Summary
在这里, 我们描述了一个程序, 以测试的细胞迁移体外与自动光学相机显微镜。刮伤试验已被广泛使用, 在结束后的划痕是一个设定的周期。光学显微镜能够可靠、廉价地检测细胞的迁移。
Abstract
细胞迁移是一个重要的过程, 影响健康的许多方面, 如伤口愈合和癌症, 因此, 这是至关重要的发展方法, 研究的迁移。由于其成本低、操作简单, 在体外检测化合物的抗性和亲迁移性方面一直是最常用的方法。然而, 一个经常报告的问题的检测是积累的细胞跨越边缘的划痕。此外, 为了从化验中获取数据, 不同曝光的图像必须在同一地点拍摄一段时间, 以比较迁移的运动。不同的分析程序可以用来描述的划痕闭合, 但他们是劳动密集型, 不准确, 和力量循环的温度变化。在这项研究中, 我们展示了一个优化的方法来测试的迁移效果,如自然发生的蛋白质人-和牛乳铁蛋白及其 n-末端肽乳铁素在上皮细胞系 HaCaT。一个关键的优化是清洗和刮在 PBS, 这消除了前面的细胞积累沿边缘。这可以通过去除阳离子来解释, 这已经被证明对角质形成细胞的连接有影响。为确保对迁移的真实检测, 在该协议中加入了丝裂霉素 C (DNA 合成抑制剂) 的预处理。最后, 我们演示了自动光学相机, 它消除了过度的温度循环, 手工劳动与划痕分析, 同时提高重现性和确保分析的相同部分的划痕随着时间的推移。
Introduction
迁移是影响几个生理方面的重要过程。在伤口愈合中, 迁移有利于皮肤的重新上皮化。在非愈合伤口, 如慢性伤口, 机会性细菌引起的伤口感染, 开放性伤口是理想的细菌生长和形成生物膜1,2。生物膜是耐药性细菌发展的主要原因之一, 是我国现代社会面临的最大威胁之一3。在伤口愈合过程中, 免疫细胞无法穿透生物膜。在癌症中, 癌细胞的迁移是转移的关键步骤, 这是4、5实体肿瘤患者死亡的主要原因。因此, 能够研究迁移是至关重要的。
擦伤检测通常用于测试细胞迁移, 因为它便宜, 易于执行黏附细胞线, 如成纤维细胞, 内皮, 和上皮细胞线6,7。今天, 有几个方法来执行划痕8, 并报告了不同的材料, 包括牙签9, 电池铲运机10, 激光11, 电流12。所有的方法都有不同的优缺点, 应该根据单元类型、预算和分析工具来确定方法。举例来说, 如果使用的细胞类型需要涂层, 手动减压,如牙签或吸管提示, 将影响在该地区的迁移, 应使用不同的方法。在本研究中, 我们将专注于手工刮擦。
手工刮擦的缺点是大小、划痕的形状和划痕边缘的单元格堆积的变化。许多协议存在, 并且一张高度被引述的纸劝告增加的速度和/或者彻底洗涤在划伤13以后。此外, 还使用了几种方法来最大限度地减少扩散, 因为细胞的增殖不能与移徙区分开来, 因此可能给移徙带来假阳性结果。一些报告的方法是血清饥饿前的14和减少的数量的血清15。然而, 这两种方法都不能确保没有扩散。因此, 我们报告一个前处理细胞丝裂霉素 C, 以确保真正的迁移结果。丝裂霉素 C 是一种抗生素, 它通过与 dna 形成共价键来抑制 dna 合成, 从而防止 dna 分离16。通过对丝裂霉素 C 的预处理, 在刮伤前用 PBS 洗涤, 检测到的间隙闭合显示了细胞的真正迁移 (图 1)。
所有方法的一个特点是需要一个系统来分析迁移17的过程。一个常见的和廉价的方法来分析的进展是使用光场显微镜拍摄的图像的划痕在预先确定的时间点, 然后分析关闭的差距在图像软件18,19。这种方法是费时的, 不可靠的关于拍照在同一地点和焦点, 和运动从孵化器到相机的力量周期的温度变化, 而拍摄。还开发了其他方法, 通过测量电流流量来检测偏移量。目前的变化, 因为细胞覆盖更多的空间在板块上, 这是读取作为增加阻抗20。通过测量阻抗, 细胞的环境不受影响, 因此该方法被认为是无侵入性的。这种方法依赖于专门的板, 金电极, 这是昂贵的, 但它们能够检测到许多过程, 如细胞黏附, 增殖, 迁移和细胞死亡。这种方法的一个很大的缺点是阻抗测量不能直接表示迁移, 因为温度等因素对阻抗有很大的影响。阻抗的变化可能是由软件没有审查的几个因素引起的, 使得对数据的分析更加困难。因此, 缺乏可视化需要常规的光显微镜来验证迁移。
为了克服现有技术的许多缺点, 我们使用实时自动光学相机。光学摄像头是一种检测系统, 具有高吞吐量的显微镜, 在一个小的平台上有透镜, 照明单元, 和数码相机。它有一个内置的软件, 它可以测试迁移和扩散等其他事情。为了检测迁移, 分别用两种算法对细胞的生长和迁移动力学进行了分析, 称为增殖和创面愈合分析。扩散分析是基于两步图像分割算法, 应用纹理分析方法, 通过高级直方图分析来检测细胞覆盖区域 (黄色) 和空背景区域之间的差异。伤口愈合分析是基于三步算法检测细胞单层, 定位伤口间隙, 确定间隙宽度。这些步骤是在用户确定的时间点进行的, 数据显示为覆盖区域、间隙宽度和间隙区域。这台机器的最大优点之一是, 它能够通过液体, 因为相机21的角度来成像粘附细胞。相机 lenstakes 倾斜的图像, 投影到 z 栈的单 z 平面生成, 以确保图片的焦点 (图 2)。z 栈是通过合并的一系列图片 (如40) 垂直于伤口边缘, 并贯穿整个伤口生成。z 栈能够捕捉到细胞层的深度, 以及贯穿伤口的聚焦平面。此外, 该系列图像可以放在一起的图像视频收集, 点击一个按钮。
我们演示了一个优化的协议, 以检测角质形成细胞线 HaCaT 的迁移。我们测试了乳铁蛋白及其 n-端肽, 乳铁素, 从人类和奶牛, 分析其对迁移的影响, 因为这些分子已经证明有许多应用作为抗菌和免疫调节分子22,23. 将四种化合物与未经处理的 HaCaT 细胞进行比较, 并将表皮生长因子 (EGF) 用作阳性对照。
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Protocol
实验设置没有道德和法律上的限制, 并与罗斯基勒大学进行了协商。在图1和图 2中的光学摄像头的机制中可以看到实验装置的概述。
1. 准备
- 在实验开始前, 用70% 乙醇清洗工作台和所有设备, 在无菌层流工作台执行所有步骤。
- 将光学相机放在传统的孵化器中, 37 摄氏度, 5% CO2 , 以确保细胞的最佳条件。
- 在 DMEM 培养基中生长 HaCaT 细胞, 其中有10% 只血清和1x 抗生素 (青霉素和链霉素) 在 T75 瓶中。
- 使用1毫升1x 胰蛋白酶分离细胞和分培养他们每3-4 天, 通过分散它在细胞层。在使用前先加热到室温。
2. 在48井微量滴定板中生成一层 HaCaT 细胞
- 用巴斯德吸管从 T75 瓶中取出培养基。
- 在 T75 瓶中加入5毫升1x 无菌 PBS, 洗涤烧瓶中的黏附细胞。
注:确保 PBS 没有钙和镁。 - 分发 PBS 并用巴斯德吸管将其取出。
- 重复步骤 2.2-2.3。
- 添加1毫升1x 胰蛋白酶到烧瓶, 并分散在细胞层。
- 在传统的孵化器中孵化出37摄氏度的烧瓶, 直到细胞分离 (5-8 分钟足够用于大多数细胞系)。
- 在显微镜下查看细胞是否分离。一旦细胞分离, 添加9毫升的常规培养基和10% 的血清, 以使1x 胰蛋白酶失效。
- 用 hemocytometer、库尔特计数器或类似的计数单元格。
注:台盼蓝可用于查看死细胞。然而, 在1x 胰蛋白酶 HaCaT 细胞是完全圆的, 当活着。 - 转移 7.5 x 104细胞/井在250µL 10% 血清介质到一个圆底的48井组织培养板材 (标准板材)。
注: 还可以在6、12、24或96井板中设置化验, 所有这些都可以在光学显微镜下测定。 - 轻轻地将盘子从一侧移到一边, 以确保细胞在井中均匀传播, 否则细胞将聚集在水井的中心。在光显微镜下检查以确保电池在介质中均匀传播。
- 把盘子放在传统的 CO2孵化器中, 一夜之间37摄氏度, 或者直到细胞粘在井底。
3. 增加对移徙影响的刺激
- 检查油井是否在光镜下90-95% 汇合。
- 在适量的培养基中制备10µg/毫升丝裂霉素 C。
注:在本研究中, 丝裂霉素 C 在1毫克/毫升的库存溶液中保持在4摄氏度。丝裂霉素 C 在溶液中可以储存至多一个星期在黑暗中2-8 °c。 - 用巴斯德吸管从每个井中取出所用的介质。
- 添加250µL 5 µg/毫升丝裂霉素 C 的每一个井。
- 在37摄氏度和 5% CO2上孵育2小时的板材。
- 通过稀释适量的培养基来制备肽的刺激物。
注:在这项研究中, 人和牛乳铁蛋白和乳铁素的测试在25µg/毫升的数量250µL - 用德霉素 C 去除培养基, 用巴斯德吸管取出。
- 用250µL 1x PBS (室温) 冲洗井 1x, 用巴斯德吸管去除洗涤液。
- 添加250µL 1x PBS 和手动划伤井垂直与200µL 吸管提示。为每个井使用新的吸管尖端。
- 取出 PBS 并添加250µL 肽刺激。
- 通过调整板两侧的螺钉, 将板安装在光学摄像系统中。把盖子放在微量滴定板上。
注:如有必要, 相机可以在盖子打开的情况下操作。
4. 为计算机上的光学摄像机设置程序
- 单击左侧任务栏中的 "获取"。
- 选择左侧任务栏中的功能伤口愈合。
- 通过点击板块插图, 选择板块类型。
- 取消选择未使用的井, 标记它们并单击屏幕左上角的 "启用"。
注:默认情况下, 所有井都被选中。 - 用右键单击其中一个井, 调整井上透镜的焦距, 以适应细胞的位置。
注:自动对焦也可以手动调整, 通过移动栏的右侧的板块插图。 - 设置图片间隔(如(00:30:00)) 中图像的时间段。
- 将重复次数设置为适合所需周期 (例如97 重复)。
- 通过单击右下角的 "开始" 按钮开始运行。
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Representative Results
HaCaT 是角质细胞系, 是皮肤中最丰富的细胞类型之一。当伤口发生时, 皮肤细胞开始增殖并迁移到伤口床上以闭合伤口 (图 3)。因此, 这两个过程对正确愈合至关重要。
光学摄像头可以实时跟踪这两个过程。对于迁移, 系统提供三个数据集: 单元格覆盖区域、间隙宽度和间隙区域。当监测用乳铁蛋白、乳铁素或 EGF 处理的划痕时, 光学显微镜允许我们随时监控这三参数。在48小时的孵化后, 我们观察到表皮生长因子导致95% 的伤口闭合, 而未治疗的控制38% 闭合 (图 3A)。不同版本的乳铁蛋白和乳铁素被放置在33% 和62% 之间的伤口闭合与肽比母蛋白更有效。伤口闭合的百分比, 确定从间隙宽度的变化从最初的划痕, 也可以绘制 (图 3B)。
HaCaT 细胞具有较强的细胞相互作用, 当细胞迁移时, 需要一系列步骤24。不久, 主导细胞扰乱他们的黏附力, 凸出, 并收缩细胞骨架移动25。通过光学相机可以轻松地查看前导单元格的凸出 (图 4)。
图 1: 在光学相机上测试迁移的划痕试验示意图.HaCaT 细胞被镀在一个48井板上, 允许坚持24小时。用丝裂霉素 C 对细胞进行2小时预处理, 以抑制增殖, 并进行擦伤, 然后加入多肽刺激。该板入到光学相机的单位 , 并遵循 48 小时的迁移。
图 2: 光学相机的扫描技术.自动光学相机的光学透镜单元是6.25°到水平平面的角度, 通过各种解决方案如细菌和蜂窝解决方案进行扫描。所获得的一系列图像包含所有焦点的图像栈, 无论是聚焦还是焦点, 以确保图像与单元格集中。修改自26。
图 3: 经预处理的丝裂霉素 C HaCaT 细胞迁移48小时以上.(A)每半小时在自动光学相机上检测到 48 h 的移徙情况。用丝裂霉素 C 预处理细胞, 抑制增殖。细胞用25µg 或牛乳铁蛋白 (h-lf 或 b if) 或-乳铁素 (h-LFcin, b-LFcin) 治疗。上皮生长因子 (EGF) 被用来作为一个积极的控制在 500 ng/毫升。未经治疗的 HaCaT 细胞被用作控制。(B)处理移徙的图解说明。结果为三独立运行的代表, 结果以百分比闭合的初始划痕 * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001。
图 4: 突出 lamellipodia 治疗的 HaCaT 细胞.HaCaT 单元格的 Lamellipodia 由黑色箭头标记。HaCaT 细胞的强相互作用会导致细胞迁移时的动态运动, 并且可以很容易地观察到。
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Discussion
移徙在发展、创伤愈合、免疫学和癌症研究中的重要性导致了研究迁移的几种不同方法。迁移可以是由单元格扩展或关闭间隙的表达式。最常见的抓痕的闭合是测试, 因为它是更容易种植细胞在单层, 然后做一个擦伤比生长的细胞在特定的形式8。我们的研究表明, 手工抓伤的优化方法, 因为该技术是易于掌握和低成本。我们介绍了 DNA 合成抑制剂丝裂霉素 C, 一个额外的清洗, 以优化的划痕相比, 公布的方法18, 和使用的光学相机, 允许高通量的研究。
体外抓痕试验需要一个粘附细胞系, 适当地结合在井底, 并发现在一个擦伤的迁移, 扩散需要抑制。这两个特点是必不可少的化验。为了检测真正的迁移, 一些方法已被描述降低血清浓度, 饥饿的细胞之前, 抓14, 亚砜, 或各种抑制剂13,27。一般情况下, 可以使用无血清的培养基, 但是, 某些细胞系, 如原发细胞线, 需要血清进行运动和整体生存。因此, 应根据细胞线进行选择。需要涂层的细胞线在这个化验中可能会有问题, 因为手动划痕也会扰乱涂层。
不同的细胞类型需要不同数量的细胞组成一个汇合的单层, 取决于它们的大小和生长速率。HaCaT 细胞在约4-6 小时后坚持, 但留在过夜, 使稳定的单层。划痕试验的主要缺点之一是不规则划痕8。在这项研究中, 我们表明, 用 pbs 进行预清洗, 并使新 pbs 的划痕减少了受伤和受损细胞沿擦伤边缘的堆积。这可能由连接细胞在皮肤的桥粒连接点解释。连接点是 Ca2 +依赖性24和使用 PBS, 阳离子被去除, 可能削弱强细胞黏附力。因此, 使用 PBS 可以更好地单独去除细胞, 导致在伤口边缘的细胞积累较少。此外, 光学相机测量了所有板块大小的水井的广泛部分, 并通过其三步算法适应排架。因此, 通过与 PBS 的预清洗和使用光学相机, 消除了手工划痕的缺点。图像的 z 叠加使聚焦细胞更加精确, 但取决于不同细胞类型的生长方式, 焦点可能是一个问题。如果细胞长得太多, 相机的焦点将从焦点转移到焦点之外。因此, 如果不使用丝裂霉素 C, 如果您的实验装置运行超过24小时, 则将焦点设置得稍高一点是有利的。光学相机有一个简单的设置, 通过一个标准的计算机操作, 一个直观的软件, 可以测量6至96井微量滴定板, 从而使各种测试设置。在选择要拍摄的图像数量时, 很少有限制。如果使用96井板, 则可以获得的图片数量仅限于计算机上的空间, 因为数据集可以变得很大, 并且通过照相机的速度。如果需要快速连续拍摄许多图片, 相机的移动可能是一个限制因素, 因为它需要时间来扫描每个井。
光学系统能够实现简单而强大的监控。对间隙闭合的过程进行了分析, 同时也可用于细胞的形态学表征。该软件标记的细胞黄色, 并留下背景颜色灰色作为一个标准的功能, 以更好地可视化的伤口边缘, 虽然原始图像显然是可用的,如出版物需要。HaCaT 细胞具有强的细胞相互作用, 使迁移发生在动态表28中。通过此功能, 可以很容易地看到迁移单元格 lamellipodia 的时间 (图 4)。
本研究表明蛋白质乳铁蛋白及其衍生的 n-末端肽乳铁素和 EGF 作为一个积极的控制, 但可以修改, 以测试不同的药物, 肽/蛋白质, 和组合, 作为抑制剂或刺激伤口愈合。擦伤试验可以改变和优化, 以适应各种细胞系和化合物, 可以影响迁移。同时, 由于成本低廉且易于管理, 大多数实验室都可以使用这种检测方法。该光学相机可以用来测试不同的药物, 抑制剂或刺激的迁移, 但也扩散。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
丹麦独立研究、技术和生产理事会, 赠款 #4005-00029
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| oCelloScope | BioSense Solution ApS | Optical camera | |
| UniExplorer software | BioSense Solution ApS | (8.0.0.7144 (RL3)) | |
| HaCaT cell | Donated from Bispebjerg Hospital | ||
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | Medium for HaCaT |
| FBS | Gibco | 10270 | Fetal bovine serum |
| PBS | Gibco | D837 | Without Mg+ and Ca2+ |
| Pencillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | Antibiotics |
| Trypsin (10x) | Sigma | T3924 | |
| Mitomycin C | Tocris | 3258 | Inhibits proliferation |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 677 180 | |
| Incubator | Panasonic | 37°C, 5% CO2 | |
| Hemocytometer | Assistent | Türk (0.1 mm) | |
| Pipet boy | Accu-Jet pro |
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