Summary
Vi præsenterer her, en protokol for multi-farve lokalisering af enkelt Membranproteiner i organeller af levende celler. Du kan vedhæfte fluorophores, bruges selvstændig mærkning proteiner. Proteiner, beliggende i forskellige membraner rum af den samme organelle, kan lokaliseres med en nøjagtighed på ~ 18 nm.
Abstract
Viden om lokalisering af proteiner i cellulære subcompartments er afgørende for at forstå deres specifikke funktion. Vi præsenterer her, en super-opløsning teknik, der giver mulighed for bestemmelse af den microcompartments, der er tilgængelige for proteiner ved generering af lokalisering og sporing kort over disse proteiner. Desuden af multi-farve lokalisering mikroskopi, er lokalisering og sporing af profiler af proteiner i forskellige subcompartments opnået samtidigt. Teknikken, der er specifikke for levende celler og er baseret på den gentagne billeddannelse af enkelt mobile Membranproteiner. Proteiner af interesse er genetisk sammensmeltet med specifikke, såkaldte selvstændig mærkning tags. Disse tags er enzymer, der reagerer med et substrat i en kovalent måde. Konjugeret til disse substrater er fluorescerende farvestoffer. Reaktion af de enzym-tagged proteiner med fluorescens mærket substrater resultater i mærket proteiner. Her, der Tetramethylrhodamine (TMR) og silicium rodamin (SiR) anvendes som fluorescerende farvestoffer på substrater af enzymer. Ved hjælp af substrat koncentrationer i pM til nM rækkevidde, opnås sub støkiometriske mærkning der resulterer i forskellige signaler. Disse signaler er lokaliseret med ~ 15 – 27 nm præcision. Teknikken, der giver mulighed for multi-farve billeddannelse af enkelte molekyler, hvorved antallet af farver er begrænset af de tilgængelige membran-gennemtrængelige farvestoffer og repertoire af selvstændig mærkning enzymer. Vi viser gennemførligheden af teknikken ved bestemmelse af lokalisering af kvalitetskontrol enzym (PT)-induceret kinase 1 (PINK1) i forskellige mitokondrie rum under behandling i forhold til andre Membranproteiner. Test for sande fysiske vekselvirkninger mellem forskelligt mærket enkelt proteiner af enkelt molekyle FRET eller co tracking er begrænset, selv, fordi de lave mærkning grader mindske sandsynligheden for at have to tilstødende proteiner mærket på samme tid. Mens teknikken er stærk for imaging proteiner i membranen rum, i de fleste tilfælde er det ikke hensigtsmæssigt at bestemme lokalisering af stærkt mobile opløselige proteiner.
Introduction
Målet med denne protokol er at give en billedmetoden til at lokalisere og spore enkelt Membranproteiner i levende celler. Vi kalder denne metode sporing og lokalisering mikroskopi (TALM)1,2. Ligesom stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM)3 og fluorescens Photoactivation lokalisering mikroskopi ((F) PALM)4,5er TALM et enkelt molekyle-baserede fluorescens lokalisering teknik. Men det er forskellige i den måde, at mobilitet på Membranproteiner i kombination med gentagne billeddannelse af samme mærket molekyle på forskellige positioner afslører den microcompartment, der er tilgængelige for den mobile protein. Med andre ord er de mulige lokaliseringer af protein fastsat i arkitekturen i organelle og mobilitet af protein1. Metoden er supplement til forskellige andre super-resolution teknikker6,7,8 , fordi det afslører lokalisering og bane kort af imaging mobile proteiner. Mærkning er baseret på ved hjælp af gensplejsede fusion proteiner, der er i sig selv ikke-fluorescerende. Disse fusion proteiner selvstændig mærkning enzymer, der reagerer kovalent med et substrat, konjugeret med et farvestof. Denne fremgangsmåde har den fordel, at mærkning graden kan blive kontrolleret af mængden af tilsat substrat. Desuden, det giver mulighed for at variere farven af fluorescens, afhængigt af den valgte konjugeret farvestof. Flere selvstændige mærkning enzym-tags er tilgængelig9. En anden fordel ved at bruge selvstændige mærkning enzym-tags er, at de konjugerede farvestoffer normalt er mere stabile og lysere end fluorescerende proteiner1 og individuelle proteiner derfor kan registreres længere og mere præcist indtil de er bleget. Dette giver mulighed for optagelse af baner af mobile proteiner og udvinding af diffusion koefficienter10,11.
Her vi demonstrere muligheden for at TALM med mitokondrielle Membranproteiner, men det kan også anvendes for andre intra og ekstra cellular Membranproteiner, herunder forskellige typer12,13. Vi viser, at multi-farve TALM yderligere giver mulighed for samtidige sondringen af proteiner i forskellige subcompartments i komplementering til eksisterende super-resolution Fluorescens mikroskopi teknikker14,15, 16. TALM er kompatibel med levende celle imaging17. Foto-fysik af de valgte rhodamines Tetramethylrhodamine (TMR) og silicium-Rhodamien (SiR), navnlig deres lysstyrke og stabilitet, gør det muligt at optage enkelt Membranproteiner over flere rammer giver lokalisering (og bane) kort. TALM er dog begrænset til lokalisering af opløselige proteiner med høj diffusion koefficienter, da motion blur er for høj og de indsamlede fotoner pr. ramme er for lavt for korrekt lokalisering. Desuden kræver TALM mindre excitation strøm end for eksempel STORM eller stimuleret Emission udtynding (STED) mikroskopi6,7, reducere fototoksiske effekter. Det er vigtigt, eftersom fototoksisk stress påvirker ofte organellar morfologi18 og dermed mobilitet analyse19. I sum, vi præsenterer multi-farve TALM i levende celler som en teknik, der udfylder et hul mellem lokalisering mikroskopi metoder STORM/STED / (F) PALM og teknikker, der analyserer protein mobilitet såsom fluorescens opsving efter photobleaching (FRAP)20 ,21, fluorescens korrelation spektroskopi (FCS)22og fluorescens cross korrelation spektroskopi (FCCS)11,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol følger retningslinjerne i den lokale institution videnskabsetisk Komité.
1. metoder
-
Cellekultur
- Dyrke celler, for eksempel HeLa celler (human cervix carcinom), i en T25 celle kultur kolbe indeholdende 5 mL af vækstmediet ved 37 ° C og 5% CO2.
Bemærk: For billedbehandling, Opdel celler på forberedt coverslips (Se trin 1.3 og 1.4) og holde i imaging medium.
- Dyrke celler, for eksempel HeLa celler (human cervix carcinom), i en T25 celle kultur kolbe indeholdende 5 mL af vækstmediet ved 37 ° C og 5% CO2.
-
Celle Transfektion
Bemærk: Brug cellelinjer, der stabilt express tagged proteinerne når det er muligt24 at undgå stærke overekspression. Forbigående Transfektion, tilpasse mængden af plasmid DNA anvendes til Transfektion. For eksempel, når Ca2 + fosfat Transfektion25 bruges, transfect celler (80-90% confluency) i en 3,5 cm celle kultur skålen med 2,5 – 5 µg af plasmid DNA. Når du udfører dobbelt Transfektion, bruge 2,5 µg pr. hver plasmid konstruktion.- Til eksperimenter med dobbelt farve, bruge en cellelinje med stabil udtryk for en selvstændig mærkning protein og forbigående transfect med plasmid kodning af andre selvstændige mærkning protein17.
Bemærk: Her, for dobbelt farve eksperimenter, HeLa celler blev brugt som stabilt udtrykt de selvstændig mærkning proteiner PINK1-Halo-Tag og Tom20-fSNAP-Tag.
- Til eksperimenter med dobbelt farve, bruge en cellelinje med stabil udtryk for en selvstændig mærkning protein og forbigående transfect med plasmid kodning af andre selvstændige mærkning protein17.
-
Rengøring af coverslips
- Placer coverslips i et bægerglas. Der tilsættes 30 mL af H2O i bægerglasset indeholdende coverslips og Ryst forsigtigt for at fjerne støv fra deres overflade.
- Indsamle coverslips med pincet og tør dem med en strøm af kvælstof.
- Fjerne organisk forurening på overfladen af coverslips, fxved plasma rengøring.
Bemærk: For at undgå yderligere forurening af materialet, glas, bære handsker under håndtering af coverslips.
Forsigtig: Når coverslips renses af plasma rengøring, rengøres kun den øverste side af coverslips; Brug denne side til belægning med poly-L-lysin-polyethylen glycol-argininog-glycin-aspartat (PLL-PIND-M.H.T.) (afsnit 1.4) og celle såning (afsnit 1.5).
-
Coverslip belægning med PLL-PIND-M.H.T.
Bemærk: PLL-PIND-M.H.T. er en poly-L-lysin (PLL) afledte fastgjort med en polyethylenglycol (3.000 Da) og en cysteine-glycine-arginine-glycine-aspartate-serine (CGRGDS)-peptid. PLL binder sig til den negativt ladede glasoverflade og danner en PIND pensel. Dette reducerer drastisk uspecifik binding af ladede fluorescerende farvestoffer. Derudover M.H.T. motiv efterligner signal peptid af integrin-receptor og fremmer derved integrin-medieret overholdelse af celler, der ellers ikke nemt overholder.- Forberede PLL-PIND-M.H.T. som tidligere beskrevet26. Kort sagt, opløse 0,8 mg af PLL-PIND-M.H.T. i 1 mL PBS. Tilføje 10 µL af PLL-PIND-M.H.T. løsning på den øvre side af en ren coverslip.
- Tage en anden coverslip og placere den med sine rene overflade op og ned på den første coverslip (der har PLL-PIND-M.H.T. drop på toppen); Dette resulterer i sandwiching PLL-PIND-M.H.T. løsning mellem to coverslips.
- Omhyggeligt placere den klemt coverslips i et bægerglas og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur i et støvfrit tørre omgivelser.
- Efter 1 h, der tilsættes 30 mL af H2O over i bægerglasset, skal fuldt ud dække coverslips med vand.
- Ryst forsigtigt bægerglasset, indtil coverslips løsnes fra hinanden.
- Bruge pincet til at samle coverslips op af vandet og tør dem under en strøm af nitrogen gas.
Bemærk: Den coatede coverslips kan opbevares i et tørt og sterilt glas petriskål med låg for et par dage.
-
Forberedelse af prøven til billedbehandling
- Overføre den enkelt coated coverslips i en 35 mm celle kultur skål, med PLL-PIND-M.H.T. coated overflade opad og der tilsættes 2 mL imaging medium på toppen.
