Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Optimeret Scratch Assay for In Vitro test af celle Migration med en automatiseret optisk kamera

Published: August 8, 2018 doi: 10.3791/57691
Automatic Translation
1, 1
1Department of Science and Environment, Roskilde University

Summary

Her beskriver vi en metode til at teste celle migration i vitro med en automatiseret optisk kamera mikroskop. Scratch analysen har været meget udbredt, hvor lukningen af bunden er fulgt for en nærmere fastsat periode. Optisk mikroskop giver mulighed for pålidelige og billige påvisning af celle migration.

Abstract

Celle migration er en vigtig proces, der påvirker mange aspekter af sundhed, såsom sårheling og kræft, og det er derfor afgørende for at udvikle metoder til undersøgelse af migration. Scratch analysen har længe været den mest almindelige in vitro- metode til at teste stoffer med anti og pro migration egenskaber på grund af sin lave omkostninger og enkel procedure. En ofte rapporteret problemet med analysen er imidlertid ophobning af celler i hele kanten af bunden. Desuden, for at hente data fra analysen, billeder af forskellige engagementer skal tages over en periode på præcis samme sted at sammenligne bevægelser af migration. Forskellige analyse programmer kan bruges til at beskrive de scratch lukning, men de er arbejdskrævende, unøjagtige, og styrker cyklusser af temperaturændringer. I denne undersøgelse viser vi en optimeret metode til afprøvning migration virkning, fx med de naturligt forekommende proteiner menneskelige - og kvæg-Lactoferrin og deres N-terminale peptid Lactoferricin på linjen epitelcelle HaCaT. En afgørende optimering er at vaske og ridse i PBS, som eliminerer den førnævnte ophobning af celler langs kanten. Dette kan forklares ved fjernelse af kationer, som har vist sig at have en effekt på keratinocytter celle-celle forbindelse. For at sikre korrekt registrering af migration, blev før behandling med mitomycin C, en DNA syntese hæmmer, tilføjet til protokollen. Endelig, vi vise automatiseret optisk kameraet, hvilket eliminerer uforholdsmæssigt store temperatur cyklusser, manuel arbejdskraft med scratch lukning analyse, samtidig med at forbedre på reproducerbarhed og sikre analyse af identiske dele af scratch over tid.

Introduction

Migration er en vigtig proces, der påvirker flere fysiologiske aspekter. I sårheling letter migration re epithelization af huden. I ikke-healing sår, såsom kroniske sår, opportunistiske bakterier forårsager infektion i såret, og åbne sår er ideelle til bakterievækst og dannelse af biofilm1,2. Biofilm er en af årsagerne til udviklingen af resistente bakterier, som er en af de største trusler mod vores moderne samfund3. I sårheling, immunceller ikke kan trænge igennem biofilm. I kræft er migration af kræftceller et afgørende skridt på metastaser, som er den primære dødsårsag for patienter med solide tumorer4,5. Derfor er det afgørende at kunne studere migration.

Scratch analysen er ofte bruges til at teste celle migration, fordi det er billigt og let at udføre på vedhængende cellelinjer, såsom fibroblast, endotel, og epitelcelle linjer6,7. I dag findes flere metoder til at udføre ridser8, og forskellige materialer er blevet rapporteret til at blive brugt, herunder tandstikkere9, celle skrabere10, lasere11og elektrisk strøm12. Alle metoderne har forskellige fordele og ulemper, og metoden bør besluttes efter celle type, budget og analyse værktøj. Som et eksempel, hvis den anvendte celletype kræver belægning, manuel pres fjernelse, fx med en tandstikker eller pipette tip, vil påvirke migration inden for området, en anden metode bør anvendes. I denne undersøgelse, vil vi fokusere på manuel afskrabning.

En ulempe for manuel afskrabning er variation af størrelsen, former for ridser og ophobning af celle på kanten af bunden. Mange protokoller findes, og en meget citeret papir rådgiver øget hastighed og/eller grundig vask efter skrabe13. Derudover er flere metoder blevet brugt til at minimere spredning, da spredning af cellerne ikke kan skelnes fra migration og derfor kan give falsk-positive resultater af migration. Nogle rapporterede metoder serum sult forud for de scratch14 og mindske mængden af serum15. Ingen af disse metoder kan dog sikre, at der er ingen spredning. Derfor kan vi rapportere en forbehandling af celler med mitomycin C at sikre ægte resultater af migration. Mitomycin C er et antibiotikum, der hæmmer DNA-syntese ved at danne et kovalente bånd med DNA, som forhindrer DNA fra adskille16. Før behandling med mitomycin C og vask med PBS før ridser, viser fundne lukning af hullet den sande migration af celler (figur 1).

Karakteristisk for alle metoderne, der er behov for et system til at analysere processen med migration17. En fælles og en billig metode til at analysere fremskridt, der er at bruge en lys-felt mikroskop til at tage billeder af bunden på forud fastsatte tidspunkter, efterfulgt af en analyse af lukning af hullet i et billede software18,19. Denne metode er tidskrævende, upålidelige med hensyn til at tage billeder på samme sted og fokus, og bevægelsen fra inkubator til kamera styrker cyklusser af temperaturændringer, mens billeder er taget. Andre metoder er blevet udviklet til at opdage migration ved at måle den aktuelle flow. De aktuelle ændringer, som cellerne dække mere plads på den plade, som er læst som en forøgelse af impedans20. Ved at måle impedans, miljø i cellerne påvirkes ikke, og metoden er derfor anses for ikke-invasiv. Denne metode bygger på specialiserede plader med guld elektroder, som er dyre, men de muliggøre påvisning af mange processer, såsom overholdelse af cellulære, spredning, migration og celledød. En stor ulempe ved denne metode er, at impedans måling ikke direkte angive migration, som faktorer, såsom temperatur har en stor indvirkning på impedans. Ændringer i impedans kan være forårsaget af flere faktorer, der ikke er gennemgået af den software, gør analysen af data mere vanskeligt. Derfor kræver manglen på visualisering en konventionel lysmikroskop at kontrollere migrering.

For at overvinde mange af ulemperne af de tilgængelige teknikker, bruger vi en real-time automatiseret optisk kamera. Den optiske kamera er en detection system med en høj overførselshastighed mikroskop i en lille platform med en linse, belysning enhed og et digitalt kamera. Det har en indbygget software, som kan teste overførsel og spredning blandt andre ting. For at påvise en migration, bruges to algoritmer til at analysere væksten og migration kinetik af celler, der kaldes spredningen og den sårheling analyse, henholdsvis. Spredning analyse er baseret på en to-trins image segmentering algoritme, der anvender tekstur analyse for at registrere forskellen mellem celle-dækkede områder (vist med gult) og tom baggrund områder af avancerede histogram analyse. Sårheling analyse er baseret på en tre-trins algoritme, der registrerer den celle éncellelag, lokaliserer sår hul og bestemmer mellemrumsbredden. Disse trin er gennemført på bruger-bestemt tidspunkt-point, og data præsenteres som overdækket areal, Mellemrumsbredde og gap område. En af de store fordele ved denne maskine er, at det muliggør billeddannelse af vedhængende celler gennem væske på grund af vinklen af kamera21. Lenstakes skrå kamerabilleder, der er fremskrevet til en z-stak en enkelt z-fly generere for at sikre, at billederne er i-fokus (figur 2). z-stakke genereres ved at flette serien af billeder (f.eks. 40) taget vinkelret på såret kanten og på tværs af hele såret. Z-stakke kan indfange af dybden af cellelag samt en i-fokus flyet på tværs af såret. Desuden, serien af billeder kan sættes sammen til en video samling af billeder, med et klik på en knap.

Vi demonstrere en optimeret protokol til påvisning af migration i linjen keratinocytter celle HaCaT. Vi testede Lactoferrin og dens N-terminale peptid, Lactoferricin, fra mennesker og køer, til at analysere deres effekt på migration som disse molekyler er blevet påvist for at have mange programmer som antimikrobielle og immun modulerende molekyler22 , 23. de fire forbindelser blev sammenlignet med ubehandlet HaCaT celler og epidermal vækstfaktor (EGF) blev anvendt som positiv kontrol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opsætningen af eksperimenterende har ingen etiske og juridiske restriktioner og blev gennemført i samarbejde med Roskilde Universitet. Overblik over den eksperimentelle set-up kan ses i figur 1 og mekanismerne i den optisk kamera i figur 2.

1. forberedelse

  1. Udføre alle trinene i en steril laminar flow-bænk ved rengøring af bænken og alle udstyr med 70% ethanol forud for starten af forsøget.
  2. Placer den optisk kamera i en konventionel inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 at sikre optimale forhold for cellerne.
  3. Vokse HaCaT celler i DMEM medier med 10% FBS og 1 x antibiotika (penicillin og streptomycin) i en T75 kolbe.
  4. Brug 1 mL 1 x trypsin at frigøre cellerne og sub dyrke dem hver 3-4 dage, ved at sprede det over det cellulære lag. Pre heat til stuetemperatur før anvendelse.

2. generering af en éncellelag af HaCaT celler i en 48-brønde mikrotiter plade

  1. Fjern mediet fra T75 kolben med Pasteur pipette.
  2. Vaske de vedhængende celler i kolben ved at tilføje 5 mL 1 x steril PBS T75 kolben.
    Bemærk: Sikre, at PBS er fri for calcium og magnesium.
  3. Cirkulere PBS og fjerne det med Pasteur pipette.
  4. Gentag trin 2.2-2.3.
  5. Kolben tilsættes 1 mL 1 x trypsin og sprede det på tværs af cellelag.
  6. Inkuber kolben ved 37 ° C i en konventionel inkubator, indtil cellerne er frakoblet (5-8 min. er tilstrækkelig for de fleste cellelinjer).
  7. Se under mikroskop, hvis cellerne er frakoblet. Når cellerne er frakoblet, tilføje 9 mL af den almindelige kultur medier med 10% FBS til at inaktivere 1 x trypsin.
  8. Tælle celle med enten en hemocytometer, coulter-counter eller lignende.
    Bemærk: Trypan blå kan bruges til at se døde celler. Dog runde celler perfekt i 1 x trypsin HaCaT når i live.
  9. Overføre 7,5 x 104 celler/brønd i 250 µL 10% FBS medier til en rundbundet 48-godt vævskultur plade (standard plade).
    Bemærk: Assay kan også sættes op i 6 - 12-, 24- eller 96-brønd plader, som alle kan analyseres under optisk mikroskop.
  10. Flytte forsigtigt pladen fra side til side for at sikre, at cellerne er ligeligt fordelt i brøndene, eller cellerne samles i midten af brøndene. Inspicere under et lysmikroskop sørge for cellen er jævnt fordelt i medierne
  11. Sæt pladen i en konventionel CO2 inkubator ved 37 ° C natten over eller indtil cellerne har levet op til bunden af brøndene.

3. tilsætning af Stimuli for Migration effekter

  1. Kontrollere hvis brøndene er 90-95% sammenflydende under et lysmikroskop.
  2. Forbered dig 10 µg/mL for mitomycin C i en passende mængde af mediet.
    Bemærk: I denne undersøgelse opbevares Mitomycin C ved 4 ° C i en stamopløsning på 1 mg/mL. Mitomycin C i løsning kan gemmes til en uge i mørke ved 2-8 ° C.
  3. Fjern de brugte medier med Pasteur pipette fra hver brønd.
  4. Tilsæt 250 µL af 5 µg/mL for mitomycin C til hver brønd.
  5. Inkuber plade i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
  6. Forberede stimuli af peptider ved fortynding af dem i en passende mængde af mediet.
    Bemærk: I denne undersøgelse, blev både menneskelige og kvæg Lactoferrin og Lactoferricin testet på 25 µg/mL i et volumen på 250 µL
  7. Fjern mediet med mitomycin C med Pasteur pipette.
  8. 1 x med 250 µL 1 x PBS (stuetemperatur) og fjern vask med en Pasteur afpipetteres brøndene vaskes.
  9. Tilsæt 250 µL 1 x PBS og manuelt scratch wells vertikalt med en 200 µL pipette spids. Bruge en ny pipette tip til hver brønd.
  10. Fjern PBS og tilsæt 250 µL peptid stimuli.
  11. Monter pladen i optisk kamera-system ved at justere skruer på begge sider af pladen. Lad låget på mikrotiter plade.
    Bemærk: Kameraet kan operere med låg åbent, hvis det er nødvendigt.

4. indstillet programmet for den optiske kamera på computeren

  1. Klik på erhverve i proceslinjen i venstre side.
  2. Vælg funktionen sårheling i proceslinjen i venstre side.
  3. Vælg den plade type ved at klikke nedenfor plade illustration.
  4. Uegennyttig wells, ikke er i brug, ved at markere dem og klikke på Aktiver på den øverste venstre side på skærmen.
    Bemærk: Alle brønde er valgt som standard.
  5. Justere fokus linse på wells til at passe placeringen af cellerne ved at højreklikke på en af brøndene.
    Bemærk: Autofokus kan også justeres manuelt ved at flytte linjen til højre for plade illustration.
  6. Angiv periode for billeder under Billede Interval (f.eks. (00: 30:00)).
  7. Angive antallet af gentagelser til at passe den ønskede periode (f.eks. 97 gentagelser).
  8. Start kørslen ved at klikke på Start -knappen i nederste højre hjørne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HaCaT er en keratinocytter cellelinie, en af de mest udbredte celletyper i huden. Når et sår opstår, begynde hudceller at formere sig og vandrer såret seng at lukke såret (figur 3). Begge processer er derfor af største vigtighed for korrekt healing.

Den optiske kamera kan følge begge processer i realtid. For migration, systemet giver tre datasæt: cellen dækket område, Mellemrumsbredde og gap område. Når overvågning ridser behandlet med Laktoferrin, Lactoferricin eller EGF, optisk mikroskop giver os mulighed at overvåge disse tre parametre over tid. Efter 48 h inkubation observerer vi, at EGF har resulteret i 95% lukning af sår, sammenlignet med 38% lukning af ubehandlet kontrol (figur 3A). De forskellige versioner af Lactoferrin og Lactoferricin er placeret mellem 33% og 62% sår lukning med peptider er mere potent end de overordnede proteiner. Procentdelen af sår lukning, bestemt ud fra ændringer i Mellemrumsbredde fra den indledende bunden, kan også være afbildet (figur 3B).

HaCaT celler har en stærk celle-celle interaktion og når cellerne vandrer, række trin er nødvendige24. Kort, de førende celler forstyrre deres site af adhæsion, stikker, og kontrakt cytoskeleton for at flytte25. Fremspring i de førende celler kan let ses med den optiske kamera (figur 4).

Figure 1
Figur 1 : Skematisk rutediagram af scratch analysen at teste migration på en optisk kamera. HaCaT celler er belagt på en 48-godt plade og lov til at holde sig i 24 timer. Cellerne er forbehandlet med mitomycin C i 2 timer til at hæmme spredningen, og bunden er udført og efterfulgt af tilsætning af peptid stimuli. Pladen er indsat i enheden for den optiske kamera, og migration er fulgt for 48 h.

Figure 2
Figur 2 : Optisk kameraet scanningsteknologi. Den optiske linse enhed af den automatiserede optisk kamera er vinklet på 6,25 ° til det vandrette plan at aktivere scanning gennem forskellige løsninger såsom bakteriel og cellulære løsninger. Den erhvervede serie af billeder indeholder billedstakke af alle fokuserer, out-of-fokus og i fokus, at sikre billeder med celler i fokus. Ændret fra26.

Figure 3
Figur 3 : Migration af forbehandlet mitomycin C HaCaT celle over 48 time. (A) Migration er fundet på de automatiserede optisk kamera hver halve time til 48 timer. Cellerne er forbehandlet med mitomycin C til at hæmme spredningen. Cellerne er behandlet med 25 µg/mL af human - eller kvæg-Laktoferrin (H-LF eller B-LF) eller -Lactoferricin (H-LFcin, B-LFcin). Epitelial vækstfaktor (EGF) er anvendt som positiv kontrol på 500 ng/mL. Ubehandlet HaCaT celler anvendes som en kontrol. (B) grafisk illustration af migration af behandlinger. Resultaterne er repræsentanter for tre uafhængige kører, og resultaterne er angivet som en procentdel lukning af den indledende bunden * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Figure 4
Figur 4 : Fremspringende lamellipodia af behandlet HaCaT celler. Lamellipodia af HaCaT cellerne er markeret med de sorte pile. Stærk celle-celle samspillet mellem HaCaT resulterer i dynamisk bevægelse af cellerne, som de overføre og kan let iagttages over tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Betydningen af migration i undersøgelser af udvikling, sårheling, immunologi og kræft har ført til flere forskellige metoder til at studere migration. Migration kan enten være et udtryk for en udvidelse eller lukning af kløften af celler. Oftest lukning af bunden er testet, da det er lettere at dyrke celler i en éncellelag og derefter gøre en skramme end voksende celler i en bestemt form8. Vores undersøgelse viser en optimeret metode til manuel ridser, som teknikken er nem at mestre og lave omkostninger. Vi indførte DNA syntese hæmmer mitomycin C, en ekstra vask til at optimere scratch sammenlignes med offentliggjorte metoder18, og brug af en optisk kamera, der giver høj overførselshastighed undersøgelser.

In vitro- scratch analysen kræver en vedhængende cellelinie, der binder korrekt til bunden af brøndene, og for at påvise migration over en skramme, spredning skal hæmmes. Disse to funktioner er afgørende for analysen. For at opdage sande migration, er flere tilgange beskrevet med sænke serum koncentration, sultende celle før skrabe14, DMSO eller forskellige hæmmere 13,27. Generelt et serumfrit medier kan bruges, men nogle cellelinjer, du som primære cellelinjer, behovet for serum for den frie bevægelighed og den samlede overlevelse. Derfor bør valget foretages ifølge cellelinie. Cellelinjer, der kræver belægning kan være problematisk i dette assay, som manuel ridser vil forstyrre belægningen så godt.

Forskellige celletyper kræver det forskellige antal celler til at danne en sammenflydende éncellelag afhængigt af deres størrelse og vækst sats. HaCaT cellerne overholde efter ca 4-6 h men er overladt til at bosætte sig natten over for at gøre en stabil éncellelag. En af de større ulemper ved scratch analysen er uregelmæssig ridser8. I denne undersøgelse viser vi, at før vask med PBS og gøre bunden i nye PBS mindsker ophobning af sårede og beskadigede celler langs kanten af bunden. Dette kunne plausibelt forklares ved desmosomes krydset forbinder cellerne i huden. Knudepunkter er Ca2 +-afhængige24 og ved hjælp af PBS, kationer er fjernet, som kunne svække den stærke celle-celle vedhæftning. Derved, brug af PBS kan give mulighed for bedre fjernelse af cellerne individuelt, fører til mindre ophobning af celler langs den sår. Derudover optisk kameraet måler en bred del af brønde i alle størrelser, plade og tilpasser sig krumninger i bunden via dets tre-trins algoritme. Dermed er ved forvask med PBS og bruge den optiske kamera, ulemperne ved de manuelle ridser elimineret. Z-stabling billeder gør fokusere på cellerne mere præcise, men afhængigt af hvordan forskellige celletyper vokse, fokus kan være et problem. Hvis cellerne vokse for meget, vil i fokus i kameraet skifte fra i fokus til ud-af-fokus. Således, hvis mitomycin C ikke bruges, kan det være fordelagtigt at indstille fokus lidt højere, hvis dine eksperimentelle installationsprogrammet vil køre i mere end 24 timer. Den optiske kamera har en nem opsætning, der drives gennem en almindelig computer med en intuitiv software, der kan måle plader fra 6 til 96-brønde mikrotiter plader og derfor muliggør forskellige test set-ups. Når du vælger antallet af billeder der skal tages, findes nogle begrænsninger. Hvis en 96-brønd plade der bruges, er antallet af billeder man kan opnå kun begrænset til plads på computeren, som data-sæt kan blive store, og af hastigheden af kameraet. Hvisdeternødvendigt mange billeder i en hurtig rækkefølge, bevægelse af kameraet kan blive en begrænsende faktor, som det kræver tid at scanne hver godt.

Det optiske system giver mulighed for enkel, men kraftfuld overvågning. Billeder af bunden er analyseret med hensyn til processen med lukning af hullet, men kan også bruges til morfologiske karakterisering af cellerne. Softwaren markerer cellerne gule og efterlader baggrundsfarven grå som standardfunktion, bedre visualisere sår kant, selvom rå billeder selvfølgelig er tilgængelige, bør der være behov for fx publikationer. HaCaT cellerne har stærke celle-celle interaktioner, som gør overførslen ske i en dynamisk ark28. Denne funktion gør det nemt at se lamellipodia af de migrerende celler over tid (figur 4).

Denne undersøgelse viser effekten af proteiner Lactoferrin og deres afledte N-terminale peptider Lactoferricin og EGF som positiv kontrol, men kunne blive ændret for at teste forskellige stoffer, peptider/proteiner og kombinationer, som hæmmere eller Stimulatorer af sårheling. Scratch analysen kan være ændret og optimeret til at passe forskellige cellelinjer og forbindelser, der kan påvirke migration. Sammen med sin lave omkostninger og let administration er denne analyse meget tilgængelige for de fleste laboratorier. Den optiske kamera kan bruges til at teste forskellige stoffer, hæmmere eller Stimulatorer til migration, men også spredning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forskningsrådet for uafhængige forskning, teknologi og produktion, yde #4005-00029

Materials

Name Company Catalog Number Comments
oCelloScope BioSense Solution ApS Optical camera
UniExplorer software  BioSense Solution ApS (8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX Gibco 31966-021 Medium for HaCaT
FBS Gibco 10270 Fetal bovine serum
PBS Gibco D837 Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin Sigma P0781 Antibiotics
Trypsin (10x) Sigma T3924
Mitomycin C Tocris 3258 Inhibits proliferation
Microtiter plate Greiner Bio-one 677 180
Incubator Panasonic 37°C, 5% CO2
Hemocytometer Assistent Türk (0.1 mm)
Pipet boy Accu-Jet pro

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the Treatment of Chronic Wounds. Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).
  2. da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing. Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).
  3. Vyas, K. S., Wong, L. K. Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity. Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).
  4. Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces. Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).
  5. Folkman, J. Angiogenesis. Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).
  6. Monsuur, H. N., et al. Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro. Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).
  7. Tang, L., et al. Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization. The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).
  8. Ashby, W. J., Zijlstra, A. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).
  9. Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis. British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).
  10. Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. The effects of energy beverages on cultured cells. Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).
  11. Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay. Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).
  12. Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).
  13. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  14. Räsänen, K., Vaheri, A. TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes. Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).
  15. Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation. Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).
  16. Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).
  17. Stamm, A., Reimers, K., Strauß, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. In vitro wound healing assays - state of the art. BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).
  18. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).
  19. Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 440-451 (2016).
  20. Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study. The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).
  21. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  22. Jenssen, H. Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).
  23. Jenssen, H., Hancock, R. E. W. Antimicrobial properties of lactoferrin. Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).
  24. Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. The desmosome. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).
  25. Ponti, A. Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
  26. Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).
  27. Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
  28. Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).

Tags

Biologi spørgsmålet 138 bunden assay migration HaCaT peptid behandling optisk mikroskop epidermal vækstfaktor Laktoferrin Lactoferricin
Optimeret Scratch Assay for <em>In Vitro</em> test af celle Migration med en automatiseret optisk kamera
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vang Mouritzen, M., Jenssen, H.… More

Vang Mouritzen, M., Jenssen, H. Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera. J. Vis. Exp. (138), e57691, doi:10.3791/57691 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter