Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

محسن المقايسة الصفر للاختبار في المختبر للهجرة الخلية مع كاميرا بصرية الآلي

Published: August 8, 2018 doi: 10.3791/57691
Automatic Translation
1, 1
1Department of Science and Environment, Roskilde University

Summary

هنا يصف لنا إجراء اختبار في الخلية الهجرة في المختبر مع مجهر كاميرا بصرية الآلي. والرزن الصفر قد استخدمت على نطاق واسع حيث يتبع إقفال نقطة الصفر لفترة زمنية محددة. المجهر الضوئي تمكن من كشف خلية الهجرة رخيصة ويمكن الاعتماد عليها.

Abstract

الهجرة الخلية هو عملية هامة يؤثر على جوانب كثيرة من الصحة، مثل التئام الجروح والسرطان، وأنها، لذلك، حاسمة بالنسبة لتطوير أساليب لدراسة الهجرة. والرزن الصفر منذ فترة طويلة في المختبر الأسلوب الأكثر شيوعاً لاختبار المركبات مع خصائص migration المناهضة والمؤيدة بسبب إجراءاتها بسيطة ومنخفضة التكلفة. مشكلة كثيرا ما ذكرت للفحص غير أن تراكم الخلايا عبر الحافة من الصفر. وعلاوة على ذلك، للحصول على البيانات من المقايسة، صور التعرض مختلفة يجب اتخاذ على مدى فترة من الزمن في نفس المكان الدقيق لمقارنة حركات الهجرة. يمكن استخدام برامج التحليل المختلفة لوصف إغلاق الصفر، لكنها العمالة المكثفة، غير دقيقة، ودورات القوات للتغيرات في درجات الحرارة. في هذه الدراسة، ونظهر أسلوب أمثل لاختبار تأثير الهجرة، مثلاً مع البروتينات التي تحدث بشكل طبيعي Lactoferrin الإنسان والأبقار وعلى الطرفي ن الببتيد لاكتوفيريسين على خط الخلية الظهارية هاكات. تحسين حاسم هو الصفر في برنامج تلفزيوني، مما يلغي تراكم الخلايا على طول الحافة الآنفة الذكر ويغسل. ويمكن تفسير ذلك بإزالة الكاتيونات، التي ثبت أن يكون لها أثر على keratinocyte خلية خلية الاتصال. لضمان كشف الحقيقية للهجرة، قبل التعامل مع ميتوميسين ج، مثبط توليف الحمض النووي، تمت إضافة إلى البروتوكول. وأخيراً، علينا أن نظهر الآلي الضوئية الكاميرا، مما يلغي دورات درجة الحرارة المفرطة، والعمل اليدوي مع تحليل إغلاق الصفر، مع تحسين في إمكانية تكرار نتائج وضمان تحليل المقاطع متطابقة من الصفر على مر الزمن.

Introduction

الترحيل هو عملية هامة يؤثر على العديد من الجوانب الفسيولوجية. في التئام الجروح، يسهل الهجرة epithelization إعادة الجلد. في الجروح غير الشفاء، مثل الجروح المزمنة، البكتيريا الانتهازية تسبب العدوى للجرح، والجروح المفتوحة ومثالية لنمو البكتيريا وتشكيل بيوفيلم1،2. بيوفيلم أحد أسباب التنمية لمقاومة البكتيريا، وواحدة من أكبر الإخطار التي تهدد المجتمع الحديث لدينا3. في التئام الجروح، لا يمكن اختراق الخلايا المناعية بيوفيلم. بالسرطان، وهجرة الخلايا السرطانية خطوة محورية لورم خبيث، وهو السبب الرئيسي للوفاة للمرضى الذين يعانون من الأورام الصلبة4،5. ولذلك، من الأهمية بمكان أن يكون قادراً على دراسة الهجرة.

غالباً ما يستخدم المقايسة الصفر لاختبار الهجرة الخلية لأنها رخيصة وسهلة لتنفيذ خطوط الخلية ملتصقة، مثل تنتجها الخلايا الليفية، بطانية، والخلايا الظهارية خطوط6،7. اليوم، توجد عدة طرق لأداء الخدوش8، ووردت مواد مختلفة لاستخدامها، بما في ذلك المسواك9وخلية كاشطات10وأشعة الليزر11والتيارات الكهربائية12. جميع الأساليب مختلفة من إيجابيات وسلبيات، والأسلوب ينبغي البت فيها وفقا لأداة نوع، والميزانية، وتحليل الخلية. على سبيل مثال، إذا كان يتطلب نوع الخلية المستخدمة في طلاء، إزالة الضغط اليدوي، مثلاً مع تلميح مسواك أو ماصة، سوف تؤثر الهجرة داخل المنطقة، ينبغي أن تستخدم أسلوباً مختلفاً. في هذه الدراسة، سوف نركز على إلغاء اليدوي.

