Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu

doi: 10.3791/57685 Published: June 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Burada ayırmak ve kurulan subkutan tümörler tümör bağışıklık ve non-immün microenvironment bileşenlerinin zenginleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik tümör bağışıklık sızmak ve tümör bağışıklık microenvironment kapsamlı karakterizasyonu izin verebilir non-immün tümör kesirler ayrı analiz için sağlar.

Abstract

Tümör bağışıklık microenvironment (zaman) son zamanlarda özellikle immunotherapies için solid tümör tedavi yanıtının kritik bir aracı olarak kabul edilmiştir. Klinik gelişmeler son immünoterapi tümör ve onun ilişkili bağışıklık infiltrat doğru ve iyice ayırdetmek tekrarlanabilir yöntemleri ihtiyacını vurgulamak. Tümör enzimatik sindirim ve akış sitometrik çözümlemesi çok sayıda bağışıklık hücre alt kümeleri ve fenotipleri geniş karakterizasyonu izin; Ancak, derinlik analizi kez panel tasarım ve büyük tümör örnekleri elde etmek için gereken nadir bağışıklık nüfus ilgi gözlemlemek için fluorophore kısıtlamalar ile sınırlıdır. Böylece, ayıran ve tümör bağışıklık infiltrat non-immün tümör bileşenlerinden zenginleştirici bir etkili ve yüksek üretilen iş yöntem geliştirdik. Açıklanan tümör sindirim ve santrifüj yoğunluğu tabanlı ayırma tekniği tümör ve tümör ayrı karakterizasyonu bağışıklık infiltrat kesirler ve hücresel canlılığı korur ve böylece, tümörün geniş bir karakterizasyonu sağlar immünolojik durumu. Bu yöntemi daha da tutarlı bütün tümör immünolojik profil oluşturma teknikleri gerek gösteren geniş kayma bağışıklık heterojenite solid tümör olarak karakterize etmek için kullanıldı. Genel olarak, bu yöntem bir etkili ve uyarlanabilir teknik subkutan solid fare tümör immünolojik karakterizasyonu için sağlar; Bu nedenle, bu aracı tumoral immünolojik özellikleri daha iyi tanımlamak için kullanılabilir ve Roman immunotherapeutic stratejileri preklinik değerlendirilmesi.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Baskılayıcı zaman son zamanlarda kanser damgasını kabul edilmiştir ve gelişme, ilerleme ve solid tümör kanser koruma önemli bir rol oynar gibi onların duyarlılık immünoterapi1azaltmak bilinmektedir. ZAMAN çok sayıda hücresel alt kümeleri ve fenotipleri, tüm bunların içine tümör immünolojik durumunu kritik hakkında bilgi sağlayan oluşur. İmmünolojik şu alt kümeleri daha fazla birlikte doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık yanıtı2,3çoğunluğu oluşturan hücrelere lenfosit veya miyeloid kökenli, tabakalı. İmmunotherapeutic stratejileri (Yani, bağışıklık denetim noktası inhibitörleri, chimeric antijen reseptör T-hücreleri, vb) dayanıklı kanser neden potansiyeline sahip kanserli hastalarda alanındaki son gelişmeler göstermiştir regresyonlar; Ancak, bunlar solid tümör kanser4,5' te görece etkisiz kalır. Çok sayıda gruplar en kritik engel kez tedavi başarı6,7üzerinde oynayabilir ve böylece, yeni immunotherapies özellikle odaklanarak önceden klinik ortamda doğru değerlendirmek gerek kalır göstermiştir onların yetenek modüle veya saat8üstesinden gelmek için.

ZAMAN genellikle karakterize etmek için şimdiki çabalar ya mikroskobu kullanmak veya akış sitometresi ile birlikte hücresel bağışıklık alt kümeleri ve onların özellikleri9,10tanımlamak için stratejiler etiketleme antikor. Bu iki stratejileri mikroskobu kayma takdir hücresel alt kümeleri ve yüksek işlem hacmi ve hücresel değişikliklerin daha geniş miktar akış sitometresi sağlar gibi benzersiz olarak farklı bilgiler sağlamanız. Şimdi 7 parametreleri destekler, spektral görüntüleme sistemleri en iyi duruma getirme floresan multiplex immünhistokimya son gelişmeler rağmen sınırlı panel boyutu geniş düzeyde bağışıklık profil oluşturma zor yapar ve bu nedenle bu teknik kez daha fazla bilgi için saklıdır analizleri duruldu. Sonuç olarak, akış sitometresi teknikleri profil oluşturma en çok kullanılan bağışıklık biri olmaya devam etmektedir. ZAMAN karakterizasyonu rağmen yaygın kullanımı, işleme ve boyama için kullanılan yöntemleri oldukça değişkendir. En sık iletişim kurallarını kullanmak bir tümör enzim dissociating (Yani, collagenases, DNaz, vb) ve tek hücreli süspansiyonlar, elde etmek için el ile ayrılma yöntemleri takip antikor boyama ve analiz7tarafından. Her yöntemin faydaları rağmen çok sayıda gruplar bu teknikleri11indüklenen geniş değişkenlik göstermiştir. Bu tümör microenvironment profil oluşturma çapraz-çalışma karşılaştırmalar geçici son derece zor, hatta aynı fare tümör modeli değerlendirirken. Ayrıca, sınırlı potansiyel tümör hücresel değerlendirmek için bu yöntemleri sağlar ve tümör bağışıklık sızmak bileşenleri bağımsız olarak, her iki bileşenin sindirim sonra serpiştirilmiş olan bu yana. Örnek miktar sonra sınırlar paneli çoklu boyama ve analiz, nadir immünolojik alt kümeleri karakterize etmek çalışırken büyük bir sorun olur (Yani, tümör özel T-hücreleri)12. Kitle sitometresi veya sitometresi saat uçuş (CyTOF), tarafından gibi daha yeni teknikler 42 bağımsız parametreleri13den büyük masası tasarımları destekleyen bazı sistemleri ile hücresel alt kümeleri yüksek boyutlu fenotipik analizi sağlar. CyTOF teknoloji bağışıklık profil oluşturma içinde muazzam güç rağmen bu gider, analiz uzmanlık ve ekipman erişim nedeniyle sınırlı kalır. Buna ek olarak, birçok CyTOF protokolleri sinyal-gürültü oranı14geliştirmek için bağışıklık alt kümeleri arıtma tavsiye ve böylece bizim zenginleştirme yöntemi kullanılan olabilir öneririz veri kalitesini artırmak için CyTOF analiz ters yönde.

Burada bir tümör microenvironment sindirim ve tümör bağışıklık birleştirmek yöntemi sızmak ayırma Analizi açıklanmaktadır. Bu yöntemin amacı bağımsız yüksek üretilen iş tümör bağışıklık sızmak ve tümör hücresel bölümler tümör microenvironment daha geniş karakterizasyonu için profil oluşturma izin vermektir. Subkutan solid tümör manken önemli kayma immünolojik heterojenite için bulundu gibi bu yöntemi kullanarak, biz daha fazla bütün tümör çözümlemesini önemini göstermektedir. Bu tümör içinde hücresel bağışıklık alt kümeleri için zenginleştirir ve bağımsız bir tümör bağışıklık kesirler ve tümör hücre profil oluşturma için sağlar çünkü genel olarak, bu yöntem daha doğru ve tutarlı bir şekilde örnekleri arasında karşılaştırabilirsiniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Baylor Tıp Fakültesi tarafından onaylanmıştır.

1. tümör hasat ve sindirim

Not: ~ 3-5 dk hasat için gerekli zamanı geldi/tümör ve işleme için gereken süreyi ~ 1 saat + 2-3 dk/tümör.

  1. Fareler tarafından karbondioksit inhalasyon ötenazi ve her fare aşağı % 70 etanol ile saç kontaminasyonu önlemek için hasat önce sprey. Cerrahi olarak subkutan tümörler fareler kaldırmak ve tümör herhangi bir bulaşıcı dokusunun (Yani, saç, cilt, periton, vb) ücretsiz olduğundan emin olun. Her tümör 1,8 mL fetal Sığır serum (FBS) 24-şey plaka olmadan temel RPMI-1640 medya yerleştirin. Daha büyük hasat için tabak hücresel canlılığı korumak için buza soğuk tutmak.
    Not: kısırlık gerekiyorsa, bir Biyogüvenlik ile steril cerrahi araçlar (Yani, makas, pens, vb), aynı zamanda herhangi bir daha fazla adım kabine içinde gerçekleştirilecek tüm tümör diseksiyonlarının gerekir. Tümör ile en uzun çapı 0,5 - 1 cm arasında en iyi durumda ve daha büyük veya daha küçük tümörler reaktifler ölçekleme gerektirir.
  2. Tümör 1 mm'den az3 adet her şey içinde kesmek için makas kullanın.
  3. Collagenase çözülerek 10 x sindirim kokteyl hazırlamak ben 10 mg/mL, collagenase IV adlı 2.500 U/mL ve DNaz, ben 200 U/mL (olmadan FBS) temel RPMI-1640 medyada.
    Not: Sindirim kokteyl bir gün önceden hazırlanmış ve -20 ° C'de depolanan; Ancak, enzim aktivitesi bir kez çözünmüş zamanla kaybedersiniz olarak uzun süreli depolama tavsiye edilmez.
  4. 10 içeren collagenase ben, collagenase IV ve DNaz ayrılma kokteyl x 200 µL ekleyin ben 1 mm3 adet ile her şey için.
  5. 60-100 bir yörünge plaka shaker kullanarak rpm'de hafifçe sallayarak süre 37 ° C'de 1 h için sindirimi örnekleri sağlar.
    Not: 37 ° c sıcaklık yükselmesine enzimatik sindirim sırasında bağışıklık Hücre aktivasyonu neden olabilir.
  6. 1 saat sonra reaksiyon RPMI-1640 medya her şey için %5 FBS ve 2 mM EDTA ile takıma 1 mL ekleyerek etkisiz hale getirin.
  7. Tümör sindirim ve kalan tümör adet 50 mL santrifüj tüpü üstüne oturmuş bir 40 µm hücre süzgeç içine pipette.
    Not: tümör sindirimi daha kolay transfer süzgeç için 1 mL pipet ucu kapalı ucu kesilmiş.
  8. 10 mL şırınga lavabo pompası mekanik olarak tümör adet süzgeç aracılığıyla disaggregate için kullanın. Süzgeç 2 mL ilave RPMI-1640 medya ile düzenli olarak yıkayın (%5 içeren FBS) ve hücre süzgeç tümörü temizlenene kadar tekrarlayın.
    Not: Yaklaşık 4-10 mL Toplam medya yeterince tümör süzgeç durulama için yeterli olmalıdır.
    Not: tüm örnekleri için hücresel canlılığı korumak bu adımı tamamlanana kadar örnekleri buza koyun.
  9. Her 50 mL santrifüj tüpü ilave RPMI-1640 medya kullanarak aynı birim için ayarlayın.
    Not: Ses ayarı santrifüj dengeleme için önemlidir. Bu adım atlama santrifüj hasar veya yaralanmalara neden olabilir.
  10. Hücre süspansiyonlar (5 dk, 805 x g, 4 ° C) santrifüj kapasitesi, supernatants atmak ve 2 mL ilave RPMI-1640 medya yeniden askıya alma.
    Not: Bir hücre toplamak resuspend zordur aralıklarla takip oluşabilir. 5 mL serolojik pipet ve mix hızla devam etmeden önce ayrılmak için kullanın.

2. bağışıklık ve tümör hücresel kesirler ayrılması

Not: 1 h yaklaşık bu adım için gerekli zamanı geldi.

  1. Yoğunluk gradient orta 3 mL 15 mL santrifüj tüpü altýna ekleyin. Hazırlamak ve yeterli tüpler her tümör için etiket.
  2. Katman tümör hücre süspansiyon iki katmanları karıştırma önlemek için tüp tarafı yavaş yavaş pipetting tarafından yoğunluk gradient orta üzerine 2 mL.
  3. Dikkatle katmanlı borular santrifüj ve spin vasıl 805 x g, 20 ° C, fren yok ile 20 dk için yer.
    Not: Uygun Dengeleme doğrulamak ve fren yok Santrifüjü sırasında kullanıldığından emin olmak son derece önemlidir. Bu işlem herhangi bir bozulma katman karıştırma neden olur ve tam örnek kurtarma zor olacak.
  4. Dikkatle tümör infiltre lökosit (TIL) katmanı ve aktarım pipet kullanarak yeni bir 15 mL tüp top medya katmana aktarmak. Tüm kalan yoğunluk gradient orta atın ve 2 mL ilave RPMI-1640 tümör Pelet tüpün dibinde resuspend.
    Not: Santrifüjü sonra orada-ecek var olmak üstünde dört görünür katmanlardan yukarıdan aşağıya sırasıyla karşılık gelen: medya, TILs, yoğunluk gradient orta ve tümör hücre Pelet. Şekil 2A çeşitli katmanları örneği için bkz.
  5. Her iki TIL santrifüj kapasitesi ve tümör örneklerinde tüpler (5 dk, 805 x g, 4 ° C) ayırmak ve süpernatant atın.
  6. 200 µL TIL örnekte ve tümör Pelet 2 ml ilave RPMI-1640 medya resuspend. Canlılığı korumak için buz üzerinde tutun.

3. kaplama ve boyama

Not: kaplama için gereken süreyi 30 s/tümördür; yüzey boyama için gerekli zamanı 1 h; hücre içi boyama için gerekli 40 dk. zamanı; Akış Sitometresi Analizi 1 - için gereken süreyi 4 dk/tümör.

  1. Hazırlamak ve etiket bir 96-şey U-alt plaka paneli ve hücre için ek bir plaka boyama her bağışıklık için sayar.
    Not: Genellikle, toplamda üç tabak hazırlanır: lenfosit odaklı panel kaplama, myeloid odaklı panel kaplama ve bir hücre sayısı tabak.
  2. Aliquot tek hücreli süspansiyonlar her boyama plakaları ve küme bir birim sayısı plaka paneli.
    Not: Kont plaka hücreleri böylece doğru hücre nüfus sayımları sağlayan her boyama Masası'na eklenen toplam sayısını hesaplamak için kullanılır. 96-şey plaka örnekleme ve hacimsel analiz yetenekleri ile bir akış sitometresi µL her örnek başına hücre sayısı sağlar ve bu nedenle, her boyama Masası'na eklenen hücreleri hesaplamak. Sayısı Tabaklar fiksasyon gecede 4 ° C'de FACs önbellekle durulama, sonra ertesi gün elde edilebilir (fosfat tamponlu tuz (PBS) % 2 ile FBS) ve set hacmi FACs arabellek içinde resuspending.
  3. Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) 200 µL iki kez hücrelerle örnek (5 dk, 805 x g, 4 ° C) centrifuging ve süpernatant arasında herhangi bir ücretsiz FBS kaldırmak için her durulama atarak yıkayın.
  4. 50 µL Fc blok, bir çok kanallı pipet kullanarak örnekleri mix ve 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya Ekle
  5. 2 x 50 µL ekstraselüler hedefleme antikor konsantre ve tamir edilebilir canlılığı leke karışımı, bir çok kanallı pipet kullanarak mix ve RT veya 4 ° c, karanlıkta 30 dk için kuluçkaya ekleyin
    Not: Tam boyama koşullar antikor için üreticinin yönergelerini üzerinde bağlıdır. Tüm boyama dilutions tamir edilebilir canlılığı boya doygunluk önlemek için eklenen hiçbir FBS ile DPBS içinde olması gerekir. Bu el yazması kullanılan boyama panelinin en iyi dilutions için Tablo malzemeleri/ekipman bakınız. Antikor ve tamir edilebilir canlılığı çözüm boyama son bir 1 x 100 µL konsantrasyon Fc engellemek için eklendiğinde toplam boyama birimin boyama sağlamak için 2 x konsantrasyon hazırlanmıştır.
  6. İki kez FACs arabelleği ile örnekleri (5 dk, 805 x g, 4 ° C) centrifuging ve supernatants arasında her durulama atarak yıkayın.
  7. 1 fiksasyon/permeabilization çözüm x 200 µL resuspend ve gecede ışıktan korunan 4 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Deneme gecede bu noktada duraklatılmış: ışıktan korunan 4 ° C'de örnekleri tutmak.
  8. Ertesi gün, tabak (5 dk, 805 x g, 4 ° C) santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  9. Bir kez 1 permeabilization arabellek, santrifüj (5 dk, 805 x g, 4 ° C), x 200 µL ile durulayın ve süpernatant atın.
  10. 1 x konsantre hücre içi antikor boyama masası 1 x permeabilization arabellekte hazırlanan 100 µL ekleyin ve RT veya 4 ° C (bu üreticinin boyama önerileri bağlıdır) karanlıkta 30 dk için kuluçkaya.
  11. Arabellek (5 dk, 805 x g, 4 ° C), 1 x permeabilization ile atmak sonra süpernatant durulama ve durulama FACs arabelleği ile ikinci kez (PBS % 2 ile FBS).
  12. Örnekleri FACs arabellek 300 µL içinde resuspend (% 2 ile PBS FBS), akış sitometresi tüpler için örnekler aktarmak ve akış sitometresi analizi gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bizim sonuçlar non-immün tümör bileşenlerinden ayırma TIL önemli yararı iletişim kuralında açıklandığı gibi gösterilmektedir. Ayrıca, açıklanan yöntemi kullanarak biz kurulan solid tümör önemli immünolojik heterojen göstermek.

Birçok tümör ayrışma teknikleri ile önemli bir sorun en sık sert sindirim koşulları (Yani, yüksek sıcaklıklarda, yetersiz besin kaynağı, vb) bir sonucu olarak örnek canlılığı kayıptır. İle açıklanan sindirim yöntemi kullanın veya yoğunluk degrade orta zenginleştirme, sağlayan yaklaşık % 70-90 toplam hücresel canlılık gibi akış sitometresi (Şekil 1A) tarafından değerlendirildi. Benzer viabilities TIL gözlendi zenginleştirilmiş ve tümör zenginleştirilmiş kesirler, düşündüren bu yöntem en az genel toksisite (resim 1, resim 2C) neden olur. Ayrıca, yoğunluk gradient orta zenginleştirme daha büyük bir terfi CD45 logosuna 2 kat artış daha pozitif TIL kesir toplam hücrelerin arasında sigara zenginleştirilmiş ile karşılaştırıldığında tümör kesimi (Şekil 1B, C) analiz. Ayrıca, çok sayıda bağışıklık hücre alt kümeleri elde edilen miyeloid bastırıcı hücreleri (MDSCs), dendritik hücreler (DCs), makrofajlar, CD8 T-hücreleri ve CD4 T-hücreleri ( gibi bağışıklık microenvironment çalışmalarda yaygın olarak değerlendirildi geliştirmek için zenginleştirme bulundu Şekil 1D, E). Bu yoğunluk gradient orta zenginleştirme küresel immunocyte enrichments teşvik ve belirli lenfosit veya miyeloid nüfus ( Tamamlayıcı şekil 1A, B tanımlamak için kullanılan yöntemi çoğunluğuna akış sitometresi için bkz: ayırma değil göstermektedir belirli hücre popülasyonlarının). Ancak, birçok ticari olarak mevcut yoğunluğu degrade ayrılık kitle iletişim araçları eritrositler ve granülosit ayrılık faz üzerinden geçmek için önemli bir kısmını izin dikkati çekiyor. Bu nüfus ilgi vardır, böylece, daha fazla iletişim kuralı en iyi duruma getirme gerekli olabilir.

Figure 1
Resim 1 : Tümör bağışıklık infiltrat nazik ve etkili zenginleştirme. Kurulan MEER tümörleri eksize ve açıklanan yöntemi kullanılarak sindirilir. Öyle ki yarısı yoğunluk gradient orta zenginleştirme ve diğer yarısı doğrudan lekeli uygulandı sindirim, tek hücreli süspansiyonlar ayrıldı. (A)toplu akış sitometresi tümör kesimi ile ya da ezelî yoğunluk gradient orta zenginleştirme için hücresel canlılık değerlendirilmesi. (B) temsilcisi akış sitometresi CD45 olumlu bağışıklık hücre zenginleştirme bir tek tümör sindirim ve yoğunluk gradient orta zenginleştirme olmadan gösterilen araziler geçişi. (C) toplu akış sitometresi CD45 pozitif hücre yüzdeyi toplam hücrelerin tümör kesimi ile ya da ezelî yoğunluk gradient orta zenginleştirme üzerinden arasında. (D) çeşitli miyeloid zenginleştirme oranları ve lenfosit bağışıklık nüfus. Tümörler tek hücre süspansiyon doğrudan lekeli veya yoğunluk gradient zenginleştirme boyama ve Akış Sitometresi Analizi önce geçiren önce sindirilmiş. Her hücre tipi zenginleştirme oranı (arasında değerlendirildi toplam hücrelerin) verilen hücre-nüfusun yüzde bölerek yoğunluk gradient zenginleştirilmiş tümör sindirim sigara zenginleştirilmiş meslektaşı tarafından üzerinden hesaplanır. Satırları Bar ortanca temsil ve bar kenarlarını minimum ve maksimum oranları temsil eder. (E) bağışıklık hücresel marker ifade analiz her bağışıklık hücre nüfusu tanımlamak için kullanılan tablo. İstatistiksel anlamlılık bir unpaired t-testi veya Mann Whitney ile tespit edilmiştir. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ***p < 0,0001, (n = 20 tümörler, N = 2 tüm grafikler için). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bu yöntem sağlar en önemli avantajlarından biri bağımsız olarak non-immün tümör kesir profil yeteneğidir. Sonra yalıtım yoğunluk gradient orta faz üzerinden geçer pelleted non-immün tümör fraksiyonunun panelleri profil oluşturma karmaşık tümör daha önce fluorophore numarası ile sınırlı gerçekleştirilebilir ve örnek miktar kısıtlamaları. Resim 2 A üzerinde % 70 canlılığı ve CD45% 99 olumsuz hücre zenginleştirme ile tümör akış sitometresi karakterizasyonu örneği gösterir. CD45 negatif kesir sonra genel tümör canlılığı veya apoptosis (annexin V, vbYani, caspase 3,), nükleer silahların yayılmasına karşı kapasitesi (Yani, Ki67) ve çeşitli ifade gibi çok sayıda tümör özellikler için profilli immünsüpresif işaretleri (Yani, programlanmış ölüm-ligand 1 (PD-L1) veya PD-L2). Ancak, CD45 negatif kesir hem tümör hücreleri hem de tümör microenvironment stromal ve vasküler diğer unsurları içerdiğini belirtmek gerekir. Doğrudan tümör hücre karakterizasyonu gerekiyorsa, bir tümör hücre belirli işaretleyici olmak gerekir (Yani, cytokeratin, spesifik antijen tümör ilişkili trafiğe, vb). Benzer şekilde, diğer tümör stromal öğeler olabilir kolayca tespit ve tümör vasküler endotel hücreleri (CD31) ve kanser gibi bir hücre tipi belirli marker ile ilişkili fibroblastlar (α-düz kas aktin) etiketleme sonra ile karakterizedir. Yine de, canlılık ve CD45 negatif hücre zenginlik yoğunluğu degrade Ayırma tekniği non-immün tümör bileşen zenginleştirme (Şekil 2B, C için sağlamlık gösteren yinelenen örnekleri arasında son derece tutarlı düzeydir ).

Figure 2
Resim 2 : Zenginleştirme ve non-immün tümör bileşen özellikleri profilleme. (A)temsilcisi görüntü katmanı (ince bulanık beyaz), yoğunluğu degrade orta katman (açık) ve tümör Pelet tüpün dibinde TIL yoğunluk gradient orta zenginleştirme görünür medya tabaka (pembe), aşağıdaki örneği. (B) temsilcisi akış sitometresi non-immün tümör bileşeni hücre canlılığı dağılım çizim (üst), CD45 negatif hücre zenginleştirme dağılım çizim (sol alt) ve üç bağımsız işaretleri ilgi ile profil oluşturma için kullanılan strateji geçişi çubuk grafik araziler (PD-L1 üst, PD-L2 orta ve Ki67 alt) ile ifade. FMO histogram gösteren bir örnek ile diğer tüm paneli renkleri lekeli ama ilgi işaretçisi eksik. Toplu akış sitometresi değerlendirilmesi (C) hücresel canlılığı ve (D) CD45 negatif hücre yüzdeyi toplam hücrelerin arasında yoğunluk gradient orta zenginleştirme takip tümör Pelet fraksiyonunun (n = 7-8 tümörler). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Solid tümör genetik heterojenite karakterize etmek için önemli çabalara rağmen küçük iş içinde solid tümör immünolojik alt kümeleri kayma heterojen ayrıntılı. Böylece belirlemek amaçlanmıştır nasıl myeloid ve büyük ölçüde değişik tek bir solid tümör lenfosit immünolojik alt kümeleri. Böylece, bir kurulan MEER tümör her bölümü yaklaşık eşit içi tumoral bölgeleri, hem de eşit dermal ve periton-bakan bölümleri (Şekil 3A) yer sağlamak için özel ilgi ile dört eşit parçaya bölündü. Her tümör parça ayrı ayrı, sindirmek ve sonra yoğunluk gradient medyum tarafından zenginleştirilmiş ve myeloid ve lenfosit masası arasında bölünmüş. Bu miktar yaygın olarak biçilen immunocyte nüfus sayısı dahil olmak üzere çeşitli özellikleri izin: T hücreleri CD4 + T hücreleri, CD8 + T hücreler, makrofajlar, DCs, MDSCs (bkz. ek şekil 1A, B strateji çoğunluğuna akış sitometresi için). Tek bir tümör içinde farklı tümör bölümleri arasında önemli hücre değişkenlik kaydetti (Şekil 3b) yapıldı. Örneğin, DC ve T hücre toplam hücre sayısı 4'e kadar tarafından 5-fold değişir bulunmuştur bitişik tümör parçaları arasında. Bu köklü değişiklikler de ne zaman analiz hücre nüfus toplam hücrelerin (ek Şekil 2A) yüzdesi olarak kaydedildi ve iki diğer bağımsız Tümörleri (ek şekil 2B, C) benzer düzeyde gözlendi. Bu veriler yalıtma ve tamamlayıcı çözümleme bağımsız tarafından izin vermek için tümör bölen geçerli iletişim kuralları dahil ederseniz counterintuitive görünebilir bağışıklık microenvironment analizleri yapılırken tüm tümör analiz önemini göstermek Yöntemleri (Yani, histoloji, RNA miktar, vb). Buna ek olarak, bölgesel intratumoral immünolojik heterojenite büyük ölçüde biyopsi sonuçları çarpık gibi bu veri tutarsızlıkları tümör biyopsileri, immünolojik analizlerde açıklayabilir.

Figure 3
Şekil 3 : Kurulan tümör bağışıklık heterojenite değerlendirilmesi. (A)temsilcisi görüntü bir kurulan MEER tümör cerrahi rezeksiyon (solda) takip ve sonra 4 bitişik içine eşit bölümü (sağda) parçalar. Ölçek çubuğu her görüntü üzerinde siyah gösterilen 1 cm'dir. (B) kat miyeloid çeşitli değiştirir ve lenfosit hücre her 4 bitişik tümör parça arasında sayar; Her tümör bölüm aynı sindirim, yoğunluk gradient orta zenginleştirme yordamı, boyama ve Analizi uygulandı. Tümör herbirinin bir hücre sayısı kat değişiklik olarak, hücre sayımı belli bir hücre nüfus için en düşük analiz hücre sayısı ile tümör bölümü tarafından bölerek olarak gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Supplemental Figure 1
Tamamlayıcı Şekil 1: tümör bağışıklık bileşen profil oluşturma için kullanılan strateji çoğunluğuna temsilcisi akış sitometresi. (A)ile ilgili scatter araziler lenfosit bağışıklık profil oluşturma için kullanılan strateji geçişi. (B) tümör miyeloid bağışıklık profil oluşturma için kullanılan ilgili scatter araziler ile strateji geçişi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Supplemental Figure 2
Ek resim 2: ek kurulan tümör heterojenite değerlendirilmesi. (A)hücresel yüzde 4 eşit tümör toplam hücrelerin kat değişim arasında parça Şekil 3de gösterildi. (B) ve (C) iki ek kurulan MEER tümörleri bitişik 4 bölüme ayrılmıştır ve tümör bağışıklık heterojenite için analiz. Hücre sayısı kat değişiklikleri (solda) ve hücre yüzdeyi toplam hücrelerin arasında kat değişiklikleri (sağda) her biri için myeloid ve lenfosit hücre nüfus analiz her biri 4 bitişik tümör parça değişkenlik gösteren. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ZAMAN çeşitli ve karmaşık hücresel bileşenleri ve molekülleri oluşmaktadır. Son kanıtlar bu ortamda doğru karakterizasyonu daha iyi anlaşılmasını tedavi başarı veya başarısızlık sağlayabilir ve hatta tedavi direnç mekanizmaları belirlemenize yardımcı olabilir gösteriyor. Örneğin, çeşitli immünsüpresif hücreleri (Yani, MDSCs, düzenleyici T hücreleri, vs) intratumoral düzeylerini artırma efektör bağışıklık yanıtı azaltmak ve immunotherapeutic etkileri iptal etmek. Öte yandan, efektör bağışıklık nüfus (Örneğin, tümör özgü CD8 + T hücreleri, doğal katil hücreler, T yardımcı hücreleri) artan intratumoral varlığı tedavi başarı güçlü belirleyicileri olabilir. Tümör immünolojik durumu doğru şekilde göstermek için devam ediyor başka bir karakterizasyonu tümör hücreleri kendilerini fenotipik özellikleri olduğunu. Bu çeşitli immünsüpresif ligandlar, enzimler veya downregulating efektör bağışıklık yanıtı amaçlı molekülleri ifade içerir (Yani, PD-L1, PD-L2, indolamine 2, 3 dioxygenase, nitrik oksit, vb). Birlikte ele alındığında, bu solid tümör bağışıklık ve tümör hücresel özellikleri doğru ve geniş karakterizasyonu için ihtiyaç gösterir.

Biz burada tarif tekniği ayrılık ve zenginleştirme bağışıklık ve tümör katı fare subkutan tümörler hücre bileşenleri sağlar. Böylece tam zamanlı ve tümör hücrelerinin etkileşim zaman takdir sonra bağımsız akış sitometrik profil oluşturma gerçekleştirilebilir. Zenginleştirme geniş bağışıklık akış sitometresi panelleri anahtar myeloid ve lenfoid hücre bileşenleri yanı sıra çeşitli özellikler fenotipik durumlarını açıklayan karakterizasyonu izin vermek için optimize edilebilir. Benzer şekilde, geniş tümör hücre odaklı paneli bağımsız olarak tümör hücre özellikleri de geniş alan nitelik özellikleri sağlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin göreli basitliğine fare tümör modelleri biyolojik çeşitliliği rağmen eğilimleri gözlemlemek için kritik fare tümörler, çok sayıda eşzamanlı analiz için sağlar. Buna ek olarak, hangi sık sık önemli ölçüde diğer non-immün hücre bileşenleri için karşılaştırıldığında tümör içinde underrepresented nadir immünolojik alt kümeleri (Yani, tümör özgü sitotoksik T hücreleri), daha iyi tanımlaması tümör bağışıklık zenginleştirme sağlar . Bu tekniğin en iyi duruma getirme bu profil oluşturma mRNA coculture ex vivo deneyleri gibi zenginleştirme gerektiren izole alt kümeleri veya evlat edinen cep transfer çalışmaları ek aşağı akım değerlendirmeler izin verebilirsiniz.

Bu teknik bir subkutan fare tümör model kullanma, biz küresel ve bağımsız bağışıklık alt kümeleri önemli zenginleştirme göstermek. Biz de hangi aynı tümör örneklerinden elde edilebilir profil oluşturma non-immün tümör göstermek. Son olarak, biz bir tümör bitişik bölümlerinin önemli immünolojik heterojenite gözlemlediği gibi bütün tümör immünolojik profil oluşturma, önemi gösteriyoruz. İdeal olarak, bu teknik collagenase ve sindirim DNaz tabanlı ve gradyan tabanlı ayrılması tümör bağışıklık ve non-immün kesirler fare tümör modelleri, her iki orthotopic çoğunluğu için uygulanan olabilir ve subkutan. Biz de bu küçük sigara kurulan tümörler ve daha az kollajen yoğun tümör modelleri (Yani, B16 Melanom) gözlemledim kez tek hücreli süspansiyonlar15; oluşturmak için bir enzimatik sindirim adım gerektirmeyen Ancak, aynı derecede bağışıklık zenginleştirme gradyan tabanlı gerçekleştirir de bu tümör modellerinde daha çok yönlülüğünü doğrulanıyor. Collagenase antijen sindirim belirli hücresel alt kümeleri11hakkında önceden endişelere rağmen henüz kalite herhangi biz profilli işaretleri için boyama önemli bir kayıp gözlemlemek gerekiyor. Yine de, bu sindirim koşullar karşı antijen hassasiyetini uygun olmayan sindirilmiş kontrol örnekleri geniş kabulü bu tekniği daha önce kullanarak değerlendirildi.

Sonuç olarak, bizim teknik fare solid tümör tümör bağışıklık ve non-immün bileşenlerinin doğru geniş ve yüksek üretilen iş karakterizasyonu için sağlar. Bu alt kümelerine bağımsız profil oluşturma gerçekleştirerek, araştırmacılar geniş zaman karakterize ve solid tümör preklinik tedaviler daha iyi mekanik bir anlayış kazanmak. Bu yöntem kolayca lenfosit ve myeloid immunocyte nüfus sayımları ve fenotipleri akış sitometresi ile yüksek üretilen iş analizi için fare tümör modellerin büyük çoğunluğu veya alt zenginleştirme gerektiren diğer aşağı akım deneyleri için uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

JMN ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü (T32GM088129) ve Ulusal Enstitüsü Diş ve fasiyal araştırma (F31DE026682) mali desteği Ulusal Sağlık Enstitüleri her ikisi de kabul eder. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor. Bu proje aynı zamanda NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 ve S10 RR024574) ve Joel M. Sederstrom uzman yardımı fon ile Sitometresi ve hücre sıralama özünde Baylor Tıp Fakültesi tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 to 12 week old male C57BL/6 mice Jackson Laboratory  N/A Mice used in our tumor studies
MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line Acquired from collaborator  N/A E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line 
70% isopropyl alcohol  EMD Milipore  PX1840
Murine surgical tool kit World Precision Instruments MOUSEKIT Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. 
24-well plate  Denville Scientific Inc. T1024 Or any 24-well flat bottom plate. 
RPMI-1640 media Sigma-Aldrich R0883
Collagenase I  EMD Milipore 234153
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation LS004189
DNase I  Sigma-Aldrich 11284932001
Low Speed Orbital Shaker BioExpress (supplier: Genemate)  S-3200-LS Or any orbital shaker. 
Thermoregulating incubator Fisher Scientific 13-255-27 Or any other thermo-regulated incubator
FBS Sigma-Aldrich F8192
EDTA AMRESCO E177
1 mL Pipette and tips Eppendorf 13-690-032 Or any other pipette and tips
40 um Cell Strainers Fisher Scientific 22363547
50 mL Centrifuge Tubes Denville Scientific Inc. C1062-P
15 mL Conical Tubes Denville Scientific Inc. C1012
10 mL Luer-Lok Syringe without needles BD 309604
Lymphoprep Density Gradient Medium STEMCELL Technologies 7811
Transfer Pipettes Denville Scientific Inc. P7212
96-well U-bottom plates Denville Scientific Inc.
DPBS Sigma Aldrich  D8573
FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set  ThermoFisher Scientific 00-5523-00 Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer
Thermoregulated Centrifuge Eppendorf  5810 R
Attune NxT Flow Cytometer ThermoFisher Scientific N/A For 96-well cell volumetric counting 
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2  ThermoFisher Scientific 553141 Fc Block
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation ThermoFisher Scientific L34962 Fixable viability stain
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 ThermoFisher Scientific 47-0451-80
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC ThermoFisher Scientific 17-5961-82
CD8-α Antibody (KT15), PE Santa Cruz Biotechnology sc-53473 
CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 ThermoFisher Scientific 15-0041-81
MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 ThermoFisher Scientific 56-5321-82
CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 ThermoFisher Scientific 15-0114-82
F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 ThermoFisher Scientific 48-4801-80
CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC ThermoFisher Scientific 17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE ThermoFisher Scientific 12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 ThermoFisher Scientific 25-5982-80
CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 ThermoFisher Scientific 46-9972-82
Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 BD Biosciences 563755

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7, (5), 1016-1036 (2017).
  2. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14, (10), 1014-1022 (2013).
  3. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27, (45), 5904-5912 (2008).
  4. Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33, (31), 3541-3543 (2015).
  5. Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8, (12), 106 (2016).
  6. Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28, (1), 105-113 (2010).
  7. Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114, (3), 589-595 (2009).
  8. Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
  9. Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37, (2), 364-376 (2012).
  10. Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013, (10), (2013).
  11. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  12. Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7, (6), 01902-01916 (2016).
  13. Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
  14. Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
  15. Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors. J. Vis. Exp. (136), e57685, doi:10.3791/57685 (2018).More

Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors. J. Vis. Exp. (136), e57685, doi:10.3791/57685 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter