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Biology

के लिए अनुकूलित स्क्रैच परख में इन विट्रो एक स्वचालित ऑप्टिकल कैमरा के साथ सेल प्रवास के परीक्षण

Published: August 8, 2018 doi: 10.3791/57691
Automatic Translation
1, 1
1Department of Science and Environment, Roskilde University

Summary

यहां हम एक प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए एक स्वचालित ऑप्टिकल कैमरा माइक्रोस्कोप के साथ इन विट्रो में सेल प्रवास का परीक्षण । खरोंच परख व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है, जहां खरोंच के बंद करने के लिए एक निर्धारित अवधि के बाद है । ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप सेल प्रवास के भरोसेमंद और सस्ते पता लगाने में सक्षम बनाता है ।

Abstract

सेल प्रवासन एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है कि स्वास्थ्य के कई पहलुओं को प्रभावित करता है, ऐसे घाव हीलिंग और कैंसर के रूप में, और यह है, इसलिए तरीकों के विकास के लिए प्रवास के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है । खरोंच परख लंबे इन विट्रो विधि में सबसे आम किया गया है विरोधी के साथ यौगिकों का परीक्षण और समर्थक अपनी कम लागत और सरल प्रक्रिया की वजह से प्रवास गुण । हालांकि, एक अक्सर-परख की समस्या की सूचना दी खरोंच के किनारे भर में कोशिकाओं का संचय है । इसके अलावा, परख से डेटा प्राप्त करने के लिए, अलग जोखिम की छवियों को सटीक एक ही स्थान पर समय की अवधि में लिया जाना चाहिए प्रवास के आंदोलनों की तुलना । विभिंन विश्लेषण कार्यक्रमों के लिए खरोंच बंद का वर्णन किया जा सकता है, लेकिन वे गहन श्रम, गलत कर रहे हैं, और तापमान परिवर्तन के चक्र बलों । इस अध्ययन में, हम प्रवास प्रभाव के परीक्षण के लिए एक अनुकूलित विधि प्रदर्शित करता है, उदाहरण के साथ प्राकृतिक रूप से होने वाली प्रोटीन मानव-और गोजातीय-लैक्टोफेरिन और उनके N-टर्मिनल पेप्टाइड Lactoferricin पर उपकला कोशिका लाइन HaCaT. एक महत्वपूर्ण अनुकूलन को धोने और पंजाब में खरोंच है, जो बढ़त के साथ कोशिकाओं के aforementioned संचय समाप्त होता है । यह cations, जो keratinocyte सेल-सेल कनेक्शन पर एक प्रभाव है दिखाया गया है हटाने के द्वारा समझाया जा सकता है । प्रवास की सही पहचान सुनिश्चित करने के लिए, मीतोमयसीं सी, डीएनए संश्लेषण अवरोधक के साथ पूर्व इलाज, प्रोटोकॉल के लिए जोड़ा गया था । अंत में, हम स्वचालित ऑप्टिकल कैमरा है, जो अत्यधिक तापमान चक्र, खरोंच बंद करने के विश्लेषण के साथ मैनुअल श्रम समाप्त, जबकि reproducibility पर सुधार और समय पर खरोंच के समान वर्गों के विश्लेषण सुनिश्चित करने का प्रदर्शन ।

Introduction

प्रवासन एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है कि कई शारीरिक पहलुओं को प्रभावित करता है । घाव भरने में, माइग्रेशन त्वचा के पुनः उपर्त्वचीकरण की सुविधा देता है । गैर घाव भरने में, इस तरह के जीर्ण घावों के रूप में, अवसरवादी जीवाणु घाव के संक्रमण का कारण है, और खुले घावों जीवाणु विकास और1,2के गठन के लिए आदर्श होते हैं । फिल्म प्रतिरोधी बैक्टीरिया है, जो हमारे आधुनिक समाज3के लिए सबसे बड़ा खतरों में से एक है के विकास के कारणों में से एक है । घाव भरने में, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को इस फिल्म में प्रवेश नहीं कर सकते । कैंसर में, कैंसर कोशिकाओं के प्रवासन मेटास्टेसिस के एक निर्णायक कदम है, जो ठोस ट्यूमर के साथ रोगियों के लिए मौत का प्राथमिक कारण4,5है । इसलिए प्रवास का अध्ययन करने में सक्षम होना महत्वपूर्ण है ।

स्क्रैच परख अक्सर सेल माइग्रेशन परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह सस्ता है और अनुयाई सेल लाइनों पर प्रदर्शन करने के लिए आसान है, जैसे fibroblast, endothelial, और उपकला सेल लाइनों6,7. आज, कई तरीकों8खरोंच प्रदर्शन के लिए मौजूद है, और विभिंन सामग्रियों के लिए इस्तेमाल किया जा रिपोर्ट किया गया है9toothpicks सहित, सेल खुरचनी10, पराबैंगनीकिरण11, और बिजली धाराओं12। सभी तरीकों के विभिंन पेशेवरों और विपक्ष है, और विधि सेल प्रकार, बजट, और विश्लेषण उपकरण के अनुसार पर फैसला किया जाना चाहिए । एक उदाहरण के रूप में, यदि प्रयुक्त कक्ष प्रकार कोटिंग, मैनुअल दबाव हटाने, जैसे एक दंर्तखोदनी या पिपेट टिप के साथ की आवश्यकता है, क्षेत्र के भीतर प्रवास को प्रभावित करेगा, एक अलग विधि का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । इस अध्ययन में, हम मैनुअल स्क्रैप पर ध्यान दिया जाएगा ।

मैनुअल परिमार्जन के लिए एक नकारात्मक पक्ष आकार, खरोंच के आकार, और खरोंच के किनारों पर सेल के संचय की भिन्नता है । कई प्रोटोकॉल मौजूद है, और एक उच्च उद्धृत कागज13scratching के बाद वृद्धि की गति और/ इसके अतिरिक्त, प्रसार को कम करने के लिए कई विधियों का उपयोग किया गया है, चूंकि कक्षों के प्रसार को माइग्रेशन से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता और इसलिए माइग्रेशन के गलत-सकारात्मक परिणाम दे सकते हैं । कुछ रिपोर्ट किए गए तरीके सीरम भुखमरी14 खरोंच और15सीरम की मात्रा को कम करने के पूर्ववर्ती हैं । हालांकि, इन तरीकों में से न तो यह सुनिश्चित कर सकते है कि वहां कोई प्रसार है । इसलिए, हम माइग्रेशन के सही परिणाम सुनिश्चित करने के लिए मीतोमयसीं C के साथ कक्षों के पूर्व-उपचार की रिपोर्ट करते हैं । मीतोमयसीं सी एक एंटीबायोटिक है जो डीएनए के साथ एक आबंध बांड का गठन करके डीएनए संश्लेषण को बाधित करता है, जो डीएनए को16से अलग करने से रोकता है । मीतोमयसीं सी के साथ पूर्व इलाज करके और scratching से पहले पंजाबियों के साथ धुलाई, अंतर के पाया बंद होने कोशिकाओं के सच प्रवास को दर्शाता है (चित्रा 1) ।

सभी पद्धतियों की एक विशेषता यह है कि एक प्रणाली के लिए17माइग्रेशन की प्रक्रिया का विश्लेषण करने की आवश्यकता है । एक आम और एक सस्ती विधि की प्रगति का विश्लेषण करने के लिए एक प्रकाश क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए पूर्व में खरोंच की छवियों को ले निर्धारित समय अंक, एक छवि सॉफ्टवेयर18,19में अंतर के बंद होने के विश्लेषण के बाद है । इस विधि समय लेने वाली है, अविश्वसनीय के साथ एक ही स्थान और ध्यान में तस्वीरें लेने का संबंध है, और तापमान परिवर्तन के कैमरे बलों के चक्र के लिए मशीन से आंदोलन करते हुए तस्वीरें ले रहे हैं । वर्तमान प्रवाह को मापने के द्वारा माइग्रेशन का पता लगाने के लिए अंय विधियां विकसित की गई हैं । वर्तमान परिवर्तन, कोशिकाओं के रूप में प्लेट पर अधिक स्थान है, जो प्रतिबाधा20में वृद्धि के रूप में पढ़ा है कवर. प्रतिबाधा को मापने के द्वारा, कोशिकाओं का वातावरण प्रभावित नहीं है, और विधि इसलिए गैर इनवेसिव माना जाता है. इस विधि सोने इलेक्ट्रोड, जो महंगे हैं के साथ विशेष प्लेटों पर निर्भर करता है, लेकिन वे सेलुलर पालन, प्रसार, प्रवास, और कोशिका मृत्यु के रूप में कई प्रक्रियाओं का पता लगाने के लिए सक्षम. इस विधि का एक बड़ा नुकसान यह है कि प्रतिबाधा माप सीधे माइग्रेशन इंगित नहीं करता है, जैसे कि तापमान के रूप में कारक प्रतिबाधा पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है. प्रतिबाधा में परिवर्तन सॉफ्टवेयर द्वारा समीक्षा नहीं कर रहे हैं कि कई कारकों के कारण हो सकता है, डेटा का विश्लेषण अधिक कठिन बना. इसलिए, दृश्य की कमी एक पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोप के लिए प्रवास की पुष्टि की आवश्यकता है ।

उपलब्ध तकनीकों के नकारात्मक पक्ष के कई काबू पाने के लिए, हम एक वास्तविक समय स्वचालित ऑप्टिकल कैमरा का उपयोग करें । ऑप्टिकल कैमरा एक लेंस, रोशनी इकाई, और एक डिजिटल कैमरा के साथ एक छोटे से मंच में एक उच्च प्रवाह माइक्रोस्कोप के साथ एक का पता लगाने प्रणाली है । यह एक सॉफ्टवेयर में निर्मित है, जो अंय बातों के बीच प्रवास और प्रसार परीक्षण कर सकते हैं । माइग्रेशन का पता लगाने के लिए, दो एल्गोरिदम का उपयोग वृद्धि और कोशिकाओं के माइग्रेशन कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है, जिन्हें क्रमशः प्रसार और घाव भरने वाला विश्लेषण कहा जाता है. प्रसार विश्लेषण एक दो कदम छवि विभाजन एल्गोरिथ्म पर आधारित है जो कोशिका-आच्छादित क्षेत्रों (पीले रंग में दिखाया गया) और उन्नत हिस्टोग्राम विश्लेषण द्वारा खाली पृष्ठभूमि क्षेत्रों के बीच अंतर का पता लगाने के लिए बनावट विश्लेषण लागू करता है । घाव भरने विश्लेषण एक तीन कदम एल्गोरिथ्म है कि सेल monolayer का पता लगाता है पर आधारित है, घाव अंतर को रेखांकित, और अंतर चौड़ाई निर्धारित करता है । ये चरण उपयोगकर्ता-निर्धारित समय-बिंदुओं पर किए जाते हैं, और डेटा को कवर्ड क्षेत्र, अंतर चौड़ाई और अंतर क्षेत्र के रूप में प्रस्तुत किया जाता है. इस मशीन के महान लाभ में से एक यह है कि यह कैमरा21के कोण की वजह से तरल के माध्यम से अनुयाई कोशिकाओं की इमेजिंग सक्षम बनाता है । कैमरा lenstakes झुकाव छवियों है कि एक जेड के ढेर के लिए अनुमानित कर रहे है एक z-विमान को यह सुनिश्चित करना है कि चित्रों में ध्यान केंद्रित कर रहे है उत्पंन (चित्रा 2) । z-स्टैक चित्र (उदा. ४०) की श्रृंखला के विलय से उत्पन्न होते हैं, जो घाव किनारे को सीधा ले जाते हैं, और पूरे घाव के पार । z-स्टैक सेल परत की गहराई के साथ ही घाव भर में एक में फोकस विमान पर कब्जा करने के लिए सक्षम बनाता है । इसके अलावा, छवियों की श्रृंखला एक साथ छवियों का एक वीडियो संग्रह करने के लिए रखा जा सकता है, एक बटन के क्लिक के साथ ।

हम keratinocyte सेल लाइन HaCaT में प्रवास का पता लगाने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है । हम लैक्टोफेरिन और उसके N-टर्मिनल पेप्टाइड, Lactoferricin, मनुष्यों और गायों से परीक्षण किया, प्रवास पर उनके प्रभाव का विश्लेषण के रूप में इन अणुओं रोगाणुरोधी और प्रतिरक्षा मॉडुलन22 अणुओं के रूप में कई आवेदन किया है करने के लिए दिखा दिया गया है , 23. चार यौगिकों अनुपचारित HaCaT कोशिकाओं की तुलना में थे और एपिडर्मल वृद्धि कारक (EGF) एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था.

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Protocol

प्रायोगिक सेटअप कोई नैतिक और कानूनी प्रतिबंध है और रॉसकिले विश्वविद्यालय के साथ समझौते में आयोजित किया गया था । प्रयोगात्मक सेट अप का एक सिंहावलोकन चित्रा 1 में देखा जा सकता है और चित्रा 2में ऑप्टिकल कैमरा के तंत्र ।

1. तैयारी

  1. एक बाँझ लामिना प्रवाह बेंच और प्रयोग के शुरू करने से पहले ७०% इथेनॉल के साथ सभी उपकरणों की सफाई द्वारा बेंच में सभी चरणों का पालन करें ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पारंपरिक मशीन में ऑप्टिकल कैमरा 5% CO2 के साथ प्लेस कोशिकाओं के लिए इष्टतम स्थिति सुनिश्चित करने के लिए ।
  3. DMEM मीडिया में HaCaT कोशिकाओं को एक T75 कुप्पी में 10% FBS और 1x एंटीबायोटिक्स (पेनिसिलिन और streptomycin) के साथ बढ़ाएँ ।
  4. कोशिकाओं को अलग करने के लिए 1 मिलीलीटर 1x trypsin का उपयोग करें और उंहें हर 3-4 दिन खेती, सेलुलर परत पर फैलाने से । पूर्व गर्मी का उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान के लिए ।

2. एक ४८-वेल्स Microtiter प्लेट में HaCaT कोशिकाओं के एक Monolayer पैदा

  1. मध् यम को T75 कुप्पी से एक पाश्चर पिपेट के साथ निकालें ।
  2. T75 कुप्पी तक 5 मिलीलीटर 1x बाँझी पंजाबियों को जोड़कर कुप्पी में अनुयाई कोशिकाओं को धो लें ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि पंजाब कैल्शियम और मैग्नीशियम से मुक्त है ।
  3. पंजाबियों को परिचालित करें और इसे एक पाश्चर पिपेट के साथ निकालें ।
  4. दोहराएं कदम 2.2-2.3 ।
  5. कुप्पी के लिए 1 मिलीलीटर 1x trypsin जोड़ें और इसे सेल परत के पार फैलाने ।
  6. एक पारंपरिक मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर कुप्पी मशीन जब तक कोशिकाओं अलग है (5-8 मिनट सबसे सेल लाइनों के लिए पर्याप्त है) ।
  7. माइक्रोस्कोप के तहत देखें यदि कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं । एक बार कोशिकाओं अलग कर रहे हैं, 10% FBS के साथ नियमित रूप से संस्कृति मीडिया के 9 मिलीलीटर जोड़ें 1x trypsin को निष्क्रिय करने के लिए ।
  8. या तो एक hemocytometer, एक कल्टर-काउंटर या समान के साथ सेल गिनती ।
    नोट: Trypan ब्लू मृत कोशिकाओं को देखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, 1x trypsin HaCaT कोशिकाओं में पूरी तरह से जब जीवित दौर कर रहे हैं ।
  9. स्थानांतरण ७.५ x 104 कक्ष/अच्छी तरह से २५० µ l 10% FBS मीडिया में एक गोल तली ४८-well टिशू कल्चर प्लेट (स्टैंडर्ड प्लेट) ।
    नोट: परख भी 6 में स्थापित किया जा सकता है, 12, 24, या ९६-अच्छी तरह से प्लेटें, जो सभी ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत परख किया जा सकता है ।
  10. धीरे की ओर से थाली ले जाने के लिए सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को समान रूप से कुओं में फैल रहे हैं, या कोशिकाओं को कुओं के केंद्र में इकट्ठा करेंगे । एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण सेल समान रूप से मीडिया में फैल रहा है सुनिश्चित करने के लिए
  11. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पारंपरिक सह2 मशीन में थाली रखो रात भर या जब तक कोशिकाओं कुओं के नीचे का पालन किया है ।

3. प्रवास प्रभाव के लिए उत्तेजनाओं के अलावा

  1. जांच अगर कुओं 90-95% एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत धाराप्रवाह हैं ।
  2. मीतोमयसीं C के 10 µ g/mL को एक उचित मात्रा में मध् यम से तैयार करें ।
    नोट: इस अध्ययन में, मीतोमयसीं सी 4 डिग्री सेल्सियस पर एक स्टॉक समाधान में रखा जाता है 1 मिलीग्राम/एमएल । समाधान में मीतोमयसीं सी 2-8 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में एक सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
  3. एक अच्छी तरह से एक पाश्चर पिपेट के साथ बिताया मीडिया निकालें ।
  4. जोड़ें २५० µ एल के 5 µ g/एमएल मीतोमयसीं सी की एक अच्छी तरह से करने के लिए ।
  5. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर 2 एच के लिए थाली मशीन ।
  6. उन्हें माध्यम की एक उचित मात्रा में कमजोर द्वारा पेप्टाइड्स की उत्तेजनाओं तैयार करते हैं ।
    नोट: इस अध्ययन में, मानव और गोजातीय लैक्टोफेरिन और Lactoferricin दोनों का परीक्षण किया गया 25 µ g/mL की मात्रा में २५० µ l
  7. एक पाश्चर पिपेट के साथ मीतोमयसीं सी के साथ मध्यम निकालें ।
  8. 1x पंजाबियों (कमरे के तापमान) के २५० µ एल के साथ वेल्स 1x धो लें और एक पाश्चर पिपेट के साथ धो हटा दें ।
  9. 1x पंजाबियों के २५० µ एल जोड़ें और स्वयं एक २०० µ एल पिपेट टिप के साथ खड़ी खरोंच कुओं । एक नए पिपेट टिप के लिए एक अच्छी तरह का प्रयोग करें ।
  10. पंजाबियों निकालें और २५० µ एल पेप्टाइड उत्तेजनाओं जोड़ें ।
  11. प्लेट के दोनों किनारों पर शिकंजा एडजस्ट करके ऑप्टिकल कैमरा सिस्टम में प्लेट को माउंट कर रहे हैं । ढक्कन को microtiter प्लेट पर छोड़ दें ।
    नोट: कैमरा ढक्कन खुला अगर आवश्यक के साथ काम कर सकते हैं ।

4. कंप्यूटर पर ऑप्टिकल कैमरा के लिए प्रोग्राम सेट करें

  1. बाईं ओर कार्यपट्टी में प्राप्त करें पर क्लिक करके.
  2. छोड़ दिया पर कार्यपट्टी में समारोह घाव हीलिंग चुनें ।
  3. थाली चित्रणके नीचे क्लिक करके प्लेट प्रकार चुनें ।
  4. अचयनित कुओं, उपयोग में नहीं है, उंहें अंकन और स्क्रीन पर ऊपरी बाईं ओर पर सक्षम क्लिक करें द्वारा ।
    नोट: सभी कुओं डिफ़ॉल्ट रूप से चयनित हैं ।
  5. कुओं पर लेंस का ध्यान समायोजित करने के लिए कुओं में से एक पर राइट क्लिक करके कोशिकाओं की स्थिति फिट ।
    नोट: पट्टी को प्लेट दृष्टांत के दाईं ओर ले जाकर भी मैन्युअल रूप से समायोजित किया जा सकता है.
  6. चित्र अंतराल (उदा. (00:30:00)) के अंतर्गत चित्रों के लिए समयावधि निर्धारित करें.
  7. इच्छित अवधि (उदा. ९७ पुनरावृत्तियां) फ़िट करने के लिए पुनरावृत्ति की संख्या सेट करें ।
  8. निचले दाएँ कोने में प्रारंभ करें बटन क्लिक करके चलाएँ प्रारंभ करें.

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Representative Results

HaCaT एक keratinocyte सेल लाइन, त्वचा में सबसे प्रचुर कोशिका प्रकार में से एक है । जब एक घाव होता है, त्वचा कोशिकाओं पैदा करना और घाव बिस्तर पर स्थानांतरित करने के लिए शुरू (चित्रा 3) घाव बंद करने के लिए । दोनों प्रक्रियाओं, इसलिए कर रहे हैं, उचित चिकित्सा के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है ।

ऑप्टिकल कैमरा वास्तविक समय में दोनों प्रक्रियाओं का पालन कर सकते हैं । माइग्रेशन के लिए, सिस्टम तीन डेटा सेट देता है: कक्ष में कवर किया गया क्षेत्र, अंतर चौड़ाई, और अंतर क्षेत्र । जब निगरानी खरोंच लैक्टोफेरिन, Lactoferricin या EGF के साथ इलाज किया, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप हमें समय के साथ इन तीन मापदंडों पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है. ४८ एच के बाद, हम देखते है कि EGF घाव के ९५% बंद करने के परिणामस्वरूप है, ३८% अनुपचारित नियंत्रण के बंद करने के लिए (3 ए आंकड़ा) की तुलना में । लैक्टोफेरिन और Lactoferricin के विभिंन संस्करणों ३३% और ६२% घाव बंद के बीच रखा जा रहा है पेप्टाइड्स माता पिता के प्रोटीन से अधिक शक्तिशाली के साथ । घाव बंद होने का प्रतिशत, प्रारंभिक खरोंच से अंतर चौड़ाई में परिवर्तन से निर्धारित, भी प्लॉट किया जा सकता है (चित्र बी) ।

HaCaT कक्षों में एक सशक्त कक्ष-कक्ष सहभागिता होती है और जब कक्ष माइग्रेट होते हैं, तो चरणों की श्रृंखला24आवश्यक होती है. शीघ्र ही, अग्रणी कोशिकाओं आसंजन, बहर की अपनी साइट को बाधित, और cytoskeleton अनुबंध25स्थानांतरित करने के लिए । अग्रणी कोशिकाओं की दखलंदाजी आसानी से ऑप्टिकल कैमरा (चित्रा 4) के साथ देखा जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1 एक ऑप्टिकल कैमरे पर माइग्रेशन परीक्षण करने के लिए खरोंच परख के: योजनाबद्ध फ़्लोचार्ट । HaCaT कोशिकाओं एक ४८-अच्छी तरह से प्लेट पर चढ़ाया जाता है और 24 एच के लिए पालन करने की अनुमति दी । कोशिकाओं को 2 ज के लिए मीतोमयसीं सी के साथ पूर्व इलाज कर रहे है प्रसार को बाधित, और खरोंच और प्रदर्शन किया है पेप्टाइड उत्तेजनाओं के अलावा के बाद । प्लेट ऑप्टिकल कैमरा की इकाई में डाला जाता है, और माइग्रेशन ४८ ज के लिए पीछा किया जाता है ।

Figure 2
चित्रा 2 : ऑप्टिकल कैमरा की स्कैनिंग तकनीक । ऑप्टिकल लेंस स्वचालित ऑप्टिकल कैमरा की इकाई ६.२५ ° पर angled है क्षैतिज विमान के लिए इस तरह के जीवाणु और सेलुलर समाधान के रूप में विभिंन समाधानों के माध्यम से स्कैनिंग सक्षम है । छवियों की अधिग्रहीत श्रृंखला सभी केंद्रित की छवि ढेर होते हैं, दोनों के बाहर ध्यान केंद्रित और में ध्यान केंद्रित, कोशिकाओं के साथ छवियों को सुनिश्चित करने के लिए. 26से संशोधित ।

Figure 3
चित्रा 3 : ४८ घंटे से अधिक समय पूर्व इलाज मीतोमयसीं सी HaCaT सेल का माइग्रेशन । (A) माइग्रेशन स्वचालित ऑप्टिकल कैमरा पर पता लगाया जाता है हर आधे घंटे के लिए ४८ ज. कोशिकाओं मीतोमयसीं सी के साथ पूर्व इलाज कर रहे है प्रसार को बाधित । कोशिकाओं को या तो मानव-या गोजातीय-लैक्टोफेरिन (h-वामो या बी-वामो) या-Lactoferricin (एच-LFcin, बी-LFcin) के 25 µ g/एमएल के साथ इलाज कर रहे हैं । उपकला वृद्धि कारक (EGF) ५०० एनजी पर एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है/ अनुपचारित HaCaT कक्षों को नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है । (ख) उपचार के प्रवास के ग्राफिक चित्रण । परिणाम तीन स्वतंत्र रन के प्रतिनिधि हैं, और परिणाम प्रारंभिक स्क्रैच * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 के प्रतिशत को बंद करने के रूप में दिए गए हैं ।

Figure 4
चित्र 4 : स्वास्थ्यकर्मी HaCaT कोशिकाओं का बहर lamellipodia. HaCaT कोशिकाओं के Lamellipodia काले तीर से चिह्नित है । कोशिकाओं के गतिशील आंदोलन में HaCaT परिणाम के मजबूत सेल सेल बातचीत के रूप में वे प्रवास और आसानी से समय के साथ मनाया जा सकता है ।

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Discussion

विकास, घाव भरने, इम्यूनोलॉजी, और कैंसर के अध्ययन में प्रवास के महत्व के कई विभिंन तरीकों के लिए स्थानांतरण अध्ययन करने के लिए प्रेरित किया है । प्रवासन या तो विस्तार या कोशिकाओं द्वारा अंतर के बंद की अभिव्यक्ति हो सकती है । सबसे अधिक बार बंद खरोंच का परीक्षण किया है, के रूप में यह एक monolayer में कोशिकाओं को विकसित करने के लिए आसान है और फिर एक विशिष्ट रूप8में कोशिकाओं बढ़ रही से एक खरोंच बनाने के लिए । हमारे अध्ययन मैनुअल scratching के लिए एक अनुकूलित विधि दर्शाता है, के रूप में तकनीक मास्टर और कम लागत के लिए आसान है । हम डीएनए संश्लेषण अवरोधक मीतोमयसीं सी, प्रकाशित तरीकों18की तुलना में खरोंच का अनुकूलन करने के लिए एक अतिरिक्त धोने की शुरुआत की, और उच्च प्रवाह अध्ययन की अनुमति देता है कि एक ऑप्टिकल कैमरा का उपयोग.

इन इन विट्रो खरोंच परख एक अनुयाई सेल लाइन है कि कुओं के नीचे करने के लिए ठीक से बांध और एक खरोंच पर प्रवास का पता लगाने की आवश्यकता है, प्रसार के लिए बाधित की जरूरत है । इन दोनों सुविधाओं की परख के लिए आवश्यक हैं । सच प्रवास का पता लगाने के लिए, कई दृष्टिकोण सीरम एकाग्रता को कम करने के साथ वर्णित किया गया है, सेल भूख से मर14, DMSO, या विभिंन अवरोधकों 13,27से पहले । सामांय में, एक सीरम मुक्त मीडिया का इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, कुछ सेल लाइनों, जैसे प्राथमिक सेल लाइनों, आंदोलन और समग्र अस्तित्व के लिए सीरम की आवश्यकता है । इसलिए सेल लाइन के हिसाब से चुनाव कराए जाने चाहिए । सेल लाइनों कि कोटिंग की आवश्यकता होती है इस परख में समस्याग्रस्त किया जा सकता है, के रूप में मैनुअल खरोंच कोटिंग के रूप में अच्छी तरह से परेशान करेंगे ।

भिंन कक्ष प्रकारों को उनके आकार और वृद्धि दर के आधार पर एक धाराप्रवाह monolayer बनाने के लिए कक्षों की भिंन संख्या की आवश्यकता होती है । HaCaT कोशिकाओं के आसपास 4-6 ज के बाद पालन करें, लेकिन एक स्थिर monolayer बनाने के लिए रात भर बसने के लिए छोड़ दिया जाता है । खरोंच परख के प्रमुख नुकसान में से एक अनियमित8खरोंच है । इस अध्ययन में, हम बताते है कि पूर्व में पंजाबियों के साथ धुलाई और नए पंजाब में खरोंच बनाने खरोंच के किनारों के साथ घायल और क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की गर्द कम । इस अनुग्राह्यतापूर्वक त्वचा में कोशिकाओं को जोड़ने desmosomes जंक्शन द्वारा समझाया जा सकता है । जंक्शनों सीए2 +-निर्भर24 और पंजाबियों का उपयोग करके, cations हटा रहे हैं, जो मजबूत सेल सेल आसंजन को कमजोर कर सकता है । इस प्रकार, पंजाबियों के उपयोग से कोशिकाओं को अलग से बेहतर ढंग से हटाने की अनुमति दी जा सकती है, जो घाव किनारे के साथ कोशिकाओं के कम संचय के लिए अग्रणी है । इसके अलावा, ऑप्टिकल कैमरा सभी प्लेट आकार में कुओं की एक विस्तृत हिस्सा उपाय और इसके तीन कदम एल्गोरिथ्म के माध्यम से खरोंच में झुके करने के लिए अनुकूल है । जिससे पूर्व में पंजाबियों के साथ धुलाई और ऑप्टिकल कैमरे का उपयोग करके, मैनुअल खरोंच के नुकसान को समाप्त कर रहे हैं । छवियों के z-stacking कोशिकाओं को और अधिक सटीक पर ध्यान केंद्रित करता है, लेकिन कैसे विभिंन प्रकार के सेल पर निर्भर करता है, ध्यान एक समस्या हो सकती है । अगर कोशिकाएं बहुत ज्यादा बढ़ती हैं, तो कैमरे का फोकस इन-फोकस से बाहर की ओर फ़ोकस शिफ्ट करेगा । इस प्रकार, अगर मीतोमयसीं सी इस्तेमाल नहीं किया है, यह करने के लिए एक छोटे से अधिक अगर अपने प्रयोगात्मक सेटअप 24 से अधिक एच के लिए चलेंगे ध्यान केंद्रित सेट लाभप्रद हो सकता है । ऑप्टिकल कैमरा एक आसान सेट अप है कि एक सहज ज्ञान युक्त सॉफ्टवेयर है कि 6 से प्लेटें उपाय कर सकते है के साथ एक मानक कंप्यूटर के माध्यम से संचालित है ९६-अच्छी तरह से microtiter प्लेटों और इसलिए विभिंन परीक्षण सेट अप सक्षम बनाता है । जब छवियों की संख्या का चयन करने के लिए लिया जाएगा, कुछ सीमाएं मौजूद हैं । यदि एक ९६-well प्लेट का उपयोग किया जाता है, एक प्राप्त कर सकते है चित्रों की संख्या केवल कंप्यूटर पर अंतरिक्ष के लिए सीमित है, के रूप में डेटा सेट बड़े हो सकते हैं, और कैमरे की गति से । कई चित्रों को एक त्वरित उत्तराधिकार में आवश्यक हैं, तो यह एक अच्छी तरह से स्कैन करने के लिए समय की जरूरत है, कैमरे के आंदोलन एक सीमित कारक हो सकता है.

ऑप्टिकल प्रणाली सरल लेकिन शक्तिशाली निगरानी सक्षम बनाता है । खरोंच की तस्वीरें अंतर के बंद होने की प्रक्रिया के संबंध में विश्लेषण कर रहे हैं, लेकिन यह भी कोशिकाओं के रूपात्मक लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सॉफ्टवेयर कोशिकाओं पीले निशान और एक मानक सुविधा के रूप में पृष्ठभूमि रंग ग्रे पत्ते, बेहतर घाव बढ़त कल्पना, हालांकि कच्चे छवियों को स्पष्ट रूप से उपलब्ध है कि जैसे प्रकाशनों के लिए आवश्यक होना चाहिए । HaCaT कक्षों में सशक्त कक्ष-कक्ष इंटरैक्शन होते हैं, जो माइग्रेशन को डायनेमिक पत्रक28में करते हैं. यह सुविधा समय के साथ माइग्रेट कक्षों की lamellipodia (आरेख 4) देखना आसान बनाती है.

यह अध्ययन प्रोटीन लैक्टोफेरिन और उनके व्युत्पंन एन टर्मिनल पेप्टाइड्स Lactoferricin के प्रभाव को दर्शाता है, और एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में EGF, लेकिन विभिन्न दवाओं, पेप्टाइड्स/प्रोटीन, और संयोजन, के रूप में अवरोधकों या उत्तेजितताओं का परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता घाव भरने की । खरोंच परख बदल सकता है और विभिंन सेल लाइनों और यौगिकों कि प्रवास को प्रभावित कर सकते है फिट अनुकूलित कर सकते हैं । एक साथ, अपनी कम लागत और आसान प्रबंधन के साथ, यह परख बहुत सबसे प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ है । ऑप्टिकल कैमरा के लिए विभिंन दवाओं, अवरोधकों या प्रवास के लिए उत्तेजितताओं का परीक्षण किया जा सकता है, लेकिन यह भी प्रसार ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

डेनिश स्वतंत्र अनुसंधान के लिए परिषद, प्रौद्योगिकी और उत्पादन, अनुदान #4005-00029

Materials

Name Company Catalog Number Comments
oCelloScope BioSense Solution ApS Optical camera
UniExplorer software  BioSense Solution ApS (8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX Gibco 31966-021 Medium for HaCaT
FBS Gibco 10270 Fetal bovine serum
PBS Gibco D837 Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin Sigma P0781 Antibiotics
Trypsin (10x) Sigma T3924
Mitomycin C Tocris 3258 Inhibits proliferation
Microtiter plate Greiner Bio-one 677 180
Incubator Panasonic 37°C, 5% CO2
Hemocytometer Assistent Türk (0.1 mm)
Pipet boy Accu-Jet pro

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References

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जीव विज्ञान अंक १३८ स्क्रैच परख प्रवासन HaCaT पेप्टाइड उपचार ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप एपिडर्मल वृद्धि कारक लैक्टोफेरिन Lactoferricin
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Vang Mouritzen, M., Jenssen, H.… More

Vang Mouritzen, M., Jenssen, H. Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera. J. Vis. Exp. (138), e57691, doi:10.3791/57691 (2018).

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