- Tilføje ~ 500.000 trypsinized celler (200-500 µL), der udtrykker de selvstændig mærkning tags på de respektive Membranproteiner til 2 mL imaging medium i celle kultur fad med den belagt coverslip. Ryst forsigtigt i hånden til at sikre en homogen fordeling af cellerne til at opnå en ensartet cellelag.
- Inkuber celler ved 37 ° C og 5% CO2 , indtil 80% confluency er nået.
Bemærk: Celle prøver bør være seedet 3 dage før imaging og 1 dag før Transfektion. Celler, som stabilt express protein af interesse, kan være seedet 2 dage før billeddannelse. Senere, er kun celler dyrkes på coverslip afbildet.
-
Mærkning af mærket proteiner
Bemærk: Mest fluorescerende substrater skal opløses i vand-fri DMSO. Vi anbefaler for at bruge stamopløsninger af 1 µM fluorescerende substrat, når den endelige mærkning koncentration er 0,2 – 30 nM17. Imaging Membranproteiner inde i cellerne, bruge membran gennemtrængelig fluorescerende substrater.- Varm op den billeddiagnostiske medium til 37 ° C i et vandbad.
- 1 mL af den pre varmede billeddiagnostiske medium pipetteres i et 2 mL rør med låg. Tilføje 0,2 – 30 µL af fluorescerende substrater fra 1 µM stamopløsninger til at forberede den endelige mærkning løsning (endelig koncentration: 0,2 – 30 nM).
- Vortex mærkning løsningen for 10 s.
- Erstatte medium i 35 mm kultur fad med celler på en coverslip (Se trin 1,5) af 1 mL af udarbejdet mærkning løsning.
- Inkuber celler i mærkning opløsningen ved 37 ° C og 5% CO2 til 20-30 min.
- Vaske cellerne med 2 mL PBS én gang og derefter med 2 mL af imaging medium to gange. Endelig, afpipetteres 1 mL frisk billeddiagnostiske medium til celle fadet og sætte prøven tilbage i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2 i mindst 1 time. Før imaging, udveksle den billeddiagnostiske medium endnu.
Bemærk: Når du kører forsøget for første gang, bekræfte korrekte målretning af selvstændige mærket proteiner til organellar membraner af farvning organeller med kommercielt tilgængelige organelle specifikke farvestoffer27,28. I dette tilfælde også bruge 100 – 200 nM af substrat for selvstændig mærkning enzymer til at producere stærke signaler.
-
Forberedelse af en fluorescerende kugle prøve
Bemærk: For at bestemme den optiske drift og justere billeder af de forskellige kanaler anvendes multi-farve fluorescerende perler (0,1 µm). Med de optagne billeder genereres en affine transformation matrix for to emission kanalerne.- Fortyndet opløsning af perler til 1% med ren H2O.
- Sted 5 dråber af den forberedte løsning med fluorescens perler på fem forskellige positioner på et rengjort coverslip (Se trin 1.3).
- Lad fluorescerende perle prøven tørre på en ren bænk.
Bemærk: Prøven kan genbruges; Derfor, dække prøve med aluminiumsfolie til at undgå forurening og holde det på et 4 ° C.
2. mikroskopi
-
Eksperimentel opsætning
Bemærk: En grundlæggende mikroskopi system for dual-farve enkelt molekyle imaging er baseret på en inverteret mikroskop: den er udstyret med to lasere koblet via en multi-mode optisk polarisering opretholde monomode fiber ind i en enkelt total interne reflection (TIR) kondensator, en oliebestandighedsobjektet designet til JOHANNAS, en polyband emission filtre, en image splitter og en yderst følsomme kamera (figur 1). En TIR-kondensator er nødvendigt der giver mulighed for kontinuerlig tuning af hændelsen vinkel til at skifte mellem den epi-, stærkt tilbøjelig og lamineret optisk ark (meget skrå tynde belysning (HILO)29) og JOHANNAS excitation tilstand med optimeret indtrængningsdybde. Billeder er erhvervet med en yderst følsomme afkølede detektor system, fx en back-belyste elektron at multiplicere opkrævet koblede enhed (EMCCD) kamera (kvante effektivitet QE > 90%) eller en sCMOS kamera (QE > 80-90%).- Bestemme den optiske drift af imaging fluorescerende perler (Se trin 2.2) på samme betingelser som dem, der senere skal bruges til eksperimentet, f.eks., når 10.000 billeder der registreres i eksperimentet, optage også 10.000 rammer med perle prøve. Til bestemmelse af den optiske drift, sammenligne placeringen af perlerne i første frame og den sidste erhvervede ramme (figur 1B). Om nødvendigt senere rette billede-serien for optisk drift30 og/eller bruge drift stabil miljøer.
- Udstyre filter kuben med passende dichroic beam splitter, fxtil orange og røde fluorescens plus de passende udledning filtre for orange fluorescens og røde fluorescens. Udstyre image splitter med passende filtre. Kontrollere, om muligt læk af signaler fra en kanal i anden kanalen ved at optage enkelt farveeksempler på begge kanaler (figur 1 c).
Figur 1 : Optisk layout til multi-farve sporing og lokalisering mikroskopi (TALM) med orange og røde udledere. (A) Inverted mikroskop setup med mindst to excitation lasere, en JOHANNAS kondensator, en JOHANNAS passende mål, en image splitter og en følsom kamera. Indsatser: for at ophidse organeller inde i cellerne, vinklen på det indfaldende strålebundt skal indstilles mindre end den kritiske vinkel for JOHANNAS at opnå meget hælder og laminerede optisk ark belysning (HILO). DC1: Dichroic spejl 1; DC2: Dichroic spejl 2. EF: emission filter. (B) Test på optiske drift af imaging positioner af en fluorescerende kugle til 10.000 rammer med den samme frame rate som i de følgende eksperimenter (her: 15 Hz). Tilsluttede positioner af de første 500 frames og de sidste 500 frames Vis afdrift. Også, en flettede billede med placeringen af først og den sidste ramme i rød og blå viser en minimal drift. Forskydningen er afstanden mellem centrum af signalerne divideret med den samlede optagetid, her 125 pm/s. (C) Check på den klare adskillelse af signaler, her TMR og SiR. For begge kanaler, blev kumulativ sum billeder fra 3,000 rammens (TMR i kanal 1) og SiR i kanal 2 genereret. SiRHTL var knyttet til Tom20-HaloTag og TMRHTL til OxPhos komplekse V-HaloTag. Farver er falske farver. Skalere barer = 100 nm (B) og 1 µm (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
Fysiske justering af image splitter genererede billeder
Bemærk: Til montering af prøven, forberedt på en coverslip, en self-made prøveholderen kan være brugt (figur 2A). For at undgå støv, låget etc. falder i stikprøven, af kultur parabol løst oven på kammeret, når den er monteret. Samme prøveholderen kan bruges til at montere coverslip med fluorescerende perler eller celler; Når celler er afbildet, tilføje 0,5-0,8 mL imaging medium. Image splitter opdeler billedet i to eller flere spektralt adskilt kanaler og projekter dem side om side på det samme kamera. Denne proces potentielt indfører systematiske skævheder mellem kanaler på grund af forskellige optiske stier gennemkøres og hindrer direkte colocalization analyse. Derfor først udføre fysiske tilpasning og for det andet efter korrektion justering med en transformation matrix. For begge tilpasning processer, bør fluorescerende perler homogen måde fordelt over hele synsfeltet.- Montere den forbehandlede prøve med de fluorescerende perler i prøveholderen mellem polytetrafluorethylen (PTFE)-ring og røde gummiring (figur 2A).
- Start mikroskop, alle hardwarekomponenter og al software til mikroskopi.
- Rens mål og bunden af coverslip med en fnugfri væv tørre chloroformvædet med isopropanol. Derefter tørre begge emner med en frisk fnugfri serviet. Anbring en dråbe immersionsolie på elev af formålet objektivet.
- Placer prøveholderen med perle prøven på mikroskop-scenen, så bunden af coverslip kontakter olien. Fokus på perler ved hjælp af transmission lys eller en laser linje.
- Justere magt af de to excitation lasere at opnå lignende signal intensitet i to fluorescens kanaler. Søgning efter et område med mange forskellige fluorescerende signaler.
- Generere en samlede visning af de fluorescerende kanaler ved hjælp af kamera kontrol software. Derefter bruge skruerne på image splitter til manuelt vippe de interne spejle af image splitter til at opnå den bedste overlejringen af signalerne fra de to fluorescerende kanaler (figur 2B).
Bemærk: opmærksomhed! Overskrid ikke den dynamiske rækkevidde af kameraet.
-
Justering af spektralt adskilt kanaler af software udførelse af rumlige transformation
Bemærk: Den følgende del viser efter korrektion justering og lokalisering procedure med vores software plugin (kan bestilles).- Start JOHANNAS mikroskopet kontrollerende software og vælger at vise individuelle kanaler i live stream-tilstand. Tage et snapshot billede spændende fluorescens i alle kanaler (figur 2 c).
- Brug dette øjebliksbillede billede til at producere matrixen transformation (Se figur 2).
Bemærk: Transformation matrix bruges for en rumlig transformation, typisk en affine, der korrigerer for oversættelse (afvigelse af signaler fra en enkelt punktkilde mellem to kanaler). - Starte software analyse plugin (kan fås på anmodning fra vores lab, se figur 2 c).
- Indlæse tidligere indspillede dobbelt Farvebilleder (Se trin 2.2) af fluorescerende perler i softwaren. Vælg den anvendte orientering af de fluorescerende kanaler. Derefter skal du klikke på 'Ja' når du bliver spurgt for 'kalibrere billeder' og vælge den tidligere taget snapshot.
- Åbn "Enhed MANAGER" for at definere enheden omregningsfaktorer (pixelstørrelse, framerate, foton omregningsfaktor).
- Åbn "LOCALIZATION MANAGER". Bestemme punktet spredes funktion (PSF) først. Tryk på knappen: "PSF radius". I vinduet "PSF Estimator", der åbner, definere den numerisk blænde og maksimal emission. Start "skøn PSF radius" ved at klikke på. Acceptere den opnåede eksperimentelle polyesterfibre. definere boksen evaluering, antallet af deflation loops, og hvor mange kerner på computeren, der bruges til beregningen. Tryk på "lokalisere" for at starte montering intensitet fordelingen af én partikler af en 2D symmetrisk Gaussisk funktion (figur 2 c).
- "Acceptere" den opnåede eksperimentelle polyesterfibre. definere boksen evaluering, antallet af deflation loops, og hvor mange kerner på computeren, der bruges til beregningen. Tryk på "lokalisere" for at starte montering intensitet fordelingen af én partikler af en 2D symmetrisk Gaussisk funktion (figur 2 c).
- Åbn "kalibrering MANAGER". I det afsmeltede flettede billede af de to kanaler vises de oprindelige signaler og de lokaliserede Centre. Vælg "affintilstand". Tilslutte manuelt de tilsvarende par af lokaliserede centre i de to kanaler, der har sin oprindelse fra den samme fluorescerende kugle ved at trække en forbindelse linje.
- Tilslut de tilsvarende signaler fordelt over hele synsfeltet. Efter dette, skal du trykke på "Accepter". Gemme kalibreringen.
Bemærk: Den rumlige transformation er udtaget på hver fluorescerende perle og interpoleret i mellem. Funktionen udpakkede transformation repræsenterer en forskydning felt Δr(x,y), der bruges til efterfølgende rette eksperimentelle tofarvet enkelt molekyle lokaliseringer, således at de overlay inden for deres lokalisering præcision. Matrixen rumlige transformation er typisk en affine, der korrigerer for oversættelse, skalering og rotation mellem kanaler med nanometer nøjagtighed, og det kan udledes af denne manuel en til en-tilknytning (figur 2 c).
Figur 2 : Arbejdsgang for dobbelt farvejustering. (A) coverslip med fluorescerende perler er monteret i en prøveholderen mellem en PTFE og en gummiring. Derefter den øverste og nederste del af salen er boltet sammen. (B) fysisk justering af visningerne kanal, der er genereret af image splitter. Indspillet fluorescerende signaler fra perler (0,1 µm) i to kanaler (grøn og rød, falske farver) flettes. De tilsvarende skruer på den optiske image splitter slås manuelt, indtil den bedste overlejring af de forskellige signaler er opnået (gul farve, nederste panel). (C) Generation af en transformation matrix for post-processive kanal tilpasning. For nøjagtig lokalisering af en partikel er det nødvendigt at bestemme punktet spredes funktion (PSF) i afhængighed af emission bølgelængde og numerisk blænde af målet. I midten af en PSF kan bestemmes af dens intensitet profil analyseret af en symmetrisk todimensionale Gaussisk passer. Den resulterende lokalisering af signal peak er derefter projiceret op på de oprindelige, sløret signaler. De lokaliserede centre for signaler fra to kanaler er forbundet med en flettede billede, for at generere en transformation matrix, der senere bruges til den post-processive justering af eksperimentelle data. Skalere barer = 1 µm (B, C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
Enkelt molekyle billeddannelse af mitokondrielle Membranproteiner
Bemærk: Alle forsøg udføres ved stuetemperatur. T-celler eller ikke-tilhænger celler skal være immobiliseret i Agarosen før imaging31.- Montere modellen med vedhængende celler på coverslip mellem gummi og PTFE ringe (figur 3A). Fyld salen med 0,5-0,8 mL imaging medium.
- Gentag trin 2.2.2–2.2.5.
- Justere belysning vinkel JOHANNAS mikroskop kontrollerende software til at skabe en hændelse vinkel, der er mindre end den kritiske vinkel for TIR-tilstanden til at ophidse den specifik region af interesse via en HILO ark32 (HILO tilstand, figur 1A).
Forsigtig: Undgå direkte øjenkontakt med laserstråle! - Indstillet EM gevinsten og vælge en velegnet til eksperimentet, der indsamler tilstrækkelig fotoner pr. ramme eksponeringstid.
- Indstille laser magt til at opnå et højt signal til støj-(S/N) forhold (figur 3B), da lokalisering præcisionen direkte svarer til S/N33 (figur 3 c).
- Find et område i celle periferien med ikke-overlappende, aflange mitokondrier og enkelt molekyle signaler (figur 3D; Supplerende Video 1). Hvis ingen enkelt molekyle signaler er synlige, vente til blegning resulterer i udseendet af enkelt molekyle signaler (figur 3).
- Optage indtil antallet af signaler er for lavt for rimelig fortsættelse (normalt 1.000-10.000 frames afhængigt af de fluorescerende farvestof, figur 3Fblegning adfærd).
- Start billedbehandling forarbejdning software og check til mitokondrie strukturer ved at generere en kumulativ afsmeltet summen billede af mindst 1.000 registrerede rammer (figur 3 g).
Bemærk: Den hurtigste mulige billedhastighed er dikteret af området udlæsning. Synsfelt for én kanal er reduceret med en dual-farve image splitter (512 x 512 pixel) til 256 x 512 pixel og en Quad-farve til 256 x 256 pixels. For at bruge en image splitter for to farver, er dette således 30 Hz. Indstil indramme transfer mode til at opnå den lavest mulige udlæsning tid. - Starte software analyse plugin og belastning rå data. Vælg kanal orientering og Indlæs billeder. Brug matrixen transformation fra trin 2.3.9 adspurgt for "Calibrate billeder". Kanaler vises separat.
- Åbn "enhed MANAGER" som før for at definere enheden omregningsfaktorer for hver kanal. Åbn "LOCALIZATION MANAGER" for hver kanal. Derefter definere boksen evaluering, antallet af deflation sløjfer, tilføje den teoretiske PSF til de betingelser, der bruges, og angive, hvor mange kerner på computeren, der bruges til beregning. Endelig skal du trykke på "lokalisere" for at få lokaliserede én partikler (figur 3 H; Supplerende Video 2).
- Bemærk at programmet endelig vil generere en kumulativ superresolution billede viser lokaliseret alle partikler (figur 3I).
- Udføre analyse, fxaf open source-software eller vores software til rådighed på anmodning.
- Spore de enkelt molekyler i begge lokaliserede kanaler, fxmed multiple-mål tracer10
Bemærk: Trin 2.4.13 behov foreløbige (eksperimentel) viden om diffusibility af proteiner af interesse at grænseforholdene er indstillet korrekt. Normalt, at finde de korrekte randbetingelser er en iterativ proces.
Figur 3 : Trin under enkelt molekyle lokalisering mikroskopi. (A) A coverslip med modellen er monteret mellem den øverste og nederste del (grå) af hjemmelavet prøveholderen (designet af J. Bereiter-Hahn). En gummiring (rød) og en PTFE ring (hvid) forsegle systemet fra over og under coverslip, når de prøveholderen dele er bolt sammen. (B) Signal støjforhold af TMR signal. (C) beregnet lokalisering præcision histogram for alle lokaliserede partikler. (D) valg af en rimelig område for imaging her, celle periferien med klart adskilte mitokondrier. (E) optagelse og billedbehandling: et enkelt billede med forskellige enkelt molekyle signaler er vist (her, enkelt molekyler af CV-HaloTag/TMRHTL blev optaget). (F) intensiteten af TMR over optagetiden. (G) kumulativ sum billede af 3,000 rammens, uforarbejdet. (H) partikler af CV-HaloTag/TMRHTL lokaliseret med en 2D Gaussisk funktion fra et enkelt billede. (jeg) kumulativ, afsmeltet summen billede viser alle lokaliserede CV-HaloTag/TMRHTL partikler fra 3,000 rammens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multi-farve imaging og colocalization analyse kan hjælpe til at bestemme den sub-organellar lokalisering af proteiner. Vi viste det tidligere med cytosole fosfatase og tensin homolog, PINK1, der har forskellige sub-mitokondrie steder på grund af sin behandling af mitokondrie proteaser17. PINK1 er en vigtig faktor garantere mitokondrie funktionalitet34,35. For at bestemme lokalisering af PINK1 i forskellige mitokondrie rum under sin behandling (figur 4A), multi-farve Super-resolution mikroskopi med levende celler blev udført. Derfor var PINK1 genetisk smeltet til en selvstændig mærkning tag (HaloTag). For at bestemme dens lokalisering i forhold til andre proteiner i funktionelle og dysfunktionelle mitochondrier, blev Tom20, som en del af translocase ydre membran (TOM)36, markeret med en anden selvstændig mærkning tag (SNAP-tag). Tidsserier med mindst 1.000 frames (96 billeder per Sørensen) blev registreret. Den kumulative billede af alle signaler over tid fra en kanal viste at PINK1 var lokaliseret i cytosol og i mitokondrierne (figur 4B, venstre panel) under normale forhold, mens det var bevaret på den ydre membran af () depolariseret mitokondrier behandling med 10 µM af uncoupler carbonyl cyanid m-chlorphenyl hydrazin, CCCP, for 20 min). Tilsvarende bane kortene viser også denne forskel i den spatio-temporale organisation. Som de summerede billeder af lokaliserede partikler afsløre, PINK1 distribueres primært inde polariseret mitokondrier (figur 4 c, venstre øverste panel), mens Tom20 er lokaliseret i den ydre membran (PEØ) (figur 4 c, venstre nederste panel). Dette bliver endnu mere tydeligt i det flettede billede af lokaliserede Tom20 og PINK1 partikler, hvor fordelingen af den ydre membran protein Tom20 er meget bredere (fig. 4 c, højre panel).
Figur 4 : Dobbelt farve Super-resolution mikroskopi viser den subcompartmental lokalisering af PINK1 i mitokondrierne. (A) en hypotese PINK1 shuttling og forarbejdning i mitokondrierne. (B) lokalisering og bane kort over PINK1 under normale forhold og i depolariseret mitokondrier. (C) dobbelt-farve Super-resolution lokalisering mikroskopi til at afsløre mitokondrie lokalisering af PINK1 i forhold til Tom20. Billede serie af 1.000 billeder optaget med en billedhastighed på 96 rammens per s. venstre øverste panel: lokalisering kort over PINK1 (mærket via HaloTag med TMRHTL). Venstre nederste panel: lokalisering kort over Tom20 (mærket via SNAP-Tag med SiRBG). Højre panel: Flet kumulative sum billede af PINK1-TMR (rød) og Tom20-SiR (blå) lokaliseringer. (D) samme data plus lokaliseringer af respiratorisk kompleks jeg (CI, grøn) i den indre mitokondrielle membran. CI var sammenvokset til paGFP (CI-paGFP). Højre: Betyde tværsnit profil af Tom20 (blå), PINK1 (rød) og CI (grøn) Fluorescens i regionen markant i det flettede billede. De gennemsnitlige tværsnit profiler blev fremstillet ved i gennemsnit op til 30 sideløbende orienterede cross linjer (interval 40 nm). Tilpasset version genoptrykt med tilladelse fra Beinlich et al. 16, copyright (2015) ACS kemisk biologi. Alle farver er falske farver. Skalere barer = 1 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
For at kontrollere lokalisering af PINK1 inde mitokondrier, en tredje var protein lokaliseret i den indre mitokondrielle membran også afbildet. Derfor, 30 kDa subunit af respiratorisk kompleks jeg (CI) var sammenvokset til photoactivable normal god landbrugspraksis (paGFP) og indspillet af FPALM4. Den kumulative tredobbelt farvebillede og tværsnit distribution Vis overlejring af CI (grøn) og PINK1 (rød) (figur 4D), bekræfter import af fuld længde PINK1. PINK1 har en N-terminale mitokondrie målretning sekvens og dermed etiketten blev sat på C-terminus af kinase. Co lokalisering med CI viser, at den fulde længde PINK1 havde importeret. Fluorescens distribution langs et udsnit viser, at en kvote på PINK1 partikler tilsyneladende også colocalized med Tom20 i den ydre membran. Sandsynligvis, er dette PINK1 tilknyttet Tom20, som er import receptoren. Som disse data viser, er flere mitokondrielle mikro-rum besat af delpopulationer af PINK1. For at løse dette spørgsmål om sub-mitokondrie lokalisering af biokemiske metoder ville være langt mere vanskelig, da det ville kræve strengere sub fraktionering af forskellige membraner og en klar adskillelse af opløselige komponenter at udelukke krydskontaminering.
Supplerende Video 1: optagelser af enkelt molekyle optagelse, 100 frames, CV-HaloTag/TMR HTL. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Video 2: lokaliseret data. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her, blev en teknik til dobbelt farve enkelt molekyle lokalisering af mobile Membranproteiner præsenteret. Efter protokollen, Membranproteiner er sammenvokset til selvstændig mærkning proteiner, der reagerer med rodamin farvestoffer TMR og SiR konjugeret til deres respektive substrater. Rodamin farvestoffer er lyse og photostable og dermed mulighed for gentagne billeddannelse1. For vellykket præstation skal flere betingelser og kritiske emner holdes for øje.
For det første er det vigtigt at vælge egnede filtre og splittere til at adskille signalerne fra TMR og SiR klart. For at reducere baggrund fra uden for cellen, var en for og belægning af coverslip med PLL-PIND-M.H.T. hjælpsom. Den endelige koncentration af dye-substratet skal afprøves ved at overveje affinitet for selvstændig mærkning enzymet for sit Bæremateriale og tilgængelighed af enzymet inde i cellen. Nano-til picomolar koncentrationer var tilstrækkelige til mitokondrielle proteiner17 og stress granulat13. De krævede koncentrationer skal testes for andre organeller. Hvis farvning er for stærk i starten af optagelsen og ingen enkelt molekyler er identificerbar, er det bedst at vente indtil blegning har reduceret mængden af fluorescerende farvestoffer, således at én partikler (SP) kan skimtes. Vi har fundet, at koncentrationerne af farvestoffer højere end 30 nM for BG-substrater og 1 nM for HTL substrater under proceduren farvning eller længere farvning gange for at øge antallet af mærket molekyler, er ikke mulig. Til hvert eksperiment, intensiteten af excitation laser har skal tilpasses, da subcellulært placeringen af farvestoffet påvirker dens fluorescens adfærd (kvanteudbytte, blegning, blinker)5 på grund af forskellige miljøforhold såsom pH og redox tilstand3. Det skal yderligere være nævnt, at baggrunden er højere i tofarvet eksperimenter i forhold til enkelt farve billeddannelse. Dette påvirker nøjagtigheden af lokalisering. Derfor er det kritisk at optimere laser magt til at opnå god signal til støj (S/N) forhold men lave photobleaching priser. Typisk laser effekttætheder i HILO mikroskopi er i rækken af 25 ± 8 kW/cm2. For finjustering af excitation magt, kan forskellige sæt af neutralfiltre bruges hvis laserdioder er ikke direkte moduleret og ikke moduleret via en akustisk-optisk modulator. Det anbefales at bruge særlige 2 mm tyk spejle for JOHANNAS for at reducere beam forvridninger. Især under TIR- og HILO betingelser, er meget effektiv blokering af excitation lys nødvendig. For enkelt molekyle imaging og lokalisering med subpixel nøjagtighed kræves en ordentlig rumlige sampling hyppighed (Nyquist-Shannon prøveudtagning sætning). Dette bør blive dobbelt så stor som den maksimale rumlige frekvens defineret af opløsning grænsen for billedbehandling system37. Ved hjælp af en oliebestandighedsobjektet med en høj numerisk blænde (NA > 1,4), opløsning, d = λ / (2 × NA), er typisk på 200-250 nm for orange til far-red farvestoffer. Således, i betragtning af den fysiske pixelstørrelse af detektoren, forstørrelse af imaging optik bør resultere i en pixelstørrelse af ca. 100 nm. For en EMCCD kamera med en pixelstørrelse på 16 x 16 µm2 i kombination med en 150 X mål, pixelstørrelse er 106.7 nm og dermed tilstrækkelig.
Generelt, foreslås det at bruge stabile transfekteret celler fordi det har den fordel, at en konstant mængde af mærket proteiner er udtrykt i de fleste af celler24. Dog for dual-farve lokalisering og sporing eksperimenter, ville det kræve en dobbelt Transfektion og dobbelt markering med forskellige antibiotika. Derfor er det ofte mere muligt at forbigående transfect en allerede stabil cellelinie med en anden plasmid kodning den yderligere markeret protein af interesse.
For mitokondrierne er bevægelse og fragmentering et kritisk spørgsmål. Fragmenterede eller flytte organeller bør ikke registreres eller analyseres. Bevægelse kan kontrolleres af overliggende gjort billeder af lokaliserede molekyler fra begyndelsen og slutningen af forsøget, med to forskellige farver, (falsk). En homogen fordeling af signaler fra organeller i overlejringen angiver, at organeller ikke har flyttet. Generelt, stuetemperatur reducerer bevægelse af cellulære forbindelser og strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Biofysik gruppe og Jacob Piehler på universitetet i Osnabrück for kontinuerlig støtte, Wladislaw Kohl for teknisk bistand og udarbejdelse af materiale og CellNanOs bestyrelsen for at levere mikroskoper til brug. Projektet blev finansieret af SFB 944.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES) | Biochrom | #1104E | |
| DC1: Dichroid beam splitter | Chroma | 640 dcxr | NC506031 |
| DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/640rpc | discontinued |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg) | Sigma-Aldrich & Co. | #RNBF8311 | |
| Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l) | Imaging medium | ||
| Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA) | Growth medium | ||
| EF: Emission filter quadbandpass | AHF analysentechnik | F72-866 | Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm |
| EMCCD camera | Andor | Andor iXON 897 | EMCCD camera |
| Emission filter QuadView filter cubes, orange | AHF analysentechnik | F39-637 | bandpass 582 - 619 nm |
| Emission filter QuadView filter cubes, red | Chroma | bandpass 655 - 725 nm (HQ 690/70) | |
| FBS (Fetal bovine serum) superior | Biochrom | S0615 | |
| Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Thermo Fisher Scientific | T7279 | fluorescent microspheres |
| Glutamine | Biochrom | #0951C | |
| HeLa cells | DSMZ | ACC-57 | Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks |
| Hela cells CI::paGFP, stable | Muster et al., PLOSOne 2010 | ||
| Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Image splitter | Photometrics | Dual-View QV2 | image splitter emission |
| Imaging processing software | ImageJ2 / Fiji | freeware | |
| Immersion Oil - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) | Carl Zeiss Jena GmbH | 444960-0000-000 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus IX-71/73/83 | ||
| Laser 561 nm, 200 mW | CrystaLaser | CL-561-200 | 561 nm emission |
| Laser 642 nm, 140 mW | Omicron | Luxx-642-140 | 642 nm emission |
| MATLAB | MathWorks | version R2013a | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR | Biochrom | FG-0385 | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred | Biochrom | FG-0325 | |
| MitoTracker® Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | dye |
| MitoTracker® Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | dye |
| Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber | Pointsource/Qioptiq | KineFLEX | |
| NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer | Rapp Polymere GmbH Tübingen | coverslip coating | |
| non-essential amino acids (NEAA) | Biochrom | #0802E | |
| PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 % | Carl Roth GmbH | Art No. 0263.1 | coverslip coating |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | #0122E | |
| Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression | Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015 | ||
| Poly-L-lysine (1.2 mg/ml) | Sigma-Aldrich & Co. | Cat. No.P9155 | coverslip coating |
| RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) | Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim | coverslip coating / Intergrin receptor motif | |
| Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL) | personal gift from Kai Johnson | dye | |
| Software analysis plugin | self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück | SLIMFAST 16g | |
| Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar) | New England Biolab® | S9105S | dye |
| Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL) | Promega | G8251 | dye |
| TIRF condensor | Olympus | Cell^TIRF MITICO System | TIRF condensor |
| TIRF microscope controlling software | Olympus cellSens 1.12 | ||
| TIRF objective | Olympus | 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO) | |
| Trypsin/EDTA 10x | Biochrom | #0266 | |
| Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic | Carl Roth GmbH | Art. No. HN57.1 |
References
- Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy. Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).
- Appelhans, T., Busch, K. Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells. Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).
- Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy. Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).
- Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific reports. , Available from: https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences (2016).
- Pellett, P., et al. Two-color STED microscopy in living cells. Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79 (2016).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
- Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat Methods. 5 (8), (2008).
- Appelhans, T., Busch, K. B. Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations. Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).
- Wilmes, S., et al. Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane. Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).
- Niewidok, B., et al. Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules. J Cell Biol. , (2018).
- Wurm, C. A., Jakobs, S. Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast. FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).
- Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. Mitochondrial cristae revealed with focused light. Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).
- Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy. ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).
- Shim, S., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).
- Reits, E., Neefjes, J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).
- Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange. Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).
- Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).
- Sukhorukov, V., Dikov, D., Busch, K., Strecker, V., Wittig, I., Bereiter-Hahn, J. Determination of protein mobility in mitochondrial membranes of living cells. Biochimica et biophysica acta. 1798 (11), 2022-2032 (2010).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Graham, F. L., van der Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52 (2), 456-467 (1973).
- Wedeking, T., et al. Spatiotemporally Controlled Reorganization of Signaling Complexes in the Plasma Membrane of Living Cells. Small. 11 (44), 5912-5918 (2015).
- Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. [Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release. J Biol Chem. 280 (1), 715-721 (2005).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells (vol 5, pg 159). Nature Methods. 5 (5), 455 (2008).
- Elmokadem, A., Yu, J. Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference. Biophys J. 109 (9), 1772-1780 (2015).
- Barlag, B., et al. Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes. Sci Rep. 6, 31601 (2016).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Jin, S., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance. Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).
- Yamano, K., Youle, R. J. PINK1 is degraded through the N-end rule pathway. Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).
- Wiedemann, N., et al. Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane. Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).
- Thompson, R., Larson, D., Webb, W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
