry CD45 सकारात्मक कोशिका प्रतिशत. () विभिन्न माइलॉयड और लिम्फोसाइट प्रतिरक्षा आबादी के संवर्धन अनुपात । ट्यूमर सीधे दाग जा रहा है या घनत्व ढाल संवर्धन से पहले धुंधला और प्रवाह cytometry विश्लेषण के दौर से गुजर रहा है एकल सेल निलंबन में पचा लिया गया । प्रत्येक कोशिका प्रकार संवर्धन अनुपात एक दिया सेल विभाजित करके गणना की गई थी-जनसंख्या प्रतिशत (कुल व्यवहार्य कोशिकाओं के बीच का आकलन) घनत्व ढाल से समृद्ध ट्यूमर पाचन अपने गैर समृद्ध समकक्ष द्वारा । बार लाइनों औसत प्रतिनिधित्व करते है और बार के किनारों ंयूनतम और अधिकतम अनुपात का प्रतिनिधित्व करते हैं । () प्रतिरक्षा सेलुलर मार्कर अभिव्यक्ति की तालिका के लिए प्रत्येक प्रतिरक्षा कोशिका जनसंख्या की पहचान का विश्लेषण किया । सांख्यिकीय महत्व एक ख़राब t-परीक्षण या मान Whitney परीक्षण के साथ निर्धारित किया गया था । *p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001, * * * *p < 0.0001, (n = 20 ट्यूमर, सभी ग्राफ़ के लिए n = 2) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एक सबसे महत्वपूर्ण लाभ है कि इस विधि प्रदान करता है के लिए स्वतंत्र रूप से गैर प्रतिरक्षा ट्यूमर अंश प्रोफ़ाइल की क्षमता है । गोली गैर प्रतिरक्षा ट्यूमर अंश है कि घनत्व ढाल मध्यम चरण के माध्यम से गुजरता के अलगाव के बाद, जटिल ट्यूमर रूपरेखा पैनलों जो पहले fluorophore संख्या और नमूना मात्रा सीमाओं द्वारा सीमित किया गया हो सकता है किया जा सकता है । चित्रा 2 एक से अधिक ७०% व्यवहार्यता और ९९% CD45 नकारात्मक कोशिका संवर्धन के साथ ट्यूमर प्रवाह cytometry लक्षण वर्णन का एक उदाहरण से पता चलता है । CD45 नकारात्मक अंश तो ऐसे समग्र ट्यूमर व्यवहार्यता या apoptosis (यानी, caspase 3, annexin वी, आदि), प्रसार क्षमता (यानी, Ki67), और विभिंन की अभिव्यक्ति के रूप में कई ट्यूमर सुविधाओं के लिए फाइल किया जा सकता है immunosuppressive मार्करों (यानी, क्रमादेशित मौत-ligand 1 (पीडी-L1) या पीडी-L2). यह हालांकि ध्यान दिया जाना चाहिए, कि CD45 नकारात्मक अंश दोनों ट्यूमर कोशिकाओं के साथ ही अन्य stromal और ट्यूमर microenvironment के संवहनी तत्वों में शामिल हैं. इस प्रकार, यदि प्रत्यक्ष ट्यूमर सेल लक्षण वर्णन की आवश्यकता है, एक ट्यूमर सेल विशिष्ट मार्कर (यानी, cytokeratin, विशिष्ट ट्यूमर-जुड़े प्रतिजन, आदि) का इस्तेमाल किया जा करने की आवश्यकता होगी । इसी तरह, अंय ट्यूमर stromal तत्वों को आसानी से पहचाना जा सकता है और एक सेल प्रकार विशिष्ट मार्कर जैसे ट्यूमर संवहनी endothelial कोशिकाओं (CD31) और कैंसर एसोसिएटेड fibroblasts (α-चिकनी मांसपेशी actin) के साथ लेबल के बाद विशेषता । फिर भी, व्यवहार्यता और CD45 के स्तर पर नकारात्मक कोशिका संवर्धन दोहराया नमूनों भर में अत्यधिक सुसंगत है, गैर प्रतिरक्षा ट्यूमर घटक संवर्धन के लिए घनत्व ढाल जुदाई तकनीक की मजबूती का संकेत (चित्रा 2बी, सी ).

Figure 2
चित्रा 2 : संवर्धन और गैर प्रतिरक्षा ट्यूमर घटक सुविधाओं की रूपरेखा । (एक) दिखाई मीडिया परत (गुलाबी), तिल परत (पतली संदिग्ध सफेद), घनत्व ढाल मध्यम परत (स्पष्ट), और ट्यूब के तल पर ट्यूमर गोली के साथ घनत्व ढाल मध्यम संवर्धन के बाद एक नमूना के प्रतिनिधि छवि । () प्रतिनिधि प्रवाह cytometry गेटिंग रणनीति गैर प्रतिरक्षा ट्यूमर घटक की रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया, सेल व्यवहार्यता तितर बितर भूखंड (ऊपर) के साथ, CD45 नकारात्मक कोशिका संवर्धन तितर बितर साजिश (नीचे बाएं), और ब्याज की तीन स्वतंत्र मार्करों हिस्टोग्राम भूखंडों के माध्यम से अभिव्यक्ति (पीडी-L1 शीर्ष, पीडी-L2 मध्य, और Ki67 नीचे). FMO हिस्टोग्राम एक नमूना अंय सभी पैनल रंग के साथ दाग का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन ब्याज की मार्कर कमी । () सेलुलर व्यवहार्यता के संचई प्रवाह cytometry मूल्यांकन और () ट्यूमर गोली अंश निंनलिखित घनत्व ढाल मध्यम संवर्धन (एन = 7-8 ट्यूमर) की कुल व्यवहार्य कोशिकाओं के बीच नकारात्मक सेल प्रतिशत CD45 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

ठोस ट्यूमर के आनुवंशिक विविधता की विशेषता के लिए महत्वपूर्ण प्रयासों के बावजूद, थोड़ा काम ठोस ट्यूमर में immunologic उपसमुच्चय के स्थानिक विविधता विस्तृत है । हम इस प्रकार कैसे माइलॉयड और लिम्फोसाइट immunologic उपसेट काफी एक ठोस ट्यूमर भर में विविध निर्धारित करने के उद्देश्य से । इस प्रकार, एक की स्थापना की मी्र ट्यूमर विशेष देखभाल के साथ चार बराबर भागों में विभाजित किया गया था प्रत्येक अनुभाग सुनिश्चित करने के लिए लगभग समान अंतर-ट्यूमर क्षेत्रों, साथ ही साथ समान अधययन और पेरिटोनियल का सामना करना पड़ भागों (चित्रा 3) । प्रत्येक ट्यूमर टुकड़ा अलग से पचा गया था, और फिर घनत्व ढाल माध्यम से समृद्ध और एक माइलॉयड और लिम्फोसाइट पैनल के बीच विभाजित । यह आमतौर पर मूल्यांकन immunocyte आबादी की संख्या: टी कोशिकाओं, CD4 + टी कोशिकाओं, सीडी 8 + टी कोशिकाओं, मैक्रोफेज, dc, MDSCs सहित विभिंन सुविधाओं के ठहराव की अनुमति दी ( अनुपूरक आंकड़ा 1a देखें, प्रवाह cytometry गेटिंग रणनीति के लिए बी) । एक एकल ट्यूमर के भीतर, विभिन्न ट्यूमर विभाजन के बीच महत्वपूर्ण कोशिका परिवर्तनशीलता नोट किया गया था (चित्रा 3बी). उदाहरण के लिए, DC और T कक्ष कुल गणना दोनों के रूप में अधिक से अधिक के रूप में 4 से 5-गुना सन्निकट ट्यूमर भागों के बीच भिन्न करने के लिए पाए गए थे । ये कठोर परिवर्तन भी जब कुल व्यवहार्य कोशिकाओं का एक प्रतिशत (अनुपूरक आंकड़ा 2a) के रूप में सेल आबादी का विश्लेषण और दो अंय स्वतंत्र ट्यूमर में समान स्तर पर मनाया गया (अनुपूरक आंकड़ा बी सी, सी) उल्लेख किया गया । इन आंकड़ों को अलग करने और पूरे ट्यूमर का विश्लेषण जब प्रतिरक्षा microenvironment विश्लेषण, जो counterintuitive लग सकता है प्रदर्शन के महत्व को प्रदर्शित अगर वर्तमान प्रोटोकॉल ट्यूमर विभाजन को स्वतंत्र द्वारा पूरक विश्लेषण की अनुमति शामिल है तरीकों (यानी, प्रोटोकॉल, आरएनए ठहराव, आदि) । इसके अलावा, इन डेटा ट्यूमर बायोप्सी के immunologic विश्लेषण में विसंगतियों की व्याख्या कर सकते हैं, क्षेत्रीय intratumoral immunologic विविधता के रूप में काफी बायोप्सी परिणाम तिरछा कर सकता है ।

Figure 3
चित्रा 3 : स्थापित ट्यूमर प्रतिरक्षा विविधता का आकलन. (एक) सर्जिकल लकीर के बाद एक स्थापित मी्र ट्यूमर के प्रतिनिधि छवि (बाएं) और 4 आसंन भागों (सही) में बराबर विभाजन के बाद । स्केल बार 1 सेमी, प्रत्येक छवि पर काले रंग में दिखाया गया है । () विभिन्न माइलॉयड और लिम्फोसाइट सेल के 4 आसंन ट्यूमर भागों में से प्रत्येक के बीच गिनती के गुना परिवर्तन; प्रत्येक ट्यूमर खंड एक ही पाचन, घनत्व ढाल मध्यम संवर्धन प्रक्रिया, धुंधला, और विश्लेषण से गुजरा । प्रत्येक ट्यूमर हिस्सा एक सेल गिनती गुना परिवर्तन के रूप में दिखाया गया है, के रूप में एक दिए गए सेल जनसंख्या के लिए सबसे कम विश्लेषित सेल गिनती के साथ ट्यूमर भाग द्वारा अपने सेल गिनती विभाजित द्वारा निर्धारित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplemental Figure 1
पूरक चित्रा 1: प्रतिनिधि प्रवाह cytometry गेटिंग रणनीति ट्यूमर प्रतिरक्षा घटक की रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया । () लिम्फोसाइट प्रतिरक्षा रूपरेखा के लिए प्रयुक्त संबंधित तितर बितर भूखंडों के साथ गेटिंग कार्यनीति । () ट्यूमर माइलॉयड प्रतिरक्षा profile के लिए इस्तेमाल संबंधित तितर बितर भूखंडों के साथ गेटिंग रणनीति । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplemental Figure 2
पूरक चित्रा 2: स्थापित ट्यूमर विविधता के अतिरिक्त आकलन. () कुल व्यवहार्य कोशिकाओं के बीच सेलुलर प्रतिशत 4 समान ट्यूमर 3 चित्रामें दिखाया भागों से बदल गुना । () और () दो अतिरिक्त स्थापित मी्र ट्यूमर 4 आसंन भागों में विभाजित है और ट्यूमर प्रतिरक्षा विविधता के लिए विश्लेषण कर रहे हैं । सेल गिनती गुना परिवर्तन (बाएं) और कुल व्यवहार्य कोशिकाओं के बीच सेल प्रतिशत परिवर्तन (सही) प्रत्येक माइलॉयड और लिम्फोसाइट सेल जनसंख्या के लिए 4 आसंन ट्यूमर भागों में से प्रत्येक की परिवर्तनशीलता दिखा विश्लेषण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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समय विविध और जटिल सेलुलर घटकों और अणुओं से बना है । हाल ही में सबूत पता चलता है कि इस वातावरण का सही लक्षण वर्णन उपचार सफलता या विफलता की एक बेहतर समझ प्रदान कर सकते हैं, और भी मदद कर सकते है चिकित्सीय प्रतिरोध के तंत्र की पहचान । उदाहरण के लिए, विभिन्न immunosuppressive कोशिकाओं के intratumoral स्तर में वृद्धि (यानी, MDSCs, टी नियामक कोशिकाओं, आदि) प्रभाव प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और निराकृत immunotherapeutic प्रभाव को कम कर सकते हैं. दूसरी ओर, प्रभाव प्रतिरक्षा आबादी की बढ़ती intratumoral उपस्थिति (जैसे, ट्यूमर विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं, टी सहायक कोशिकाओं) उपचार की सफलता के शक्तिशाली कारक हो सकता है । एक और लक्षण वर्णन है कि सही ट्यूमर immunologic स्थिति का प्रतिनिधित्व करने के लिए जारी है खुद को ट्यूमर कोशिकाओं के phenotypic विशेषताएं है । यह विभिंन immunosuppressive लाइगैंडों, एंजाइमों, या downregulating प्रभाव प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं (यानी, पीडी-L1, पीडी-L2, indolamine 2, 3 dioxygenase, नाइट्रिक ऑक्साइड, आदि) के उद्देश्य से अणुओं की अभिव्यक्ति भी शामिल है । एक साथ ले लिया, इस ठोस ट्यूमर के दोनों प्रतिरक्षा और ट्यूमर सेलुलर सुविधाओं के सटीक और व्यापक लक्षण वर्णन के लिए की जरूरत को दर्शाता है ।

तकनीक का वर्णन हम इस के साथ साथ अलग और संवर्धन की अनुमति देता है दोनों प्रतिरक्षा और ट्यूमर कोशिका घटकों के ठोस murine चमड़े के नीचे ट्यूमर । फिर, स्वतंत्र प्रवाह cytometric रूपरेखा प्रदर्शन किया जा सकता है ताकि पूर्णकालिक और समय के साथ ट्यूमर कोशिकाओं की बातचीत की सराहना की जा सकती है । संवर्धन के बाद, व्यापक प्रतिरक्षा प्रवाह cytometry पैनलों कुंजी माइलॉयड और लसीकावत् सेलुलर घटकों के लक्षण वर्णन, साथ ही उनके phenotypic स्थिति का वर्णन सुविधाओं की एक किस्म की अनुमति के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इसी तरह, व्यापक ट्यूमर सेल केंद्रित पैनल स्वतंत्र रूप से इस्तेमाल किया जा सकता ट्यूमर सेल सुविधाओं के रूप में अच्छी तरह से व्यापक लक्षण वर्णन प्रदान करते हैं । इस तकनीक के सापेक्ष सादगी murine ट्यूमर की बड़ी संख्या के एक साथ विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, जो murine ट्यूमर मॉडल की जीवविज्ञान परिवर्तनशीलता के बावजूद रुझान देख के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, ट्यूमर प्रतिरक्षा संवर्धन दुर्लभ immunologic सबसेट की बेहतर पहचान प्रदान करता है (यानी, ट्यूमर विशिष्ट साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं), जो अक्सर काफी अंय गैर प्रतिरक्षा सेल घटकों की तुलना में ट्यूमर के भीतर प्रतिनिधित्व कर रहे है . इस तकनीक का अनुकूलन इन पृथक उपसमुच्चय जो संवर्धन की आवश्यकता है, जैसे coculture पूर्व vivo परख, mRNA रूपरेखा, या दत्तक सेल स्थानांतरण अध्ययन पर अतिरिक्त बहाव विश्लेषण की अनुमति दे सकते हैं ।

एक चमड़े के नीचे murine ट्यूमर मॉडल में इस तकनीक का उपयोग करना, हम वैश्विक और स्वतंत्र प्रतिरक्षा सबसेट के महत्वपूर्ण संवर्धन का प्रदर्शन । हम भी गैर प्रतिरक्षा ट्यूमर रूपरेखा जो एक ही ट्यूमर के नमूनों से प्राप्त किया जा सकता है प्रदर्शन । अंत में, हम पूरे ट्यूमर immunologic रूपरेखा के महत्व को दिखाने के लिए, के रूप में हम एक ट्यूमर के आसंन वर्गों में महत्वपूर्ण immunologic विविधता मनाया । आदर्श रूप में, collagenase और DNase आधारित पाचन और ट्यूमर प्रतिरक्षा और गैर प्रतिरक्षा भागों के ढाल आधारित जुदाई के इस तकनीक murine ट्यूमर मॉडल के बहुमत के लिए लागू किया जा सकता है, दोनों orthotopic और चमड़े के नीचे । हम यह भी देखा है कि छोटे गैर स्थापित ट्यूमर और कम कोलेजन-घने ट्यूमर मॉडल (यानी, B16 मेलेनोमा) अक्सर एक एंजाइमी पाचन कदम एकल सेल निलंबन15उत्पंन करने की आवश्यकता नहीं है; हालांकि, ढाल आधारित प्रतिरक्षा संवर्धन समान रूप से इन ट्यूमर मॉडल में अच्छी तरह से करता है, आगे अपनी बहुमुखी प्रतिभा मांय । विशिष्ट सेलुलर उपसमुच्चय11पर collagenase प्रतिजन पाचन के बारे में पूर्व चिंताओं के बावजूद, हम अभी तक मार्करों कि हम फ़ाइल है की किसी के लिए धुंधला गुणवत्ता का एक उल्लेखनीय नुकसान का पालन करें । फिर भी, इन पाचन स्थितियों के लिए प्रतिजन संवेदनशीलता इस तकनीक के व्यापक गोद लेने से पहले उचित गैर पचा नियंत्रण नमूनों का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाना चाहिए ।

अंत में, हमारी तकनीक सटीक, व्यापक, और ट्यूमर प्रतिरक्षा और murine ठोस ट्यूमर के गैर प्रतिरक्षा घटकों के उच्च प्रवाह लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है । इन उपसेट के स्वतंत्र रूपरेखा प्रदर्शन करके, शोधकर्ताओं मोटे तौर पर समय की विशेषताएं और ठोस ट्यूमर नैदानिक चिकित्सा में बेहतर यंत्रवत अंतर्दृष्टि हासिल कर सकते हैं । इस विधि आसानी से लिम्फोसाइट और माइलॉयड immunocyte जनसंख्या मायने रखता है और phenotypes के माध्यम से प्रवाह cytometry, या अंय बहाव परख कि सबसेट संवर्धन की आवश्यकता के उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए murine ट्यूमर मॉडलों के विशाल बहुमत के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

JMN राष्ट्रीय जनरल मेडिकल साइंसेज (T32GM088129) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड Craniofacial रिसर्च (F31DE026682) दोनों स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस परियोजना को भी NIH (P30 AI036211, P30 CA125123, और S10 RR024574) और योएल एम Sederstrom के विशेषज्ञ सहायता से धन के साथ चिकित्सा के Baylor कॉलेज में Cytometry और सेल छँटाई कोर द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 to 12 week old male C57BL/6 mice Jackson Laboratory  N/A Mice used in our tumor studies
MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line Acquired from collaborator  N/A E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line 
70% isopropyl alcohol  EMD Milipore  PX1840
Murine surgical tool kit World Precision Instruments MOUSEKIT Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. 
24-well plate  Denville Scientific Inc. T1024 Or any 24-well flat bottom plate. 
RPMI-1640 media Sigma-Aldrich R0883
Collagenase I  EMD Milipore 234153
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation LS004189
DNase I  Sigma-Aldrich 11284932001
Low Speed Orbital Shaker BioExpress (supplier: Genemate)  S-3200-LS Or any orbital shaker. 
Thermoregulating incubator Fisher Scientific 13-255-27 Or any other thermo-regulated incubator
FBS Sigma-Aldrich F8192
EDTA AMRESCO E177
1 mL Pipette and tips Eppendorf 13-690-032 Or any other pipette and tips
40 um Cell Strainers Fisher Scientific 22363547
50 mL Centrifuge Tubes Denville Scientific Inc. C1062-P
15 mL Conical Tubes Denville Scientific Inc. C1012
10 mL Luer-Lok Syringe without needles BD 309604
Lymphoprep Density Gradient Medium STEMCELL Technologies 7811
Transfer Pipettes Denville Scientific Inc. P7212
96-well U-bottom plates Denville Scientific Inc.
DPBS Sigma Aldrich  D8573
FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set  ThermoFisher Scientific 00-5523-00 Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer
Thermoregulated Centrifuge Eppendorf  5810 R
Attune NxT Flow Cytometer ThermoFisher Scientific N/A For 96-well cell volumetric counting 
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2  ThermoFisher Scientific 553141 Fc Block
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation ThermoFisher Scientific L34962 Fixable viability stain
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 ThermoFisher Scientific 47-0451-80
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC ThermoFisher Scientific 17-5961-82
CD8-α Antibody (KT15), PE Santa Cruz Biotechnology sc-53473 
CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 ThermoFisher Scientific 15-0041-81
MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 ThermoFisher Scientific 56-5321-82
CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 ThermoFisher Scientific 15-0114-82
F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 ThermoFisher Scientific 48-4801-80
CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC ThermoFisher Scientific 17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE ThermoFisher Scientific 12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 ThermoFisher Scientific 25-5982-80
CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 ThermoFisher Scientific 46-9972-82
Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 BD Biosciences 563755

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References

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संवर्धन और ट्यूमर प्रतिरक्षा और गैर प्रतिरक्षा Microenvironments के लक्षण विस्थापन में स्थापित चमड़े के नीचे Murine ट्यूमर
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Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors. J. Vis. Exp. (136), e57685, doi:10.3791/57685 (2018).More

Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors. J. Vis. Exp. (136), e57685, doi:10.3791/57685 (2018).

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