Summary
כאן אנו מציגים שיטה חזקה לתכנת fibroblasts עובריים הראשי לתוך cardiomyocytes פונקציונלי. דרך ביטוי של GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, מיר-1, ומיר-133 (GHMT2m) לצד עיכוב של TGF-β איתות. פרוטוקול שלנו יוצרת מכות cardiomyocytes מוקדם ככל 7 ימים שלאחר התמרה חושית עם עד 60% יעילות.
Abstract
טרנס-התמיינות של תאים סומטיים אחד סוג אחר יש פוטנציאל עצום דגם ולטפל מחלות אנושיות. מחקרים קודמים הראו את העכבר עובריים, עורי, וכן הלב fibroblasts שניתן לתכנת לתאים המושרה cardiomyocyte-כמו תפקודית (לעוצמה מלאה) דרך ביטוי של גורמי שעתוק קרדיוגני כולל GATA4, Hand2, Mef2c, ו Tbx5 גם במבחנה וגם בתוך vivo. עם זאת, מחקרים קודמים אלו הראו יעילות נמוכה יחסית. על מנת לשחזר את תפקוד הלב בעקבות פגיעה, מנגנונים המסדירים התכנות הלב חייב להיות הובהר כדי לשפר את היעילות ואת התבגרותם של לעוצמה מלאה.
אנחנו בעבר הראו כי עיכוב של pro-fibrotic איתות באופן דרמטי מגביר יעילות התיכנות. כאן, אנו מפרטים שיטות כדי להשיג יעילות התיכנות של עד 60%. יתר על כן, נתאר מספר שיטות כולל cytometry זרימה, הדמיה immunofluorescent של סידן הדמיה לכמת יעילות התיכנות, ההבשלה של fibroblasts מחדש. באמצעות פרוטוקול מפורט כאן, ניתן לבצעם מכניסטית מחקרים כדי לקבוע הרגולטורים חיוביים ושליליים של התכנות הלב. מחקרים אלה עשויים לזהות איתות המסלולים זה ניתן לפלח כדי לקדם את יעילות התיכנות, התבגרות, אשר יכול להוביל לטיפולים חדשניים תא לטיפול במחלות לב אנושי.
Introduction
מחלת לב איסכמית הוא הגורם המוביל המוות. ארצות הברית1. כ 800,000 אמריקנים ניסיון קודם או מדלקות אוטם שריר הלב (MI) לכל שנה1. בעקבות MI, מותו של cardiomyocytes (CMs) ואת הלב פיברוזיס, שהופקדו על ידי fibroblasts לב מופעל, לפגום הלב תפקוד2,3. ההתקדמות של אי ספיקת לב לאחר MI בלתי הפיך במידה רבה בשל יכולת ההתחדשות המסכן של CMs למבוגרים4,5 בזמן הנוכחי טיפולים קליניים להאט את התקדמות המחלה, להקטין את הסיכון של אירועי לב בעתיד6,7,8,9, טיפולים לא להפוך את התקדמות המחלה בשל אי להתחדש CMs שלאחר אוטם10. טיפולים חדשניים תא מתגלים לטיפול בחולים בעקבות חוקר אורח מאכזב, הראו ניסויים קליניים אספקת תאי גזע הלב בעקבות MI כה חד משמעיות regenerative פוטנציאלי11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
הדור של האדם, נגזר המושרה גזע pluripotent (hiPSCs) מ fibroblasts על ידי ביטוי של ארבעה גורמי שעתוק, שהראו מאת טקהאשי & יאמאנקה, פתח את הדלת לפריצות חדש מתא טיפול19. תאים אלה יכולים להתמיין שלוש שכבות הנבט כל19ולאחר מספר שיטות יעילים ביותר ליצירת מספר גדול של CMs בעבר הוכחו20,21. HiPSC-derived CMs (ירכיים-CMs) מציע כלי עוצמתי ללמוד cardiomyogenesis ועל כן ייתכנו השלכות חשובות על תיקון הלב בעקבות פגיעה. עם זאת, ירכיים-CMs כעת להתמודד עם מכשולים translational בשל חששות של היווצרות טרטומה22, טבעם לא בוגר יכול להיות פרו-arrhythmogenic23. התכנות fibroblasts לתוך hiPSCs עוררה עניין ישירות התכנות fibroblasts לתוך סוגי תאים אחרים. . Ieda et al. הפגינו זה ביטוי של GATA4, Mef2c ו- Tbx5 (GMT) בתוצאות fibroblasts ב התכנות ישירה אל הלב, שושלת היוחסין, אם כי-יעילות נמוכה24. התכנות יעילות היה משופר עם התוספת של Hand2 (GHMT)25. מאז אלה מחקרים מוקדם, פרסומים רבים הראו כי שינוי קוקטייל גורם התיכנות עם שעתוק נוספים הגורמים26,27,28,29, כרומטין מכפילי30,31,32,מיקרו Rna33או מולקולות קטנות34 מוביל לשיפור התכנות יעילות ו/או ההבשלה של cardiomyocyte דמוי המושרה תאים (לעוצמה מלאה ).
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי ליצור לעוצמה מלאה מתוך העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) עם יעילות גבוהה. בעבר הראינו כי GHMT קוקטייל משתפרת בצורה משמעותית עם התוספת של מיר-1 ומיר-133 (GHMT2m), חל שיפור נוסף כאשר pro-fibrotic איתות המסלולים כולל הפיכת גורם הגדילה β (TGF-β) איתות או הקשורים רו פרוטאין קינאז (רוק) איתות המסלולים הם עכבות35. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מראים כי כ- 60% של תאים אקספרס טרופונין לב T (cTnT), כ- 50% אקספרס α-actinin, מספר גבוה של תאי מכות יכול להיות שנצפו מוקדם ככל 11 יום לאחר התמרה חושית של התכנות גורמים וטיפול עם TGF-β מסוג מעכבי הקולטן A-83-01. יתר על כן, אלה לעוצמה מלאה אקספרס gap junction חלבונים כולל connexin 43 ולהציג שנחשולי סידן להתכווצות ספונטנית. השתפרות ב התכנות יעילות לעומת מחקרים מוקדמים יותר מדגים את היכולת להתחדש CMs של אוכלוסיות תא אנדוגני תישאר הלב לאחר אוטם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים הדורשים חיות אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה בקמפוס UC דנבר Anschutz רפואית.
1. בידוד של MEFs
- לרכוש עכברים בהריון C57BL/6-E13. הספינה בין לילה.
- המתת חסד האמא לפי פרוטוקולים IACUC שאושרו (לשעבר: ~1.3 L/min CO2 להופעת חיה מתה ואחריו נקע בצוואר הרחם)
- לרסס את האמא עם 70% אתנול, פתיחת חלל הבטן. להסיר את הקרן רחמי המכיל עוברי ומניחים בצלחת 10 ס מ עם PBS סטרילי.
- לבצע חתך שק העובר לשחרר את העובר. להעביר את העובר כדי לנקות צלחת 10 ס מ עם PBS סטרילי. לשטוף היטב.
- לחתוך את הגוף מתחת הכבד ולמחוק את הראש ואת פלג הגוף העליון. להסיר את האיברים הפנימיים וזורקים. להעביר את הרקמה הנותרת מאכל נקי 10 ס מ עם PBS סטרילי ולהעביר לצלחת עם אבטחה ברמה 1 או 2 הקבינט. לשלב רקמות מן כל העוברים בקערה נקייה, יבשה 10 ס מ, מינצ לחתיכות משובחים.
- להוסיף 6 מ של 0.25% טריפסין/1 מ מ EDTA עוברי טחון. Triturate מספר פעמים על ידי פיפטה כדי לשבור את הרקמה. תקופת דגירה של 40 דקות ב- 37 הלעפה תרוטרפמט עם 5% CO2.
- Resuspend בתאים מדיום הגידול (טבלה 1). הנפח של מדיה מותאמת מבוסס על מספר העוברים שנקטפו. באופן כללי, השתמש יחס של 25 מ ל מדיה צמיחה לכל העוברים 1.2.
- צלחת 25 מ של תאים resuspended בקערה 15 ס מ. לאחר 24 שעות, תשאף התקשורת ולהוסיף 25 מ של מדיום הגידול טריים כל צלחת.
- לאחר 72 h, להוסיף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין/1 מ מ EDTA כל מנה 15 ס מ. כאשר תאים לנתק מן המנה תרבות, בטל טריפסין עם מדיום הגידול 15 מ"ל ולאסוף תאים צינורות חרוט פוליסטירן 50 מ. צנטריפוגה תאים עבור 3 דקות ב x 160 גרם בטמפרטורת החדר. Resuspend בגדר תא מדיום הגידול, לסנן דרך מסננת תא נקבובית 70 מיקרומטר.
- לספור תאים באמצעות hemocytometer ו MEFs ב 2 מיליון תאים aliquots ההקפאה בינוני (דימתיל סולפוקסיד 10%, 25% FBS של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) / גבוהה גלוקוז) ב- 80 ° C העברת תאים חנקן נוזלי לאחר 24 שעות ביממה וחנות עד מוכן לשימוש.
הערה: ביטוי גנים העולמי ב MEFs היה פרופיל מבודדת באמצעות פרוטוקול זה על ידי RNA-רצף (RNA-seq) כדי להבטיח תא אימות. RNA-seq נתונים מתאי MEF לקודד הורדו מן Omnibus ביטוי גנים NIH (GEO) עם מספר גישה GSE93454. RNA-seq ג'ין ביטוי נתונים עבור MEFs המשמשים אותנו הופקדו ב NIH גיאוגרפי עם מספר גישה GSE71405. אלה שתי סדרות נתונים מוזגו על פי בסימנים ג'ין נפוצים. הנתונים ביטוי ואז יומן-נהפכו, scatterplot של הנתונים הביטוי שלנו MEFs, קדד MEFs היו שנוצר ובכושר עם קו רגרסיה ליניארית (איור 1 א'). MEFs מבודדים באמצעות פרוטוקול זה דומים מולקולרי לאלה מבודדת על ידי מעבדות נוספות.
2. ייצור של רטרווירוס התמרה חושית של MEFs
הערה: כל השלבים בסעיף זה צריך להתבצע בארון 2 רמת אבטחה. מאז פרוטוקול זה מנצל retroviral התמרה חושית, להבטיח את בטיחות זהירות נלקחים כולל טיפול שכל פסולת המכילה מדיה ויראלית עם מלבין 10% לפחות 20 דקות עיין כדי איור 1B עבור ציר זמן עבור התכנות.
-
הייצור של רטרווירוס באמצעות שורת תאים פלטינה E (PE)
- לשמור על PE זמינים מסחרית, בתאים PE בינוני (טבלה 1) המכיל blasticidin ו- puromycin הבחירה סמנים כדי להבטיח ביטוי של מחסום פה- גניםpol ו env לייצור חלקיק retroviral יעיל36 . מעבר תאים ב- 1:4 או 1:5 כל יומיים. לטפל כדי למנוע צפיפות יתר של תאים כמו זה יכול להפחית ייצור retroviral התשואות.
- ביום-1, זרע כ 5 x 106 תאים לכל צלחת 10 ס מ במצע הגידול (טבלה 1) 16-20 h לפני תרביות תאים (ראו טבלה 2 יופיצ צפיפויות עבור אחרים הגדלים צלחת של תרבות תא סטנדרטי). רוק בעדינות מנות ואחורה מספר פעמים ומניחים בזהירות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 חממה כדי להבטיח אפילו ציפוי הפצה (ראה איור 1C צפיפות אופטימלית ציפוי לפני תרביות תאים).
הערה: תשמרי על צלחת PE תאים המדיום ללא בחירה סמני לפני תרביות תאים כדי להבטיח בינוני המכיל חלקיקים retroviral שנוצר לא הרג את MEFs. - ביום 0, היכונו DNA תרביות תאים. תרביות תאים צלחת 10 ס מ, להוסיף 2 µg של כל גורם התיכנות — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, מיר-1, ומיר-133 (GHMT2m) — כדי צינור 1.5 מ ל.
הערה: עיין בטבלה 2 לשינוי גודל כמות הדנ א צריך transfect אחרים הגדלים צלחת של תרבות תא סטנדרטי. - בשפופרת mL 1.5 נפרדים, להוסיף מדיה מופחת סרום µL 360. לאחר מכן להוסיף מגיב 36 של תרביות תאים µL ישירות למדיה מופחת סרום. בעדינות לסתור את הצינור, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
הערה: כדי להימנע תקנים מופחתת יעילות, להוסיף בזהירות תרביות תאים ריאגנט ישירות למדיה מופחת סרום. - להוסיף תערובת ריאגנט מדיה/תקנים מופחת סרום GHMT2m DNA קוקטייל. בעדינות לסתור את הצינור, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לא מערבולת.
- להוסיף את תערובת התגובה dropwise לתאים PE בעדינות מערבולת מדיה עבור s 10-15, מקום 37 ° C, 5% CO2 מיכלים.
הערה: על פי היצרן, PE תאים ליצור עם כייל נוגדנים ממוצע של 106 עד 107 זיהומיות יחידות/מ"ל. פרוטוקול זה מייצר כ 2 x 106 זיהומים יחידות/mL מאת 24 h ו- 6 x 106 זיהומים יחידות/mL מאת h 48 בממוצע MOI של 4. תרביות תאים של GFP/DsRed עשוי גם לשמש פונדקאית ליעילות תרביות תאים/התמרה חושית במידת הצורך; תרביות תאים יעילות צפוי תעלה על 90% לפי 48 שעות (איור 1C).
-
התמרה חושית של MEFs
- ביום 0, מעיל מנות עם קולגן, במקום 37 ° C, 5% CO2 מגשים כבר לפחות שעתיים.
- הסר MEFs חנקן נוזלי, הפשרה. צלחת 0.2 x 106 תאים לכל מאכל 60 מ מ במצע הגידול. בעדינות לוחות אבן כדי להבטיח אפילו ציפוי הפצה ומניחים בחממה (ראה איור 1C אופטימלית ציפוי צפיפות, בטבלה 2 עבור ציפוי צפיפויות עבור אחרים הגדלים צלחת של תרבות תא סטנדרטי).
הערה: צפיפות ציפוי אלה נבדקו מעל במספר אצוות של MEFs מבודדים; אלא אם כן MEFs התצוגה בסכנה משמעותית הכדאיות, התאמת תא זריעה צפיפויות אינה הכרחית. - ביום 1, 24 שעות לאחר תרביות תאים, השתמש מזרק 30 מ ל כדי לאסוף בינוני retroviral שנוצר על ידי תאים PE. עוברים המדיום 0.45 µm גודל הנקבוביות מסנן לתוך צינור חרוטי 50 מ. להוסיף hexadimethrine ברומיד תרביות תאים ריאגנט ריכוז סופי של 6 µg/mL. להוסיף בזהירות מדיום הגידול טריים 10 מ"ל לתאים PE על-ידי תקשורת pipetting על גבי הקיר של המנה תרבות כדי למנוע תזוזה של תאים.
- האחות האמצעי MEFs ולהוסיף 4 מיליליטר בינוני retroviral שנקטפו זה עתה כל מנה. לחזור MEFs החממה. להוסיף 10% מלבין כל החומרים בקשר עם המדיום ויראלית כדי לנטרל. את החלקיקים retroviral.
- יום 2, 48 שעות שלאחר תרביות תאים, חזור על שלבים 2.2.2, 2.2.3. PE תאים מתבטלים בעקבות אוסף המוזיאון 2nd של המדיום retroviral.
הערה: להוסיף 10% מלבין לתאים PE שהושלכו לפחות 20 דקות לנטרל. את הרטרו וירוס לא רצויים. - ביום 3, תשאף בינוני מ MEFs ו לחדש 4 מ"ל iCM בינונית (טבלה 1) המכילה 0.5 מיקרומטר A-83-01, TGF-β מסוג מעכבי הקולטן. לחדש iCM בינוני המכיל A-83-01 כל יומיים.
הערה: אם משתמש GFP כפקד התמרה חושית, הביטוי צפוי תעלה על 90% ובשלב זה זמן (איור 1C).
3. דנ לסמני הלב
- וביופסיה בינוני 9 יום מחדש מסיר כתמים MEFs (1 x) עם 1 x PBS להסרת תאים מתים ופסולת.
- להוסיף 1 מ"ל 0.25% טריפסין/EDTA עבור 5 דקות הלעפה תרוטרפמט 37. לבדוק תאים באמצעות מיקרוסקופ אור, לנער מאכל; אם התאים יישארו מצורפים, דגירה 5 דקות יותר-הלעפה תרוטרפמט 37 עד ניתוק התאים.
- לשטוף את התאים ב- PBS 1 x המכילה 5% FBS וסינון דרך מסננת תא נקבובית 70 מיקרומטר.
- צנטריפוגה ב x 160 g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב נוזל מן בגדר.
הערה: כדי להגדיל את התשואה תא, השאר µL כ-50 נוזל מעל בגדר התא. - לשטוף תאים עם PBS 1 x 500 µL המכיל 1% BSA.
- לתקן תאים עם 0.2 מ ל/1 מיליון תאים קיבוע פתרון עבור 20 דקות על קרח.
- להוסיף 1 מ"ל 1 x פרם קפואים/שטיפת המאגר.
הערה: הפתרון של היצרן הוא 10 x. - צנטריפוגה תאים ב x 160 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, תשאף תגובת שיקוע.
- חזור על שלבים 3.7 ו- 3.8 שעה נוספת. אחרי כביסה 2nd , ישירות לשלב הבא או להשאיר תאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לחסום עם 100 µL של סרום עיזים 5% ואת החמור סרום 1 x פרם/שטיפת מאגר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- להוסיף 100 µL של נוגדן ראשוני מדולל.
הערה: עבור פרוטוקול זה, תאים עם תווית עם העכבר טרופונין T (1:200), העכבר α-actinin (1:200) לכמת את האחוז תאים חיובית עבור רכיבי מפתח של סרקומר הלב. דגירה נוגדן ראשוני לשעה בטמפרטורת החדר. - צנטריפוגה תאים ב x 160 g עבור 5 מ'-4 ° C, תשאף תגובת שיקוע, לשטוף 2 x עם מאגר פרם קפואים/לשטוף.
- להוסיף 100 µL של נוגדנים משניים מדולל.
הערה: עבור פרוטוקול זה, תאים הודבקו תוויות עם אנטי-העכבר 647 nm משני אינץ נוגדנים (1:200). נוגדנים משניים למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר-מסובב מעל קצה-שפופרת דגירה. להגן על תאים מפני האור על ידי ליפוף צינורות בנייר. - צנטריפוגה תאים ב x 160 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, תשאף תגובת שיקוע, לשטוף 2 x עם מאגר פרם קפואים/לשטוף.
- להוסיף 1 מ"ל של BSA 1% ב- PBS ולבצע FACS מיד.
הערה: ליצור לעומת פיזור קדמי צד פיזור מגרש לשער התאים קיימא ראשית בעת ביצוע FACS. לחלופין, השתמש כתם זמינים מסחרית תא חי/מת לפני תיקון התאים כדי לזהות חי מת תא אוכלוסיות.
4. Immunostaining של MEFs מחדש
- וביופסיה בינוני מיום 14 היו MEFs ושטוף (1 x) עם 1 מ ל 1 x PBS קר כקרח.
הערה: עבור immunostaining, התכנות בוצעה ב 12 צלחות טוב כדי למזער את הנוגדן פתרון אחסון. 24 צלחות טוב עשוי גם לשמש; פשוט חצי כל בעקבות כרכים. - האחות ותקן תאים עם 500 paraformaldehyde 2% µL 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- האחות ולשטוף תאים 3 פעמים עם PBS 1 x 1 מ"ל (5 דקות לכל כביסה בטמפרטורת החדר).
- Permeabilize תאים עם 500 µL 0.2% permeabilization מגיב ב- PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- האחות וחסום בנסיוב 500 µL 10% סוס ב- PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- האחות, דגירה עם 500 µL של נוגדן ראשוני מדולל לשעה בטמפרטורת החדר.
הערה: עבור פרוטוקול זה, התאים היו עם העכבר טרופונין T או α-actinin (כל 1:400) תוויות ומוענקת משותפת Connexin 43 (1:400) או טרופונין אני (1:400). - האחות הראשית נוגדן ולשטוף שלוש פעמים עם PBS 1 x 1 מ"ל (5 דקות לכל כביסה בטמפרטורת החדר).
- האחות, דגירה עם 500 µL נוגדנים משניים מדוללת למשך שעה בטמפרטורת החדר.
הערה: עבור פרוטוקול זה, תאים עם תווית עם אנטי-העכבר 555 nm משני נוגדנים (1:800) כדי לזהות טרופונין T או α-actinin, אנטי-ארנב 488 ננומטר משני נוגדנים (1:800) לזהות Connexin 43 או טרופונין אני בנוסף, גרעינים היו מוכתמות Hoechst (1:10, 000). להגן על תאים מפני האור על ידי המקננת בחושך. - תשאף הנוגדן משנית ותרחצי שלוש פעמים עם PBS 1 x 1 מ"ל (5 דקות לכל כביסה בטמפרטורת החדר). לעטוף את הצלחת בנייר כדי להגן על התאים מפני אור ולאחסן ב 4 º C.
- התמונה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence שלושה ערוצים.
5. סידן הדמיה
הערה: אם הדמיה בהגדלה X 10, תא סטנדרטי תרבות מנות וצלחות מתאימים עבור הדמיה סידן. הדמיה בהגדלה גבוהה דורש כי התאים להיות מצופה על coverslips זכוכית דקה או כלי הזכוכית התחתונה.
- תשאף בינונית ומוסיפים 2 מ"ל (עבור 6 טוב לוח) שונה פתרון של Tyrode (140 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 1.8 מ"מ CaCl2, 1 מ MgCl2, גלוקוז 10 מ מ, 10 מ מ HEPES, BSA 0.1%, 1% פירובט, pH 7.4) המכיל 5 מיקרומטר אני Fura-2 ו- 0.1% Pluronic F-127 להכות (D14 t o D20) לעוצמה מלאה. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
הערה: להגן על תאים מפני אור כדי למנוע שכבתה של מחוון פלורסנט. - לשטוף את התאים בפתרון של 2 mL Tyrode למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר דה-esterification של Fura-2 בבוקר.
- התמונה עם ספינינג דיסק מיקרוסקופיה קונפוקלית-340 nm ו 380 nm באמצעות Slidebook 5.5 Ca2 + תוכנות ליצירת תמונות. ביצוע ההדמיה בטמפרטורת החדר.
- סידן שנחשולי מחושבים באמצעות היחס בין עוצמת קרינה פלואורסצנטית ב 340 nm מעל עוצמת קרינה פלואורסצנטית ב 380 nm.
- אם רצונך בכך, להתייחס לעוצמה מלאה עם isoproterenol מיקרומטר 1 או 2 או 10 מיקרומטר Nifedipine לתמרן סידן טיפול לאחר הדמיה שנחשולי סידן בסיסית. להוסיף תרכובות מקומית תאים ותמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות האסטרטגיה התיכנות המתוארים לעיל, איור 1B, יצרנו לעוצמה מלאה עם-70% של תאים לבטא T טרופונין הלב, כ- 55% של תאים לבטא לב α-actinin, לכמת על ידי cytometry זרימה-יום 9 בעקבות התמרה חושית של GHMT2m (איור 2 א ו- B). בנוסף, הרוב המכריע של תאים אקספרס טי טרופונין הלב, טרופונין, הלב α-actinin וכן דה מרקר צומת הפער Connexin 43 בגיל 14 יום לאחר התמרה חושית (איור 2C ו- D). הדמיה עם הגדלה גבוהה יותר מגלה סרקומר מוגדרים היטב צפיפות והצמתים הפער ויוצרים בין התאים הסמוכים (חץ לבן, איור דו-ממדי). יתר על כן, תופעות מעבר סידן להתכווצות ספונטנית מצביעים על הפונקציונליות של לעוצמה מלאה (איור 3 א-C וסרט 1).
איור 1: ציר הזמן של התכנות, ציפוי אופטימלית של תאים. (א) Scatterplot של טרנספורמציה-יומן נתונים RNA-seq עבור MEFs שנוצר במעבדה שלנו לעומת קדד MEFs. ערך2 R של קו הרגרסיה הליניארית מוצגים. (B) תיאור סכמטי של קריטי כל השלבים בתיווך GHMT2m התיכנות של MEFs. (ג) PE תאים ב- 70-80% הנהרות לפני תרביות תאים (בשורה העליונה, עזב את החלונית) ו- GFP אות 48 שעות שלאחר תקנים כדי לציין יעילות תרביות תאים (בשורה העליונה, לוחות נכון אמצעית). MEFs נזרע בדלילות לפני זיהום כדי למנוע צפיפות יתר על תקופת הזמן של התכנות (שורה תחתונה, עזב את החלונית) ו GFP אות 48 שעות לאחר הפגיעה כדי לציין יעילות זיהום (שורה תחתונה, לוחות נכון אמצעית). סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: כמת, אפיון של הלב חלבון ביטוי לעוצמה מלאה. (A ו- B). Cytometry זרימה נציג עבור טרופונין לב T (א) וα-actinin (B) -יום 9 בעקבות GHMT2m התמרה חושית, n = 3. (ג) ICC מכתים לסמני לב בגיל 14 יום לאחר GHMT2m התמרה חושית. ירוק: טרופונין לב אני, אדום: לב טרופונין T (לוח האמצעי) α-actinin (לוח נכון) ו כחול: Hoechst צביעת עבור גרעינים. להחליפן בתמונות (n = 3). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר (D) מדמיין בהגדלה של מבנה סרקומר (אדום: לב α-actinin (שורה עליונה) ו- T טרופונין הלב (שורה תחתונה)) וביטוי של gap junction חלבון Connexin 43 (ירוק). ראשי חץ לבן מצביעים על צמתי הפער שנוצר בין תאים שכנים. להחליפן בתמונות (n = 3). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: פונקציונלי כימות לעוצמה מלאה. (א) מסלול הזמן בנצחונך תא ספירת בעקבות GHMT2m התמרה חושית. מכות תאים נספרו על ידי העין וסופרת תא מ 10 שדות לכל צלחת מעל 3 מנות לכל ניסוי היו בממוצע וכללה בלוח א (B ו ג) הקליט שנחשולי סידן של לעוצמה מלאה. תדירות ארעי סידן היא שונה ב לעוצמה מלאה לאחר הטיפול עם 1 מיקרומטר Isoproterenol או 10 מיקרומטר nifedipine. F340/F380, היחס בין עוצמת קרינה פלואורסצנטית-340 ו 380 nm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
סרט 1: להכות לעוצמה מלאה. הסרט מציג פעימות לעוצמה מלאה ב 12 יום בתוך חוץ גופית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
| iCM מדיה | ||
| שמו של ריאגנט | נפח (mL) | ריכוז סופי |
| גלוקוז גבוהות DMEM | 320 | |
| בינוני 199 | 80 | |
| סרום שור עוברית | 50 | 10% |
| סרום הסוס התורם | 25 | 5% |
| הגברת חומצות אמינו חיוניות, 50 x | 10 | 1 x |
| פתרון פירובט נתרן, 100 x | 5 | 1 x |
| מאמ שאינם חיוניים חומצות אמינו, 100 x | 5 | 1 x |
| פתרון ויטמין MEM, 100 x | 5 | 1 x |
| אינסולין-Transferrin-סלניום, 100 x | 5 | 1 x |
| B27, 50 x | 10 | 1 x |
| Penicilin-סטרפטומיצין | 5.5 | כ- 1.1% |
| תוספת-גלוטמין | 5.5 | כ- 1.1% |
| מדיה PE | ||
| שמו של ריאגנט | נפח (mL) | ריכוז סופי |
| גלוקוז גבוהות DMEM | 450 | |
| סרום שור עוברית | 50 | 10% |
| Penicilin-סטרפטומיצין | 5.5 | כ- 1.1% |
| תוספת-גלוטמין | 5.5 | כ- 1.1% |
| Blasticidin-HCl - 10 מ"ג/מ"ל | 0.5 | µg 10/mL |
| Puromycin dihydrochloride | 0.05 | µg 1/mL |
| צמיחה מדיה | ||
| שמו של ריאגנט / ציוד | נפח (mL) | ריכוז סופי |
| גלוקוז גבוהות DMEM | 450 | |
| סרום שור עוברית | 50 | 10% |
| Penicilin-סטרפטומיצין | 5.5 | כ- 1.1% |
| תוספת-גלוטמין | 5.5 | כ- 1.1% |
טבלה 1: תרבות המדיה- מתכונים בינוני תרבות בשימוש בפרוטוקול זה.
| PE תאים | ||||||
| צלחת תרבות תא | פני השטח (2ס מ) | צפיפות זריעה (תאים) | אמצעי מדיה (mL) | DNA הכולל לכל תרביות תאים (µg) | ריאגנט תרביות תאים (µL) | Opti-מ (µL) |
| 15 ס מ | 176.7 | 11.25 x 106 | 20 | 36 | 108 | 1080 |
| 10 ס מ | 78.5 | 5 x 106 | 10 | 12 | 36 | 360 |
| 60 מ מ | 28.2 | 1.7 x 106 | 4 | 4 | 12 | 120 |
| 6. ובכן לוחית רישוי | 9 | 0.54 x 106 | 2 | 1.3 | 3.9 | 39 |
| 12. ובכן לוחית רישוי | 4 | 0.24 x 106 | 1 | 0.6 | 1.8 | 18 |
| 24. ובכן לוחית רישוי | 2 | 0.12 x 106 | 0.5 | 0.3 | 0.9 | 9 |
| MEFs | ||||||
| צלחת תרבות תא | פני השטח (2ס מ) | צפיפות זריעה (תאים) | אמצעי מדיה (mL) | Hexadimethrine ברומיד (µL) | ||
| 15 ס מ | 176.7 | 1.35 x 106 | 20 | 12 | ||
| 10 ס מ | 78.5 | 0.6 x 106 | 10 | 6 | ||
| 60 מ מ | 28.2 | 0.2 x 106 | 4 | 2.4 | ||
| 6. ובכן לוחית רישוי | 9 | 0.1 x 106 | 2 | 1.2 | ||
| 12. ובכן לוחית רישוי | 4 | 0.4 x 105 | 1 | 0.6 | ||
| 24. ובכן לוחית רישוי | 2 | 0.2 x 105 | 0.5 | 0.3 | ||
בטבלה 2: זריעה צפיפויות עבור התכנות. טבלת זריעה צפיפות התאים PE ו- MEFs נפוצות תא תרבות מאכל תבניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המחקר הנוכחי מתווה אסטרטגיה יעילות גבוהה לתכנת fibroblasts ישירות לתוך פונקציונלי לעוצמה מלאה באמצעות מסירת GHMT2m התכנות גורמים בשילוב עם דיכוי של pro-fibrotic איתות המסלולים. שימוש cytometry זרימה, הדמיה immunofluorescent, סידן הדמיה, ומכים תא ספירת, אנו מראים את רוב התאים ב פרוטוקול זה עוברים התכנות מוצלחת ולאמץ את גורל שושלת היוחסין ס מ. אנחנו בעבר הראו כי התוספת של anti-fibrotic תרכובות כולל סוג TGF-β אני מעכב קולטן A-83-01 התשואות עלייה כ 6-fold מספר המכות לעוצמה מלאה בהשוואה להתמרה חושית עם GHMT2m לבד, המציין איתות pro-fibrotic הוא מחסום אנדוגני חזקה התכנות הלב. מערכת זו ניתן, לכן, לשלוט לסינון סמים לחקור מנגנונים המסדירים cardiomyogenesis; התוספת של מולקולה קטנה לצד א-83-01 יכול לחשוף הרגולטורים השלילי של cardiomyogenesis. לעומת זאת, התוספת של מולקולה קטנה כדי GHMT2m לבד יכול להבהיר הרגולטורים חיובי של cardiomyogenesis. להתיר את המנגנונים שדרכו הרגולטורים חיוביים ושליליים אלה חלים על בידול ס מ התוצאה הבנה טובה יותר של cardiomyogenesis, להוביל עוד יותר יעילה התכנות ופרוטוקולים ההבשלה.
משתנים רבים משפיעים על יעילות התיכנות. אנו מוצאים כי צפיפות יופיצ תא מאוד משפיע הייצור של חלקיקים retroviral במקרה של PE תאים וגם את ספיגת יעיל של כל הגורמים התיכנות במקרה של MEFs. יתר על כן, המספר המעבר יכול להשפיע על פרמטרים אלה גם כן. כדי להבטיח ייצור אופטימלית של נגיפים, transfect תאים PE לפני המעבר 20. כדי להבטיח ספיגה יעילה של חלקיקים retroviral, לא מעבר MEFs לאחר הקפאה.
מספר מחקרים אחרונים הוכיחו יעילות גבוהה תכנות מחדש של MEFs על ידי הורסים PRC1 חבר Bmi יחד עם ביטוי של GMT30 או overexpressing Akt בנוסף GHMT37. תוספת של ZFN281 GHMT + Akt הובילה עלייה 4-fold טרופונין T חיובי בתאים הזנב הבוגרים עצה fibroblasts, מיוחסת בחלקה דיכוי גנים דלקתיים חתימות38. יתר על כן, השילוב של מעכב איתות TGF-β ו ונ ט איתות מעכב גדל בתיווך GMT הלב התכנות39. חשוב לציין, איתות המסלולים המעורבים במחקרים אלה אינם מופיעים כדי חפיפה. לכן, סביר להניח כי צולבות לדבר בין מספר איתות המסלולים יכול לשפר עוד יותר התכנות הלב.
מספר מחקרים הדגימו התיכנות ויוו דרך המסירה של התכנות גורמים בעכברים בעקבות עזב הקדמי היורד (LAD) בעורק מצדו25,32,39,40 ,41. מחקרים אלה הראתה שיפור צנוע בתפקוד חדרית בעקבות MI, דבר המלמד את הפוטנציאל הטיפולי של התכנות הלב על התחדשות לב בעקבות פגיעה. פרוטוקול שלנו תיכנות מחדש MEFs עם ה הגבוהה יעילות במבחנה עד כה. לכן, זה יהיה מעניין לראות אם יעילות גבוהה התכנות הוא מסוגל לשחזר באופן מלא את תפקוד הלב לאחר פציעה ויוו. מחקרים אלה יכולים לשמש בסיס שיטה זו לתרגם טיפולים תא הרומן לאחר אוטם של חולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי קרנות מתוכנית של קרן Boettcher וארינג ווב ביו מחקר, מענק פיתוח מדען איגוד הלב האמריקאי (13SDG17400031), אוניברסיטת קולורדו מחלקת הרפואה בראשית הקריירה יוצאת מן הכלל תוכנית מלומד, אוניברסיטת קולורדו חלוקה של קרדיולוגיה בארלו Nyle הקדש, ואת NIH R01HL133230 (ל K.S). A.S.R נתמכה על ידי NIH/NCATS קולורדו CTSA גרנט מספר TL1TR001081, מלגת הדוקטורט מראש מן האיחוד אוניברסיטת קולורדו עבור מחקר פיברוזיס & תרגום (CFReT). מחקר זה גם נתמך על ידי המענק תמיכה מרכז הסרטן (P30CA046934), המענק ליבות (P30AR057212) לחקר מחלות העור, הליבה Cytometry זרימה בקמפוס אוניברסיטת קולורדו Anschutz רפואית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems - Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
- Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
- Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
- The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
- Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
- Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
- Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
- Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
- Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
- Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
- Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).
