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Cancer Research

濃縮と確立された皮下マウス腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小のキャラクタリゼーション

doi: 10.3791/57685 Published: June 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

ここで分離し、確立された皮下腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小環境のコンポーネントを豊かにする方法をについて説明します。この手法は、腫瘍免疫浸潤と非免疫腫瘍腫瘍免疫微小環境の包括的な評価を可能にすることができます独立した分析のためことができます。

Abstract

腫瘍免疫微小環境 (時間) は最近特に免疫療法のための固形腫瘍の治療反応の重要な仲介人として認識されています。免疫療法の臨床的進歩は、再現可能な方法で正確かつ完全に特徴付ける腫瘍とその関連付けられた免疫潜入の必要性を強調表示します。腫瘍の酵素消化とフローサイトメトリーによる解析により、多数の免疫細胞サブセットおよび表現型; の広範な評価しかし、分析の深さは多くの場合パネルのデザインと大きな腫瘍のサンプルを取得する必要があります興味のまれな免疫個体を観察する fluorophore 制限によって制限されます。したがって、分離・非免疫腫瘍コンポーネントから腫瘍免疫潜入を豊かに高スループットの効果的な方法を開発しました。記載されている腫瘍消化と遠心密度ベースの分離技術により、腫瘍と腫瘍の個別特性免疫潜入分数と細胞生存率を保持し、したがって、腫瘍の広範な評価を提供します免疫学的状態。このメソッドは、さらに一貫性のある全体の腫瘍免疫学的プロファイリング技術の必要性を示す固形腫瘍広範なの空間的免疫不均一を特徴付けるために使用されました。全体として、このメソッドは固体マウス皮下腫瘍の免疫学的特性に対する効果的かつ適応手法を提供します。よい腫瘍の免疫学的機能を特徴付けるためのこのツールの使用など、新しい免疫療法戦略の前臨床評価。

Introduction

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抑制時間は、最近、癌の特徴として認識されているし、開発、進行固形腫瘍癌の保護に重要な役割を果たすだけでなく、免疫療法1感受性を緩和する知られています。時間は、多数の細胞サブセットと腫瘍の免疫学的状態に重要な洞察力を提供するすべての表現型で構成されます。これらの免疫のサブセットは、一緒に自然免疫と適応免疫応答2,3の大半を構成するリンパ球や骨髄由来の細胞にさらに層化できます。がん免疫療法の分野の最近の進歩は免疫療法戦略(すなわち、免疫チェックポイント阻害剤、キメラ抗原受容体の T 細胞等)に耐久性のある癌を誘発する可能性があることを示しています。リグレッションただし、固形腫瘍の癌4,5で比較的効果が残ります。多数のグループでは、時間治療成功67、遊ぶことができる、したがって、特に中心前臨床設定の新しい免疫療法を正確に評価する必要があるいる、重要なハードルを示されている、変調または8時間を克服する機能。

通常時間を特徴付ける現在の努力はどちらか顕微鏡を利用またはフローサイトメトリー抗体の免疫細胞サブセットと9,10代の機能を識別するための戦略を分類と共に。これらの 2 つの戦略顕微鏡により細胞サブセットの空間感謝されフローサイトメトリー高スループット、携帯電話の変更のより広範な定量化一意に異なる情報を提供します。今まで 7 つのパラメーターをサポートできる、スペクトル イメージング システムの最適化多重免疫組織染色の最近の改善にもかかわらず限定パネル サイズ広範なレベル プロファイリング免疫困難は、したがってこの手法はしばしば予約詳細解析に焦点を当てた。その結果、フローサイトメトリーはプロファイリング技術最も広く使われている免疫の一つであります。時間評価技術の広範な使用、にもかかわらず処理と染色に使用される方法は非常に変数です。多くの場合プロトコル利用酵素の分離腫瘍 (すなわちコラゲナーゼ、DNase、) と単一細胞懸濁液を達成するために手動の解離メソッドの後に抗体染色と分析7。それぞれの方法の利点があるにもかかわらず多数のグループはこれらテクニック11まで誘導することができます大規模な変動を示しています。これにより、同じマウス腫瘍モデルを評価する際にも、腫瘍微小環境のプロファイリングのクロス研究比較が非常に困難になります。さらに、これらのメソッドは、腫瘍細胞を評価する限られた可能性を提供し、腫瘍免疫侵入、独立していないコンポーネント消化後両方のコンポーネントが点在するので。サンプル量は、マルチパネル染色とまれな免疫学的サブセットを特徴付けるように試みとが主要な問題の分析を制限 (すなわち、腫瘍特定の T 細胞)12。質量 cytometry など (CyTOF)、飛行時間によってフローサイトメトリー最新技術は、42 の独立したパラメーター13以上のパネル デザインをサポートいくつかのシステムと細胞サブセットの高次元の表現型解析を許可します。CyTOF 免疫プロファイリング技術の驚異的なパワー、にもかかわらず、それは費用、解析の専門知識、および機器へのアクセスのため限られています。さらに、CyTOF プロトコルの多くは、信号対雑音比の14を改善するために免疫のサブセットの浄化をお勧めします、したがって私たちの濃縮方法を使用できることを提案 CyTOF 分析データの品質を向上させるための上流。

本腫瘍微小環境消化と腫瘍免疫を組み込む方法は侵入分離解析について述べる。このメソッドの目的は、腫瘍免疫浸潤、腫瘍微小環境の広範な評価の腫瘍細胞の一部分の独立した高スループット プロファイルを許可することです。このメソッドを使用すると、さらに示す全腫瘍の分析の重要性と皮下腫瘍モデル発見された重要な免疫不.全体的にみて、このメソッドより正確かつ一貫して比較できますサンプル間腫瘍内免疫細胞サブセットの豊か、独立した腫瘍細胞と腫瘍の免疫分数のプロファイリングが可能になります。

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Protocol

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ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の薬の Baylor の大学によって承認されています。

1. 腫瘍の収穫と消化

注: 収穫に要する時間は 3 ~ 5 分/腫瘍と処理に必要な時間は ~ 1 + 2-3 min/腫瘍。

  1. 炭酸ガス吸入によるマウスを安楽死させるし、髪の汚染を防ぐために収穫前に各マウスをダウン 70% エタノールをスプレーします。マウス皮下腫瘍を削除し、腫瘍が任意の汚染組織(すなわち髪、肌、腹膜等)の無料手術。24 ウェル プレートでのウシ胎児血清 (FBS) なし基本 RPMI 1640 メディアの 1.8 mL の各腫瘍を配置します。大きな収穫の細胞を維持するために氷の寒さのプレートを維持します。
    注: 不妊が必要なすべての腫瘍の解剖必要がありますバイオ セーフティ キャビネット (すなわちハサミ、鉗子、)、生殖不能の外科ツールとして次のステップで実行します。0.5 - 1 cm 最長の直径が付いている腫瘍が最適とより大きいまたは小さい腫瘍試薬のスケーリングが必要になります。
  2. 各ウェル内の3個セット 1 mm 以下に腫瘍をカットするのにはさみを使用します。
  3. コラゲナーゼを溶解することにより消化カクテル x 10 の準備で 10 mg/mL、コラゲナーゼ IV 2,500 U/mL と DNase 私 200 U/mL 基本 RPMI 1640 メディア (FBS) なしで私。
    注: カクテルの消化日を前もって準備して格納できます-20 ° c;ただし、酵素は一度解散時間をかけて活動を失うので、長期の保管はお勧めしません。
  4. 私、コラゲナーゼ IV、DNase コラゲナーゼを含む解離カクテル × 10 の 200 μ l 添加 1 mm の3個の各ウェルに。
  5. 軌道プレート シェーカーを使用しての 60-100 rpm で軽く振りながら 37 ° C で 1 時間のダイジェスト サンプルを許可します。
    注: 酵素消化中に 37 ° C までの温度の上昇は、免疫細胞の活性化を引き起こす可能性があります。
  6. 1 時間後の各ウェルに 5 %fbs と 2 mM EDTA 添加 RPMI 1640 メディアの 1 つの mL を追加することによって反応を中和します。
  7. 50 mL の遠心管の上に座っている 40 μ m セル ストレーナーに腫瘍消化、残りの腫瘍部分をピペットします。
    注: は、ストレーナーに腫瘍消化を容易に転送する 1 mL ピペット チップの先端をカットします。
  8. こし器を通して腫瘍部分を機械的に細かく分けた 10 mL シリンジのプランジャーを使用します。定期的に 2 ml の補われた RPMI 1640 メディアのストレーナーを洗浄 (5% を含む FBS) セル ストレーナーが腫瘍のクリアされるまでを繰り返します。
    注: メディア総数の約 4-10 mL は十分に腫瘍のストレーナーを洗浄するための十分なはずです。
    注: は、細胞生存率を維持するためにすべてのサンプルのこのステップを完了するまで氷にサンプルを配置します。
  9. 補足 RPMI 1640 メディアを使用して同じボリュームに各 50 mL 遠心管を調整します。
    注: ボリュームの調整は、遠心力のバランスをとるため重要です。遠心分離機の損傷やけがこのステップをスキップ可能性があります。
  10. (5 分、805 × g、4 ° C) 細胞懸濁液を遠心分離、培養上清を破棄し、再補足 RPMI 1640 メディアの 2 mL で中断します。
    注: セルの集計は次の再懸濁しますにくい遠心分離フォームがあります。続行する前にそれを破るため急速に 5 mL の血清ピペットとミックスを使用します。

2. 免疫と腫瘍細胞分画の分離

注: この手順の所要時間は約 1 時間です。

  1. 密度勾配媒体の 3 mL を 15 mL 遠心管の下部に追加します。準備し、ラベルを各腫瘍に対する十分なチューブ。
  2. 層の 2 つの層の混合を防ぐために管の側をゆっくりとピペッティングによる密度勾配媒体上に腫瘍細胞懸濁液 2 mL。
  3. 慎重に遠心分離機で 805 x g は、20 ° C、ないブレーキで 20 分間スピン多層チューブを配置します。
    注: 適切なバランスを確認し、遠心分離中にブレーキを使用しないことを非常に重要です。このプロセスを中断する層の混合になります、サンプルの完全回復が困難になります。
  4. (ゴマ) 層と転送ピペットを使用して新しい 15 mL チューブにトップ メディア層白血球浸潤腫瘍を慎重に転送します。すべての残りの密度勾配媒体を破棄し、補われた RPMI 1640 の 2 mL でチューブの下部に腫瘍ペレットを再懸濁します。
    注: 遠心分離後がありますそれぞれに対応する下に上から 4 つの可視レイヤー: 腫瘍細胞ペレット密度勾配媒体、ティルズ メディア。図 2さまざまな層の例についてはを参照してください。
  5. 両方のティルを遠心し、腫瘍のサンプル チューブ (5 分、805 × g、4 ° C) を分離し、上澄みを廃棄します。
  6. 200 μ L のティル サンプルと補われた RPMI 1640 メディアの 2 mL で腫瘍ペレットを再懸濁します。生存率を維持するために氷の上を保ちます。

3. めっきと染色

注: めっきに必要な時間は 30 s/腫瘍;表面の汚損のための所要時間は 1 時間です。細胞内染色に要する時間は 40 分です。フローサイトメトリー解析は 1 - を必要な時間 4 分/腫瘍。

  1. 準備し、各免疫染色パネル、セルの追加プレート用ラベル 96 ウェルの U 底プレートをカウントします。
    注: 通常、3枚のプレートは、合計で用意をしています: リンパ球に焦点を当てたパネル プレート、骨髄性に焦点を当てたパネル プレート、セル数プレート。
  2. 分注染色のそれぞれに単一細胞懸濁液パネル プレートとセットのボリューム カウント板に。
    メモ: カウント板により正確なセル人口それぞれの染色パネルに追加されるセルの合計数を計算するため使用されます。96 ウェル プレート サンプリングおよび容積測定分析機能を備えたフローサイトは各サンプルの μ L あたりのセル数を提供し、したがって、各染め色のパネルに追加されるセルの数を計算できます。数板は 4 ° C、FACs バッファーで洗浄で一晩固定後次の日を得ることができる (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 %fbs)、FACs バッファーの設定ボリュームで再と。
  3. (5 min, 805 × g、4 ° C) を遠心分離し、任意の無料の FBS を削除する各リンス間清を破棄してサンプルあたりダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 200 μ L で 2 回細胞を洗ってください。
  4. Fc ブロックの 50 μ L マルチ チャンネル ピペットを使用してサンプルをミックスし、4 ° C で 20 分間インキュベートを追加します。
  5. 2 倍の 50 μ L 濃縮細胞ターゲティング抗体と修正可能な生存汚れの混合物、マルチ チャンネル ピペットを使用してミックス、RT または 4 ° C で暗闇の中で 30 分間インキュベートを追加します。
    注: 抗体の正確な染色条件は、製造元によって異なります。すべての染色希釈は、修正可能性色素の飽和を防ぐためにない追加の FBS の DPBS でなければなりません。この原稿で使用されている染色パネルの最適な希釈液のためのテーブルの材料/機器を参照してください。Fc ブロックに追加される染色容量 100 μ L の濃度を染色 × 最終的な 1 を提供するために 2 倍の濃度では、抗体と修正可能性染色液を用意しています。
  6. (5 分、805 × g、4 ° C) を遠心分離し、各リンス間培養上清を破棄して FACs バッファーで 2 回サンプルを洗います。
  7. 1 x 固定/透過液 200 μ L で再懸濁します、光から保護 4 ° C で一晩インキュベートします。
    注: 実験を一時停止できる一晩この時点: 光から保護 4 ° c のサンプルを保ちます。
  8. 次の日は (5 分、805 × g、4 ° C) プレートを遠心し、上澄みを廃棄します。
  9. 濯ぎ 1 回 x 透過バッファー、遠心分離機 (5 分、805 × g、4 ° C)、1 の 200 μ L で、上澄みを廃棄します。
  10. 1 x 透過バッファーの準備 1 x 集中細胞抗体染色パネルの 100 μ L を追加し、RT または 4 ° C (製造元から染色の推奨によって異なります) で暗闇の中で 30 分間インキュベートします。
  11. 1 x 透過とバッファー (5 分、805 × g、4 ° C) は、上澄みを廃棄したらすすぎとリンス FACs バッファーと 2 回目 (PBS 2 %fbs)。
  12. FACs バッファーの 300 μ L のサンプルを再懸濁します (PBS 2 %fbs)、流れの cytometry チューブにサンプルを転送およびフロー フローサイトメトリー分析を実施します。

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Representative Results

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プロトコルで説明したように、非免疫腫瘍コンポーネントから分離までの大きな利点を示した。また、記載されているメソッドを使用して確立された固形腫瘍の重要な免疫学的不均一性を示す.

多くの腫瘍解離技術の大きな問題として、過酷な消化条件 (すなわち、上昇温度、不十分な栄養供給など) の結果として最もよくのサンプルの実行可能性の損失。説明消化法の使用またはなければ密度勾配中の濃縮を提供します約 70-90% 総細胞生存フローサイトメトリー (図 1A) により評価しました。似たような目は、こまで観察された濃縮し、腫瘍を豊かに分数、このメソッドが (図 1図 2C) 最小限の全体的な毒性を引き起こすことを示唆しています。さらに、密度勾配中濃縮推進大きい、CD45 の 2 倍の増加よりも生菌数の分数まで肯定的な分析非濃縮に比べて腫瘍消化力 (図 1B、C)。さらに、濃縮が多数免疫細胞サブセット免疫微小環境の研究、骨髄由来抑制細胞 (MDSCs)、樹状細胞 (Dc)、大食細胞、cd8 陽性 T 細胞、cd4 陽性 T 細胞 (などの一般的評価を高めるために発見されました。図 1D, E)。これは密度勾配中濃縮グローバル免疫細胞濃縮を促進し、(識別するために使用されるメソッドをゲーティング フローサイトメトリー用補足図 1 a, Bを参照してください特定のリンパ球や骨髄性、分離されていないことを示唆しています。特定のセルの人口)。しかし、多くの市販の密度勾配分離マスメディアが赤血球と顆粒球分離の段階を通過するのかなりの部分を許可する注目に値するです。したがって、これらの集団の利益の場合は、さらにプロトコル最適化必要があります。

Figure 1
図 1: 腫瘍免疫潜入の穏やかな、効果的な充実。確立されたミーア ・腫瘍摘出し、記述されているメソッドを使用してを消化します。次の消化、その半分を受けた密度勾配中の濃縮やその他の半分は直接染色した、単一細胞懸濁液は分けられました。(A) 流動フローサイトメトリー評価腫瘍消化力密度勾配中濃縮の有無、細胞の生存率。(B) 代表的な流れ cytometry 単一腫瘍消化と密度勾配中濃縮なしの CD45 陽性の免疫細胞濃縮を示すプロットをゲートします。(C) 累積的な流れ cytometry CD45 陽性細胞腫瘍消化力密度勾配中濃縮の有無から生菌数の割合です。(D) 濃縮比様々 な骨髄性とリンパ球免疫集団。腫瘍は単一細胞懸濁液に直接染色されてまたは中密度勾配濃縮染色と流れの cytometry 分析の前にする前に消化されました。各セル型の濃縮率は、非濃縮の対応による密度グラデーション豊かな腫瘍消化から (生菌数評価) の間で指定されたセル人口の割合で割って計算しました。縦線中央値を表し、バーのエッジを表す最小と最大値の比率。(E) 各免疫細胞集団の分析を識別するために使用される免疫細胞マーカー式のテーブルです。統計的有意性は、対になっていない t 検定またはマン ホイットニー テストで決定されました。p < 0.05 * *p < 0.01 * * *p < 0.001、* * *p < 0.0001、(n = 20 腫瘍、N = すべてのグラフの 2)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

このメソッドを提供する最も重要な利点の 1 つは、非免疫腫瘍の一部を個別にプロファイルする能力です。密度勾配中のフェーズを通過する小球形にされた非免疫腫瘍画分の分離後、複雑な腫瘍パネルをプロファイリング実行できる以前 fluorophore の数によって制限されている場合がありますサンプル数の制限。図 2A生存率 70% 以上、99 %cd45 陰性の細胞濃縮腫瘍流れフローサイトメトリー評価の例を示しています。CD45 陰性率は生存率腫瘍全体またはアポトーシス (すなわちカスパーゼ 3、アネキシンV 等)、拡散容量 (すなわちキ67)、および様々 な式など多数の腫瘍機能、プロファイルできます。免疫マーカー (すなわち、死リガンド 1 (PD L1) をプログラムまたは PD L2)。腫瘍微小環境の他の間質と血管の要素と同様、両方の腫瘍細胞に CD45 陰性分数が含まれている必要がありますただし、明記。したがって、直接腫瘍細胞の特性解析が必要な場合、腫瘍細胞特異的マーカーでなければならない(すなわちサイトケラチン、腫瘍関連抗原等)に使用されます。同様に、他の腫瘍間質要素簡単に識別でき腫瘍血管内皮細胞 (CD31) などがん細胞型特異的マーカーに関連付けられている線維芽細胞 (α-平滑筋アクチン) にラベリングした後特徴付けられます。それにもかかわらず、生存率と CD45 陰性の細胞濃縮レベルは非免疫腫瘍成分濃縮 (図 2B、C の密度勾配分離法のロバスト性を示す繰り返しのサンプルの間で非常に一貫しました。).

Figure 2
図 2: 濃縮と非免疫腫瘍コンポーネント機能のプロファイリングします。(A) 次の表示メディア層 (ピンク), 密度勾配中濃縮層 (薄い濁った白)、密度勾配媒体層 (クリア)、管の下部に腫瘍ペレットまでサンプルの代表的なイメージ。(B) 代表的なフローサイトメトリー非免疫腫瘍成分、細胞生存率散布 (top)、CD45 陰性の細胞濃縮散布 (左下) と関心の 3 つの独立したマーカをプロファイリングに使用される戦略をゲートヒストグラム ・ プロット (PD L1、L2 PD 中間上下キ67) 経由で表現。FMO のヒストグラムは、他のすべてのパネルの色に染まったが、関心のマーカーを欠けているサンプルを表します。(C) 細胞生存率および腫瘍ペレットの割合が次の密度勾配中濃縮の生菌数の中で (D) CD45 負のセル パーセンテージの累積フロー フローサイトメトリー評価 (n = 7-8 腫瘍)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

固形腫瘍の遺伝学的不均一性を特徴付ける重要な努力にもかかわらず少し仕事は固体腫瘍の免疫学的サブセットの空間的不均一性を詳しく説明します。したがって決定目指してどの骨髄性とリンパ球免疫サブセットの単一の固体腫瘍中劇的に変わった。従って、確立されたミーア ・腫瘍は等しい皮膚からと腹膜に直接接続部分 (図 3A) と同様、等しい内腫瘍領域、各セクションが約含まれていることを確認する特別なケアと 4 つの等しい部分に分かれていた。各腫瘍部分は別途、消化密度勾配媒体によって濃縮し、骨髄性とリンパ球パネルの間で分割します。これ許可一般的評価免疫細胞集団の数を含むさまざまな機能の定量化: T 細胞、cd 4 + T 細胞、cd 8 + T 細胞、マクロファージ、Dc、MDSCs (戦略をゲーティング フローサイトメトリー用補足図 1 a, Bを参照)。単一の腫瘍内で異なる腫瘍パーティション間重要な細胞の変動は指摘した (図 3b) だったたとえば、DC と T 細胞の両方の総細胞数が 5 倍に限り 4 によって異なります判明した隣接する腫瘍部分の中。これらの急激な変化は生菌数 (補足図 2 a) の割合として分析細胞群のときも認められたし、2 つの他の独立した腫瘍 (補足図 2 b, C) の同じようなレベルで認められました。これらのデータは分離し、独立した相補的な分析を許可する腫瘍を分割現在のプロトコルが含まれている場合は直感的に思えるかもしれない免疫の微小環境分析を実行するときに全体の腫瘍を分析の重要性を示す方法 (すなわち、組織学、RNA 定量、)。さらに、これらのデータは地域腫瘍免疫学的不均一性が大幅に生検結果を傾斜、腫瘍生検の免疫学的解析の不一致を説明するかもしれない。

Figure 3
図 3: 確立された腫瘍免疫不均一性評価します。(A) 隣接する 4 に均等に分割パーツ (右) 前後の切除 (左) 確立されたミーア ・腫瘍の代表的な画像。スケール バーは、各画像を黒で示されている 1 の cm です。(B) 倍変化様々 な骨髄性とリンパ球細胞数; 4 つの隣接する腫瘍部分のそれぞれの間各腫瘍のセクションは、同じ消化、密度勾配中濃縮、染色と分析を施行した.各腫瘍の一部は、特定のセル人口の低い分析細胞数と腫瘍の部分でその細胞数を割ることによって決定されるセル数のフォールドの変更として表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Supplemental Figure 1
補足図 1: 腫瘍免疫コンポーネント プロファイルに使用戦略をゲート代表フローサイトメトリー 。(A) リンパ球免疫プロファイリング用それぞれ散布と戦略をゲートします。(B) 腫瘍骨髄性免疫プロファイリング用それぞれ散布と戦略をゲートします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Supplemental Figure 2
補足図 2: 確立された腫瘍の不均一性の評価を追加。4 等しい腫瘍から生菌数のフォールドの変更の間で (A) 細胞の割合は図 3に示すように部品。(B) および (C) 2 つの確立されたミーア ・腫瘍追加 4 つの隣接する部分に分類して腫瘍免疫不均一性を分析します。セル数フォールドの変更 (左) と生菌数の間でセル パーセンテージごと変更 (右) を折る骨髄性リンパ球細胞集団を行い, 各 4 つの隣接する腫瘍部分の変動を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

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時間は、多様で複雑な細胞成分と分子で構成されます。最近の証拠は、この環境の正確な特性評価が治療の成功または障害のよりよい理解を提供できる治療抵抗性のメカニズムを特定するを助けてもいいこと示唆しています。たとえば、エフェクター免疫反応を軽減することができ、免疫療法の効果を破棄する腫瘍様々 な免疫細胞 (すなわちMDSCs、T 細胞など) のレベルを上げます。一方、エフェクター免疫個体群 (など腫瘍特異 cd8 T 細胞、ナチュラル キラー細胞、ヘルパー T 細胞) の腫瘍存在感を増しては治療成功の強力な予測をすることができます。腫瘍の免疫状態を正確に表す続けて別の特性は彼ら自身腫瘍細胞の表現型の特徴です。これは様々 な免疫抑制配位子、酵素、または downregulating エフェクター免疫応答を目指した分子の式が含まれます (すなわち、 PD L1、PD L2 indolamine 2, 3-ジオキシゲナーゼ、窒素酸化物、)。一緒に取られて、これは固体腫瘍の免疫と腫瘍細胞機能の正確かつ広範な評価の必要性を示しています。

ここに記述するテクニックは、マウス皮下腫瘍細胞成分分離, 濃縮免疫と腫瘍の両方をできます。その後、独立したフロー フローサイトメトリーによるプロファイリングをフルタイム、時間と腫瘍細胞の相互作用を理解できるようにで実行できます。次の濃縮、さまざまな自分の表現型のステータスを記述する機能と同様、主要な骨髄性とリンパ性細胞成分、特性を許可する広範な免疫流れ cytometry パネルを最適化できます。同様に、広範な腫瘍細胞集中パネル使用できますない独立して同様の腫瘍細胞機能の広範な評価を提供します。この手法の相対的なシンプルさは、マウス腫瘍の多数の同時分析にもかかわらず、マウス腫瘍モデルの生物学的変動の動向を観察のために重大であります。さらに、腫瘍免疫強化、その他の非免疫細胞成分と比較して腫瘍内でしばしば大幅過小評価されまれな免疫学的サブセット (すなわち特定の腫瘍細胞傷害性 T 細胞) のことをより的確.この手法の最適化は、これらの mRNA プロファイリング、培養前のヴィヴォアッセイなどの濃縮を必要とする分離のサブセットまたは養子のセル転送研究下流解析の追加を許可できます。

皮下腫瘍モデルでこの手法を使用して、グローバルおよび独立した免疫のサブセットの大幅な充実を紹介します。また同じ腫瘍のサンプルから、実現できますプロファイリング非免疫腫瘍を示します。最後に、腫瘍の隣接したセクションで重要な免疫学的不均質を見ました、全腫瘍の免疫学的プロファイルの重要性を示します。理想的には、コラゲナーゼの消化力の DNase ベースこの手法と腫瘍免疫と免疫のない分数のグラデーション ベースの分離のマウス腫瘍モデルでは、両方の同所性同種の大半に適用される可能性および皮下。我々 もその小さな非確立された腫瘍と少ないコラーゲン密度の高い腫瘍モデル (すなわち、 B16 メラノーマ) を観察している多くの場合単一細胞懸濁液15; を生成する酵素消化手順を必要としません。ただし、免疫強化のグラデーション ベースが均等に実行するだけでなくこれらの腫瘍モデルでさらにその汎用性の検証します。特定の細胞サブセット11コラゲナーゼ抗原の消化力の事前懸念にも関わらず紹介がマーカーのいずれかの品質の汚損の著しい損失を観察するまだあります。それにもかかわらず、これらの消化条件に抗原に対する感受性は、この技術の広範な採用前に適切な非消化コントロール サンプルを使用して評価されなければなりません。

結論として、私たちの技術はマウス固型腫瘍の腫瘍免疫と免疫のないコンポーネントの正確な広い、および高スループット特性評価のためことができます。これらのサブセットの独立したプロファイリングを行い、研究者は広く時間を特徴付けるし、固形腫瘍臨床治療をより良い機械論的洞察できます。このメソッドは、リンパ球と骨髄性免疫細胞の人口と、フローサイトメトリーによる表現型の高いスループット分析のためのマウス腫瘍モデルの大半またはサブセットの濃縮を必要とする他の下流の試金に簡単に適用できます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

によりは、国立衛生研究所の両方の一般的な医学の国立研究所 (T32GM088129) と国立歯科・頭蓋顔面研究 (F31DE026682) からの財政支援を認めています。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。このプロジェクトは、また NIH (P30 AI036211、P30 CA125123 S10 RR024574) とジョエル ・ m ・ Sederstrom の専門家の助力からの資金とフローサイトメトリーおよび薬の Baylor の大学で細胞選別の中心によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 to 12 week old male C57BL/6 mice Jackson Laboratory  N/A Mice used in our tumor studies
MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line Acquired from collaborator  N/A E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line 
70% isopropyl alcohol  EMD Milipore  PX1840
Murine surgical tool kit World Precision Instruments MOUSEKIT Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. 
24-well plate  Denville Scientific Inc. T1024 Or any 24-well flat bottom plate. 
RPMI-1640 media Sigma-Aldrich R0883
Collagenase I  EMD Milipore 234153
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation LS004189
DNase I  Sigma-Aldrich 11284932001
Low Speed Orbital Shaker BioExpress (supplier: Genemate)  S-3200-LS Or any orbital shaker. 
Thermoregulating incubator Fisher Scientific 13-255-27 Or any other thermo-regulated incubator
FBS Sigma-Aldrich F8192
EDTA AMRESCO E177
1 mL Pipette and tips Eppendorf 13-690-032 Or any other pipette and tips
40 um Cell Strainers Fisher Scientific 22363547
50 mL Centrifuge Tubes Denville Scientific Inc. C1062-P
15 mL Conical Tubes Denville Scientific Inc. C1012
10 mL Luer-Lok Syringe without needles BD 309604
Lymphoprep Density Gradient Medium STEMCELL Technologies 7811
Transfer Pipettes Denville Scientific Inc. P7212
96-well U-bottom plates Denville Scientific Inc.
DPBS Sigma Aldrich  D8573
FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set  ThermoFisher Scientific 00-5523-00 Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer
Thermoregulated Centrifuge Eppendorf  5810 R
Attune NxT Flow Cytometer ThermoFisher Scientific N/A For 96-well cell volumetric counting 
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2  ThermoFisher Scientific 553141 Fc Block
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation ThermoFisher Scientific L34962 Fixable viability stain
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 ThermoFisher Scientific 47-0451-80
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC ThermoFisher Scientific 17-5961-82
CD8-α Antibody (KT15), PE Santa Cruz Biotechnology sc-53473 
CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 ThermoFisher Scientific 15-0041-81
MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 ThermoFisher Scientific 56-5321-82
CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 ThermoFisher Scientific 15-0114-82
F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 ThermoFisher Scientific 48-4801-80
CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC ThermoFisher Scientific 17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE ThermoFisher Scientific 12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 ThermoFisher Scientific 25-5982-80
CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 ThermoFisher Scientific 46-9972-82
Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 BD Biosciences 563755

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References

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濃縮と確立された皮下マウス腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小のキャラクタリゼーション
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Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors. J. Vis. Exp. (136), e57685, doi:10.3791/57685 (2018).More

Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors. J. Vis. Exp. (136), e57685, doi:10.3791/57685 (2018).

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