الجانب سلبي القشط اليدوي هو تفاوت حجم، وأشكال خدوش، وتراكم الخلايا على الحواف من الصفر. توجد العديد من البروتوكولات، وتنصح ورقة المذكورة عالية زيادة السرعة و/أو غسيل شامل بعد الخدش13. بالإضافة إلى ذلك، استخدمت عدة طرق لتقليل الانتشار، منذ انتشار الخلايا لا يمكن تمييزها عن الهجرة وذلك قد تعطي نتائج إيجابية كاذبة للهجرة. وأفادت بعض الأساليب هي المجاعة المصل السابق لنقطة الصفر14 وتناقص كمية المصل15. غير أن أيا من هذه الأساليب يمكن التأكد من أنه لا يوجد أي انتشار. ولذلك، نحن التقرير معالجة المسبقة للخلايا مع ميتوميسين ج لضمان النتائج الحقيقية للهجرة. ميتوميسين ج هو مضاد حيوي الذي يمنع تركيب الدنا عن طريق تشكيل سندات تساهمية مع الحمض النووي، مما يحول دون فصل16الحمض النووي. قبل التعامل مع ميتوميسين ج والغسيل مع برنامج تلفزيوني قبل الخدش، يوضح الكشف عن إغلاق الفجوة الحقيقية هجرة الخلايا (الشكل 1).

سمة من سمات جميع الأساليب هو الحاجة إلى نظام لتحليل عملية الهجرة17. مشتركة ووسيلة غير مكلفة لتحليل التقدم استخدام مجهر الضوء-الحقل إلى التقاط صور الصفر في نقاط زمنية محددة سلفا، تليها تحليلاً لإغلاق الفجوة في18،برمجيات صورة19. هذا الأسلوب يستغرق وقتاً طويلاً، ولا يمكن الاعتماد عليها فيما يتعلق بالتقاط الصور في نفس المكان والتركيز، وقوات الحركة من حاضنة للكاميرا دورات للتغيرات في درجات الحرارة أثناء التقاط الصور. وقد وضعت أساليب أخرى للكشف عن الهجرة عن طريق قياس التدفق الحالي. التغيرات الراهنة، كخلايا تغطي مساحة أكبر على اللوحة، نصها كزيادة في مقاومة20. بقياس مقاومة، لا يتأثر بيئة الخلايا، وذلك يعتبر الطريقة غير الغازية. يعتمد هذا الأسلوب على لوحات المتخصصة مع أقطاب الذهب، ومكلفة، إلا أنها تتيح الكشف عن العديد من العمليات، مثل انضمام الخلوية والانتشار والهجرة وموت الخلية. عيب كبير من هذا الأسلوب أن قياس مقاومة لا تشير مباشرة إلى الهجرة، كما أن عوامل مثل درجة الحرارة يكون لها تأثير كبير على المقاومة. يمكن أن يكون سبب تغييرات في المقاومة العديد من العوامل التي لا يتم مراجعتها بواسطة البرمجيات، ويزيد من صعوبة تحليل البيانات. ولذلك، يتطلب عدم وجود التصور مجهر خفيفة تقليدية للتحقق من الهجرة.

للتغلب على العديد من الجوانب السلبية للتقنيات المتاحة، نستخدم كاميرا بصرية الآلي في الوقت الحقيقي. الكاميرا الضوئية نظام كشف مع مجهر الفائق في منصة صغيرة مع عدسة، ووحدة إضاءة، وكاميرا رقمية. فقد برمجيات مدمجة، التي يمكن اختبار الهجرة وانتشار من بين أشياء أخرى. وتستخدم اثنين من خوارزميات للكشف عن الهجرة، لتحليل النمو وحركية الهجرة من الخلايا، التي تسمى الانتشار والجرح الشفاء التحليل، على التوالي. يتم تحليل انتشار استناداً إلى خوارزمية تجزئة صورة خطوتين ينطبق تحليل مادة للكشف عن الفرق بين المناطق المغطاة بالخلية (يظهر باللون الأصفر) وفارغة خلفية المناطق بتحليل الرسم البياني المتقدم. ويستند الجرح الشفاء تحليل خوارزمية الخطوات الثلاث التي يكتشف أحادي الطبقة الخلية، يحدد موقع الفجوة الجرح، ويحدد عرض الفجوة. وتجري هذه الخطوات في نقاط زمنية يحددها المستخدم، ويتم تقديم البيانات كمنطقة مغطاة وعرض الفجوة والفجوة في مجال. ومن المزايا الكبيرة لهذا الجهاز أنه يمكن تصوير الخلايا ملتصقة من خلال السائل بسبب زاوية الكاميرا21. توليد الصور لينستاكيس إمالة الكاميرا التي من المتوقع إلى كدسة z z-طائرة واحدة التأكد من وجود الصور في التركيز (الشكل 2). ض-مداخن تم إنشاؤها بواسطة دمج سلسلة الصور (مثلاً 40) اتخذت عمودي على حافة الجرح، وعبر كامل الجرح. ض-رزمة يتيح التقاط عمق طبقة الخلايا، فضلا عن طائرة في التركيز عبر الجرح. وعلاوة على ذلك، يمكن وضع سلسلة الصور معا لمجموعة فيديو من الصور، بنقرة زر واحدة.

علينا أن نظهر بروتوكولا أمثل للكشف عن الهجرة في خط الخلايا keratinocyte هاكات. نحن اختبار Lactoferrin والببتيد على الطرفي ن، لاكتوفيريسين، من البشر والأبقار، لتحليل تأثيرها على الهجرة كما أثبتت هذه الجزيئات للعديد من التطبيقات كمضادات الميكروبات والمناعة تحوير جزيئات22 , 23-كانت مقارنة مع أربعة مركبات من المركبات غير المعالجة هاكات الخلايا وعامل نمو البشرة (لو) كان يستخدم كعنصر إيجابي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الإعداد التجريبية بأي قيود أخلاقية وقانونية، وجرى الاتفاق مع جامعة روسكيلد. لمحة عامة عن طريقة إعداد تجريبية يتبين في الشكل 1 ، وآليات الكاميرا الضوئية في الشكل 2.

1-إعداد

  1. تنفيذ كافة الخطوات في مقعد الاندفاق الصفحي عقيمة بتنظيف مقاعد البدلاء وجميع المعدات مع الإيثانول 70% قبل البدء التجربة.
  2. مكان الكاميرا الضوئية في حاضنة تقليدية في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لضمان أفضل الظروف للخلايا.
  3. تنمو خلايا هاكات في وسائط الإعلام دميم مع 10% FBS والعاشر 1 المضادات الحيوية (البنسلين وستربتوميسين) في قارورة T75.
  4. استخدام التربسين 1 x 1 مل لفصل الخلايا ودون زراعتها كل 3-4 أيام، بتفريق ذلك فوق الطبقة الخلوية. قبل الحرارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.

2-توليد أحادي الطبقة هاكات الخلايا في صفيحة ميكروتيتير 48-آبار

  1. إزالة المتوسطة من قارورة T75 مع ماصة باستور.
  2. يغسل خلايا ملتصقة قارورة بإضافة 5 مل س 1 PBS العقيمة إلى قارورة T75.
    ملاحظة: تأكد من أن برنامج تلفزيوني خال من الكالسيوم والمغنيسيوم.
  3. تعميم برنامج تلفزيوني وإزالته مع ماصة باستور.
  4. كرر الخطوة 2، 2، 2-3.
  5. إضافة التربسين 1 x 1 مل قارورة وتفريق عبر طبقة الخلية.
  6. احتضان قارورة على 37 درجة مئوية في حاضنة تقليدية حتى يتم فصل الخلايا (5-8 دقيقة غير كافية لمعظم خطوط الخلايا).
  7. عرض تحت المجهر إذا كان يتم فصل الخلايا. متى يتم فصل الخلايا، إضافة 9 مل وسائط الثقافة العادية مع 10% FBS لإلغاء تنشيط التربسين 1 x.
  8. حساب الخلية التي تحتوي أما هيموسيتوميتير، عداد كولتر أو ما شابه.
    ملاحظة: يمكن استخدام تريبان الأزرق لعرض الخلايا الميتة. ومع ذلك، في التربسين 1 x هاكات الخلايا هي تماما جولة عندما كان على قيد الحياة.
  9. نقل 7.5 × 104 خلايا/بئر في 250 ميليلتر 10% FBS وسائط إلى لوحة القاع المستديرة زراعة الأنسجة 48-جيدا (لوحة القياسية).
    ملاحظة: يمكن أيضا إعداد المقايسة في 6-12-، 24-أو لوحات 96-جيدا، وكلها يمكن أن تكون جزيئي تحت المجهر الضوئي.
  10. تحرك بلطف اللوحة من جانب إلى جانب للتأكد من الخلايا تنتشر على قدم المساواة في الآبار، أو سيتم جمع الخلايا في مركز الآبار. فحص تحت مجهر خفيفة للتأكد من أن الخلية ينتشر بالتساوي في وسائل الإعلام
  11. وضع اللوحة حاضنة2 CO تقليدية في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو حتى الخلايا انضمت إلى الجزء السفلي من الآبار.

3-إضافة المحفزات لآثار الهجرة

  1. تحقق إذا كانت الآبار روافد 90-95% تحت مجهر خفيفة.
  2. إعداد 10 ميكروغرام/مل من mitomycin C في مبلغ مناسب من المتوسط.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، يتم الاحتفاظ "ميتوميسين ج" في 4 درجات مئوية في حل أسهم في 1 ملغ/مل. ويمكن تخزين mitomycin C في حل لمدة أسبوع واحد في الظلام في 2-8 درجة مئوية.
  3. قم بإزالة وسائط المستهلك مع ماصة باستور من كل بئر.
  4. إضافة 250 ميليلتر 5 ميكروغرام/مل من mitomycin C لكل بئر.
  5. احتضان لوحة ح 2 في CO 37 درجة مئوية و 5%2.
  6. تحضير محفزات الببتيدات بتمييع منهم في مبلغ مناسب من المتوسط.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، جرى اختبارها كل البشر والبقر Lactoferrin ولاكتوفيريسين في 25 ميكروغرام/مل في وحدة تخزين من 250 ميليلتر
  7. إزالة المتوسطة مع ميتوميسين ج مع ماصة باستور.
  8. غسل الآبار x 1 مع 250 ميليلتر من 1 × برنامج تلفزيوني (درجة حرارة الغرفة) وإزالة الغسيل مع باستور "الماصة؛".
  9. إضافة 250 ميليلتر من 1 x PBS والصفر يدوياً الآبار عمودياً مع تلميح ماصة 200 ميليلتر. استخدام تلميح ماصة جديدة لكل بئر.
  10. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 250 ميليلتر الببتيد المحفزات.
  11. جبل اللوحة في نظام التصوير الضوئي عن طريق ضبط الخناق على كلا الجانبين من اللوحة. اترك الغطاء على لوحة ميكروتيتير.
    ملاحظة: يمكن أن تعمل الكاميرا مع الغطاء مفتوح إذا لزم الأمر.

4. قم بإعداد البرنامج للكاميرا الضوئية على الكمبيوتر

  1. انقر فوق الحصول على شريط المهام على اليسار.
  2. اختر دالة التئام الجروح في شريط المهام على اليسار.
  3. اختر نوع لوحة بالنقر فوق لوحة الرسم التوضيحيأدناه.
  4. إلغاء تحديد الآبار، ولا تكون قيد الاستعمال، بوضع علامة عليها، ثم انقر فوق تمكين في الجانب الأيسر العلوي على الشاشة.
    ملاحظة: يتم تحديد جميع الآبار بشكل افتراضي.
  5. ضبط تركيز العدسة على الآبار لتناسب موقف الخلايا بالنقر على أحد الآبار.
    ملاحظة: يمكن أيضا تعديل ضبط تلقائي يدوياً بتحريك الشريط على يمين لوحة الرسم التوضيحي.
  6. تعيين الفترة الزمنية للصور ضمن الفاصل الزمني للصورة (مثلاً (00: 30:00)).
  7. تعيين عدد التكرار لتناسب الفترة المطلوبة (مثلاً 97 من التكرار).
  8. بدء التشغيل بواسطة النقر فوق زر ابدأ في الزاوية اليمنى السفلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هاكات خط خلايا keratinocyte، أحد أنواع الخلايا الأكثر وفرة في الجلد. عند حدوث جرح، تبدأ خلايا الجلد تتكاثر وتهاجر عبر إلى السرير الجرح لإغلاق الجرح (الشكل 3). كلتا العمليتين، لذلك، أهمية قصوى للعلاج السليم.

يمكن تتبع الكاميرا الضوئية كلتا العمليتين في الوقت الحقيقي. للهجرة، ويعطي هذا النظام ثلاث مجموعات من البيانات: خلية تغطي المنطقة وعرض الفجوة والفجوة في المنطقة. عند رصد الخدوش تعامل مع Lactoferrin، أو لاكتوفيريسين، أو لو، المجهر الضوئي يسمح لنا برصد هذه المعايير الثلاثة على مر الزمن. بعد حضانة ح 48، نلاحظ أنه لو أدى إلى إغلاق 95% من الجرح، مقارنة بإغلاق 38% من عنصر التحكم غير المعالجة (الشكل 3A). توضع إصدارات مختلفة من Lactoferrin ولاكتوفيريسين بين 33% وإغﻻق الجرح 62% مع الببتيدات يجري أكثر فعالية من البروتينات الأصل. يمكن أيضا أن تكون النسبة المئوية لإغلاق الجرح، تحدد من التغييرات في عرض الفجوة من البداية الأولى، المرسومة (الشكل 3B).

وعندما تهاجر الخلايا، هي سلسلة من الخطوات المطلوبة24هاكات الخلايا إلى تفاعل قوي خلية خلية. قريبا، الخلايا الرائدة تعطيل الموقع للالتصاق، وبرز، وعقد سيتوسكيليتون لنقل25. يمكن بسهولة عرض بروز الخلايا الرائدة مع الكاميرا الضوئية (الشكل 4).

Figure 1
الشكل 1 : مخطط انسيابي التخطيطي للمقايسة الصفر لاختبار الهجرة على كاميرا بصرية- خلايا هاكات مطلي على لوحة 48-جيدا ويسمح بالانضمام ح 24. تعامل الخلايا مسبقاً مع ميتوميسين ج عن ح 2 تحول دون انتشار، وهو إجراء الصفر وتليها إضافة المحفزات الببتيد. يتم إدراج اللوحة في وحدة الكاميرا الضوئية، والهجرة ويتبع ح 48.

Figure 2
الشكل 2 : تقنية المسح الضوئي للكاميرا الضوئية- هو الزاوية وحدة بصرية عدسة الكاميرا الضوئية الآلي في درجة 6.25 إلى المستوى الأفقي إلى تمكين المسح الضوئي من خلال حلول مختلفة مثل الحلول البكتيرية والهاتف الخلوي. تحتوي السلسلة المكتسبة من الصور رصات الصور جميع المحاور، خارج نطاق التركيز وفي التركيز ضمان الصور مع الخلايا في التركيز. تعديل من26.

Figure 3
الشكل 3 : هجرة خلية "هاكات ج" ميتوميسين قبل المعالجة أكثر من 48 ساعة. (A) الكشف عن الهجرة على الكاميرا الضوئية التلقائية كل نصف ساعة ح 48. قبل تعامل الخلايا مع ميتوميسين ج لمنع الانتشار. الخلايا تعامل مع 25 ميكروغرام/مل من إنسانية-أو الأبقار-Lactoferrin (ح-LF أو ب LF) أو-لاكتوفيريسين (ح-لفسين، ب-لفسين). يتم استخدام عامل النمو الظهارية (لو) كعنصر إيجابي في 500 نانوغرام/مليلتر. وتستخدم الخلايا هاكات غير المعالجة كعنصر تحكم. (ب) توضيح الرسم لهجرة العلاجات. النتائج ممثلي ثلاثة مستقلة تدير، وتعطي نتائج إغلاق نسبة الصفر الأولى * p < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001.

Figure 4
الشكل 4 : جاحظ لاميليبوديا من تعامل الخلايا هاكات. لاميليبوديا الخلايا هاكات يتسم بالسهام السوداء. تفاعل قوي خلية-خلية هاكات النتائج في حركة دينامية للخلايا كما أنها تهاجر ويمكن ملاحظتها بسهولة مع مرور الوقت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أهمية الهجرة في دراسات التنمية والتئام الجروح، وعلم المناعة والسرطان قد أدى إلى العديد من الأساليب المختلفة لدراسة الهجرة. يمكن أن تكون الهجرة أما تعبير عن التوسع أو إغلاق الفجوة بالخلايا. يتم اختبار الإغلاق في أغلب الأحيان من الصفر، كما أنه من الأسهل لتنمو الخلايا في أحادي الطبقة ومن ثم جعل الصفر من زراعة الخلايا في شكل محدد8. يوضح دراستنا أسلوب أمثل للخدش اليدوي، كما التقنية سهلة الماجستير ومنخفضة التكلفة. قدمنا ميتوميسين مثبطات توليف الحمض النووي ج، غسل إضافي لتحسين الصفر مقارنة بأساليب نشر18، واستخدام كاميرا بصرية تتيح دراسات الفائق.

مقايسة الصفر في المختبر يتطلب خط خلية ملتصقة يربط بشكل صحيح إلى الجزء السفلي من الآبار والكشف عن الهجرة على الصفر، الانتشار يحتاج إلى أن تحول دون. هاتان السمتان ضرورية للمقايسة. وقد وصفت عدة نهج للكشف عن الهجرة الحقيقية، مع تخفيض تركيز المصل، تجويع الخلية قبل الخدش14, [دمس]، أو مختلف مثبطات 13،27. وبصفة عامة، يمكن استخدام وسائل الإعلام الحرة المصل، ومع ذلك، بعض الخلية الخطوط، مثل خطوط الخلايا الأولية، المصل الحاجة للحركة والبقاء على قيد الحياة عموما. ولذلك، ينبغي الاختيار وفقا لخط الخلية. يمكن أن تكون خطوط الخلايا التي تتطلب طلاء إشكالية في هذا التحليل، كالخدوش اليدوي سوف تخل الطلاء كذلك.

أنواع الخلايا المختلفة تتطلب عدد مختلف من الخلايا لتشكيل أحادي الطبقة المتلاقية اعتماداً على الحجم ومعدل النمو. الخلايا هاكات الالتزام بعد حوالي 4-6 ح ولكن تترك لتسوية بين عشية وضحاها جعل من أحادي الطبقة مستقرة. أحد العيوب الرئيسية للمقايسة الصفر هو خدوش غير النظامية8. في هذه الدراسة، نظهر أن ما قبل الغسيل ببرنامج تلفزيوني وصنع الصفر في برنامج تلفزيوني جديد يقلل من تراكمات من الخلايا التالفة والجرحى على طول الحواف من الصفر. ويمكن تفسير هذا معقول بتقاطع desmosomes ربط الخلايا في الجلد. الوصلات من Ca2 +-تعتمد24 وعن طريق استخدام برنامج تلفزيوني، تتم إزالة الكاتيونات، الذي يمكن أن يضعف التصاق قوي خلية خلية. وبالتالي، استخدام برنامج تلفزيوني يمكن السماح بأفضل إزالة الخلايا على حدة، مما يؤدي إلى تراكم أقل من الخلايا على طول حافة الجرح. وعلاوة على ذلك، التدابير جزء واسع من الآبار في كل لوحة أحجام الكاميرا الضوئية وتتكيف مع الميول في البداية عبر خوارزمية ثلاث خطوات. وبالتالي، ما قبل الغسيل مع برنامج تلفزيوني واستخدام الكاميرا الضوئية، يتم القضاء على مساوئ خدوش اليدوي. Z التراص الصور يجعل التركيز على الخلايا أكثر دقة، ولكن تبعاً لأنواع خلايا مختلفة كيف تنمو، والتركيز يمكن أن يكون مشكلة. إذا كانت الخلايا تنمو أكثر من اللازم، سيتحول تركيز الكاميرا من التركيز للخروج من التركيز. وهكذا، إذا لم يتم استخدام ميتوميسين ج، يمكن أن مفيدة لتعيين التركيز أعلى قليلاً إذا كان سيتم تشغيل برنامج الإعداد التجريبية الخاصة بك لأكثر من 24 ساعة. الكاميرا الضوئية إعداد سهل الذي يدار من خلال جهاز كمبيوتر قياسية مع برنامج سهلة الاستخدام التي يمكن قياس لوحات من 6-إلى 96-جيدا لوحات ميكروتيتير وذا تمكن مختلف اختبار التكوينات. عند اختيار عدد الصور التي يمكن اتخاذها، توجد بعض القيود. إذا تم استخدام لوحة 96، حسنا، عدد الصور التي يمكن للمرء الحصول على فقط يمكن أن تصبح محدودة للفضاء على الكمبيوتر، كمجموعات البيانات الكبيرة، ومن سرعة الكاميرا. إذا كانت هناك حاجة العديد من الصور في تتابع سريع، حركة الكاميرا يمكن أن يكون عاملاً مقيداً، كما أنها تحتاج إلى وقت لفحص كل جيدا.

ويتيح النظام البصري بسيطة لكنها قوية الرصد. صور الصفر ويتم تحليل فيما يتعلق بعملية إغلاق الفجوة ولكن يمكن أن تستخدم أيضا لتحديد الخصائص المورفولوجية للخلايا. البرنامج يمثل الخلايا الصفراء ويترك لون الخلفية الرمادية كميزة قياسية، لتصور أفضل على حافة الجرح، على الرغم من صور raw من الواضح أنه ينبغي أن تكون هناك حاجة مثل المنشورات. وقد الخلايا هاكات التفاعلات الخلية الخلية القوية التي تجعل الهجرة تحدث في ورقة دينامية28. هذه الميزة يجعل من السهل أن نرى لاميليبوديا الخلايا المهاجرة على مر الزمن (الشكل 4).

هذه الدراسة يوضح تأثير البروتينات Lactoferrin وأصدقائهم الببتيدات الطرفي ن المشتقة لاكتوفيريسين، ولو كعنصر إيجابي، ولكن يمكن تعديله لاختبار العقاقير المختلفة، الببتيدات/البروتينات، وتركيبات، كمثبطات أو المنبهات لالتئام الجروح. ويمكن تغيير المقايسة الصفر والأمثل لتناسب مختلف خطوط الخلايا والمركبات التي يمكن أن تؤثر على الهجرة. معا، مع ما منخفضة التكلفة وسهلة الإدارة، هذا التحليل الوصول للغاية لمعظم المختبرات. يمكن استخدام الكاميرا الضوئية لاختبار المخدرات المختلفة، ومثبطات أو المنبهات للهجرة، ولكن أيضا انتشار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

المجلس الدانمركي للبحوث المستقلة والتكنولوجيا والإنتاج، ومنح #4005-00029

Materials

Name Company Catalog Number Comments
oCelloScope BioSense Solution ApS Optical camera
UniExplorer software  BioSense Solution ApS (8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX Gibco 31966-021 Medium for HaCaT
FBS Gibco 10270 Fetal bovine serum
PBS Gibco D837 Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin Sigma P0781 Antibiotics
Trypsin (10x) Sigma T3924
Mitomycin C Tocris 3258 Inhibits proliferation
Microtiter plate Greiner Bio-one 677 180
Incubator Panasonic 37°C, 5% CO2
Hemocytometer Assistent Türk (0.1 mm)
Pipet boy Accu-Jet pro

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the Treatment of Chronic Wounds. Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).
  2. da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing. Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).
  3. Vyas, K. S., Wong, L. K. Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity. Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).
  4. Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces. Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).
  5. Folkman, J. Angiogenesis. Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).
  6. Monsuur, H. N., et al. Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro. Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).
  7. Tang, L., et al. Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization. The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).
  8. Ashby, W. J., Zijlstra, A. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).
  9. Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis. British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).
  10. Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. The effects of energy beverages on cultured cells. Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).
  11. Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay. Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).
  12. Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).
  13. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  14. Räsänen, K., Vaheri, A. TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes. Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).
  15. Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation. Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).
  16. Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).
  17. Stamm, A., Reimers, K., Strauß, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. In vitro wound healing assays - state of the art. BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).
  18. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).
  19. Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 440-451 (2016).
  20. Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study. The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).
  21. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  22. Jenssen, H. Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).
  23. Jenssen, H., Hancock, R. E. W. Antimicrobial properties of lactoferrin. Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).
  24. Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. The desmosome. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).
  25. Ponti, A. Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
  26. Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).
  27. Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
  28. Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).

Tags

علم الأحياء، 138 قضية، والمقايسة الصفر، الهجرة، هاكات، معاملة الببتيد، مجهر ضوئي، وعامل نمو البشرة، Lactoferrin، لاكتوفيريسين
محسن المقايسة الصفر للاختبار <em>في المختبر</em> للهجرة الخلية مع كاميرا بصرية الآلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vang Mouritzen, M., Jenssen, H.… More

Vang Mouritzen, M., Jenssen, H. Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera. J. Vis. Exp. (138), e57691, doi:10.3791/57691 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter