Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Optimalisert Scratch analysen for In Vitro Testing av celle migrasjon med et automatisert optisk kamera

Published: August 8, 2018 doi: 10.3791/57691
Automatic Translation
1, 1
1Department of Science and Environment, Roskilde University

Summary

Her beskriver vi en prosedyre for å teste den celle migrasjon i vitro med en automatisert optiske kameraer mikroskop. Scratch analysen har vært mye brukt der nedleggelsen av scratch etterfølges for en angitt periode. Optisk mikroskopet kan pålitelig og billig påvisning av celle migrasjon.

Abstract

Celle migrasjon er en viktig prosess som påvirker mange aspekter av helse, for eksempel sårheling og kreft, og det er derfor avgjørende for å utvikle metoder for å studere overføringen. Scratch analysen har lenge vært den vanligste i vitro metoden å teste forbindelser med anti - og pro - migration egenskaper på grunn av sin lave kostnader og enkel prosedyre. En ofte rapporterte problemet med analysen er imidlertid akkumulering av celler over kanten av scratch. Videre, for å hente data fra analysen, bilder med forskjellige eksponeringer må tas over en periode på nøyaktig samme sted å sammenligne bevegelser av overføringen. Analyse programmer kan brukes til å beskrive scratch nedleggelse, men de er arbeidskrevende, unøyaktig, og styrker sykluser av temperaturendringer. I denne studien viser vi en optimalisert metode for overføring effekten, f.eks med naturlig forekommende proteiner menneske - og storfe-Laktoferrin og deres N-terminal peptid Lactoferricin på tarmepitelet linjen HaCaT. En avgjørende optimalisering er å vaske og riper i PBS, som fjerner nevnte akkumulering av celler langs kanten. Dette kan forklares ved fjerning av kasjoner, som har vist seg å ha en effekt på keratinocyte celle-celle tilkobling. For å sikre virkelig oppdagelse av migrasjon, ble pre behandle med mitomycin C, en DNA syntese hemmer, lagt til protokollen. Til slutt, viser vi automatisk optisk kameraet eliminerer høy temperatur sykluser, manuell arbeidskraft med scratch nedleggelse analyse, mens forbedre reproduserbarhet og sikre analyse av identiske scratch over tid.

Introduction

Migrasjon er en viktig prosess som påvirker flere fysiologiske aspekter. I sårheling forenkler overføring re epithelization av huden. I ikke-healing sår, som kronisk sår, opportunistiske bakterier forårsaker infeksjon av såret og åpne sår er ideelle for bakterievekst og dannelse av biofilm1,2. Biofilm er en av årsakene til utviklingen av resistente bakterier, som er en av de største truslene mot våre samfunn3. I sårheling, immunceller ikke kan trenge gjennom biofilm. I Krepsen er migrering av kreftceller et avgjørende skritt i metastasering, som er den primære dødsårsaken for pasienter med solide svulster4,5. Derfor er det viktig å kunne studere migrasjon.

Scratch analysen er ofte brukt til å teste celle migrasjon fordi det er billig og lett å utføre på tilhenger cellelinjer, som fibroblast, endothelial, og tarmepitelet linjer6,7. I dag, flere metoder finnes for å utføre riper8, og forskjellige materialer har blitt rapportert som skal brukes, inkludert tannpirkere9, celle skrapere10, lasere11og elektrisk strøm12. Alle metodene har forskjellige fordeler og ulemper, og metoden bør avgjøres på ifølge celle type, budsjett og analyse verktøyet. Som et eksempel, hvis de brukte cellen krever belegg, manuell trykk fjerning, f.eks med en tannpirker eller pipette tips, vil påvirke Flyttinger innenfor området, en annen metode som skal brukes. I denne studien vil vi fokusere på manuell skraping.

En ulempe for manuell skraping er variasjonen av størrelse, former av riper og akkumulering av cellen på kantene av scratch. Mange protokoller finnes, og en svært sitert papir råder økt hastighet og/eller grundig vask etter skrape13. I tillegg har flere metoder blitt brukt å minimere spredning, siden spredning av cellene ikke kan skilles fra migrasjon og derfor kan gi falske positive resultater av migrasjon. Noen rapportert metoder er serum sult foran den scratch14 og redusere mengden av serum15. Men kan ingen av disse metodene sørge for at det er ingen spredning. Derfor rapportere vi en behandling av celler med mitomycin C å sikre sant resultater av migrasjon. Mitomycin C er et antibiotikum som hemmer DNA-syntese ved å danne en kovalent binding med DNA, som hindrer at DNA skille16. Pre behandle med mitomycin C og vask med PBS før skrape, demonstrerer oppdaget nedleggelsen av gapet ekte migrering av cellene (figur 1).

Karakteristisk for alle metodene er behovet for et system for å analysere prosessen med overføring17. En felles og en rimelig metode for å analysere fremdriften er å bruke en lys-feltet mikroskop for å ta bilder av scratch på forhåndsbestemt tid poeng, etterfulgt av en analyse av nedleggelsen av gapet i et bilde programvare18,19. Denne metoden er tidkrevende, upålitelig med hensyn å ta bilder på samme sted og fokus, og bevegelsen fra inkubator til kameraet styrker sykluser av temperaturendringer mens bildene er tatt. Andre metoder har blitt utviklet for å oppdage migrasjon ved å måle gjeldende flyt. Gjeldende endringer, som cellene dekker mer plass på platen, som leses som en økning i impedans20. Måle impedans, innvirkning på miljøet i cellene og metoden er derfor betraktes ikke-invasiv. Denne metoden er avhengig av spesialiserte plater med gull elektrodene, som er dyrt, men de gjør det mulig påvisning av mange prosesser, som cellular etterlevelse, spredning, migrasjon og celledød. En stor ulempen med denne metoden er at impedans målingen ikke indikerer direkte overføring som faktorer som temperatur har en stor innvirkning på impedansen. Endringer i impedansen kan være forårsaket av faktorer som ikke er gjennomgått av programvaren, gjør analyse av dataene vanskeligere. Derfor, mangelen på visualisering krever konvensjonelle lys mikroskop bekrefte overføringen.

For å overvinne mange av downsides av tilgjengelige teknikker, bruker vi en sanntid automatisert optiske kameraer. Optisk kameraet er en detection system med høy gjennomstrømming mikroskop på en liten plattform med en objektiv, belysning enhet og et digitalt kamera. Den har en innebygd programvare, hvilke kanne test migrasjon og spredning blant annet. For å oppdage migrasjon, brukes to algoritmer å analysere veksten og migrasjon kinetics av celler som kalles spredning og såret healing analyse, henholdsvis. Spredning analyse er basert på en to-trinns bilde segmentering algoritme som gjelder tekstur analyse for å oppdage forskjellen mellom cellen dekket områder (vist i gult) og Tom bakgrunn områder av avanserte histogrammet analyse. Såret healing analyse er basert på en tre-trinns algoritme som oppdager celle monolayer, finner såret gapet, og bestemmer mellomromsbredden. Disse trinnene utføres på bruker-bestemt tidspunkt, og dataene er presentert som dekket området og mellomromsbredden gapet området. En av de store fordelene med denne maskinen er at den lar imaging tilhenger celler gjennom væske på grunn av vinkelen på kameraet21. Lenstakes vippet kamerabildene som er anslått til en z-stabel med et enkelt z-fly generere for å sikre at bildene i fokus (figur 2). z-stabler genereres ved å flette en rekke bilder (f.eks 40) tatt vinkelrett til såret kanten, og over hele såret. Z-stabler kan fange av dybden av cellen laget som en i fokus fly over såret. Videre, en rekke bilder kan settes sammen til en video samling av bilder, ved å klikke på en knapp.

Vi viser en optimalisert protokoll for gjenkjenning for keratinocyte celle linjen HaCaT. Vi testet Laktoferrin og dens N-terminal peptid, Lactoferricin, fra mennesker og kyr, å analysere sin effekt på overføring som disse molekylene er påvist for å ha mange programmer som antimikrobielle og immun modulerende molekyler22 , 23. de fire forbindelsene ble sammenlignet med ubehandlet HaCaT celler og epidermal vekstfaktor (EGF) ble brukt som en positiv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimentell oppsettet har ingen etiske og juridiske restriksjoner og ble gjennomført med Roskilde University. En oversikt over den eksperimentelle set-up ses i figur 1 og mekanismer for optisk kameraet i figur 2.

1. forberedelse

  1. Utføre alle skritt i et sterilt laminær strømning-benk av benken og alt utstyr med 70% etanol før starten av eksperimentet.
  2. Plassere optisk kameraet i en konvensjonell inkubator på 37 ° C med 5% CO2 å sikre optimale forhold for cellene.
  3. Vokse HaCaT celler i DMEM media med 10% FBS og 1 x antibiotika (penicillin og streptomycin) i en MT75 bolle.
  4. Bruk 1 mL 1 x trypsin å koble cellene og sub dyrke dem hver 3-4 dager, ved å spre det over mobilnettet laget. Forvarm til romtemperatur før bruk.

2. generere en Monolayer av HaCaT celler i en 48-wells være ferdig innen Plate

  1. Fjerne mediet fra MT75 flasken en Pasteur pipette.
  2. Vask tilhenger cellene i flasken ved å legge til 5 mL 1 x sterilt PBS MT75 kolbe.
    Merk: Kontroller at PBS er gratis kalsium og magnesium.
  3. Sirkulere PBS og fjerne den med en Pasteur pipette.
  4. Gjenta trinn 2.2-2.3.
  5. Legge til 1 mL 1 x trypsin kolbe og spre det over cellen laget.
  6. Inkuber kolbe på 37 ° C i en konvensjonell inkubator til cellene, kobles (5-8 min er tilstrekkelig for de fleste linjer).
  7. Vis under mikroskopet cellene er koblet fra. Når cellene er enebolig, legge 9 mL av vanlige kultur media med 10% FBS å deaktivere 1 x trypsin.
  8. Telle cellen med enten en hemocytometer, coulter-counter eller lignende.
    Merk: Trypan blå kan brukes til å vise døde celler. Men i 1 x trypsin HaCaT er celler perfekt runde når levende.
  9. Overføre 7.5 x 104 celler/godt i 250 µL 10% FBS medier til en rund bunn 48-og vev kultur plate (standard plate).
    Merk: analysen kan også defineres i 6, 12, 24- eller 96-brønns plater, som alle kan være assayed under optisk mikroskop.
  10. Flytte forsiktig platen fra side til side for å sikre cellene er like spredt i brønnene, eller cellene samles i midten av brønnene. Inspisere under lys mikroskop sørge for cellen er jevnt fordelt i media
  11. Sett platen i en konvensjonell CO2 inkubator på 37 ° C over natten eller til cellene har overholdt bunnen av brønnene.

3. tillegg stimuli for migrasjon effekter

  1. Sjekk Hvis brønnene er 90-95% confluent under lys mikroskop.
  2. Forberede 10 µg/mL mitomycin C i en passende mengde medium.
    Merk: I denne studien holdes Mitomycin C på 4 ° C i en lagerløsning på 1 mg/mL. Mitomycin C i løsning kan lagres til en uke i mørket på 2-8 ° C.
  3. Fjerne brukte media med en Pasteur pipette fra hver brønn.
  4. Legge til 250 µL av 5 µg/mL mitomycin C i hver brønn.
  5. Inkuber platen i 2 h på 37 ° C og 5% CO2.
  6. Klargjør stimuli av peptider ved å fortynne dem i en passende mengde medium.
    Merk: I denne studien, ble både menneskelig og storfe Laktoferrin og Lactoferricin testet på 25 µg/mL i et volum på 250 µL
  7. Fjerne mediet med mitomycin C med en Pasteur pipette.
  8. Vask brønnene 1 x med 250 µL av 1 x PBS (romtemperatur) og fjern vask med en Pasteur pipetter.
  9. Legge til 250 µL av 1 x PBS og manuelt scratch brønnene loddrett med 200 µL pipette tips. Bruk nye pipette tips for hver brønn.
  10. Fjern PBS og legge 250 µL peptid stimuli.
  11. Montere platen i optisk kamerasystem ved å justere skruene på begge sider av platen. La lokket på være ferdig innen tallerkenen.
    Merk: Kameraet kan operere med lokk åpent om nødvendig.

4. Sett opp programmet for optisk kameraet på datamaskinen

  1. Klikk Hent i oppgavelinjen til venstre.
  2. Velg funksjonen sårtilheling i oppgavelinjen til venstre.
  3. Velg platen ved å klikke nedenfor Plate illustrasjon.
  4. Uegennyttig brønner, ikke er i bruk ved å merke dem og klikk Aktiver øverst til venstre på skjermen.
    Merk: Alle brønnene er valgt som standard.
  5. Justere fokus for linsen på brønnene å passe plasseringen av cellene ved å høyreklikke på en av brønnene.
    Merk: Autofokus kan også justeres manuelt ved å flytte feltet til høyre for illustrasjonen plate.
  6. Angi tidsperioden for bilder under Bildet intervall (f.eks (00: 30:00)).
  7. Angi antall gjentakelser til å passe perioden (f.eks 97 repetisjoner).
  8. Start kjøringen ved å klikke Start -knappen i nedre høyre hjørne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HaCaT er en keratinocyte cellen linje, en av de rikeste celletyper i huden. Når et sår oppstår, begynner hudceller å spre seg og migrere over til såret sengen å lukke såret (Figur 3). Begge prosessene er derfor av største betydning for riktig helbredelse.

Optisk kameraet kan følge begge prosessene i sanntid. For overføring systemet gir tre datasett: cellen dekket området og mellomromsbredden gapet området. Når overvåking riper behandlet med Lactoferrin, Lactoferricin eller EGF, tillater optisk mikroskopet oss å overvåke disse tre parametere over tid. Etter 48 timer inkubering observerer vi at EGF resultert i 95% nedleggelsen av såret, sammenlignet med 38% nedleggelsen av ubehandlet kontrollen (figur 3A). Ulike versjoner av Laktoferrin og Lactoferricin er plassert mellom 33% og 62% såret nedleggelse med peptider blir mer potent enn den overordnede proteiner. Prosentandelen av såret nedleggelse, bestemmes av endringer i Mellomromsbredde fra bunnen av første, også kan tegnes (figur 3B).

Når cellene migrerer, serie trinn er nødvendige24HaCaT celler har en sterk celle-celle interaksjon. Kort tid, ledende cellene forstyrre deres nettsted med vedheft, stikker og kontrakt cytoskeleton å flytte25. Protrusion av ledende cellene kan lett vises med optisk kameraet (Figur 4).

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk flytskjema til scratch analysen teste overføring på en optisk kamera. HaCaT celler er belagt på en 48-vel plate og lov til å overholde 24 h. Cellene er pre-behandlet med mitomycin C 2 h å hemme spredning, og grunnen er utført og etterfulgt av tillegg av peptid stimuli. Platen settes inn i enheten optisk kameraet og migrasjon er fulgt i 48 timer.

Figure 2
Figur 2 : Skanning teknologi for optisk kameraet. Optisk linse enheten automatisk optisk kameraet er vinklet på 6,25 ° mot horisontalplanet aktivere skanning via ulike løsninger som bakteriell og cellulær løsninger. Ervervet inneholde bilder bildestakker av alle fokuserer, både ute av fokus og i fokus, slik bilder med celler i-fokus. Endret26.

Figure 3
Figur 3 : Migrering av pre-behandlet mitomycin C HaCaT cellen over 48 timer. (A) overføring oppdages på automatiserte optisk kameraet hver halvtime til 48 timer. Cellene er pre-behandlet med mitomycin C å hemme spredning. Cellene behandles med 25 µg/mL av Human - eller storfe-Laktoferrin (H-LF eller B-LF) eller -Lactoferricin (H-LFcin, B-LFcin). Epitel vekstfaktor (EGF) brukes som en positiv kontroll på 500 ng/mL. Ubehandlet HaCaT celler brukes som en kontroll. (B) grafisk illustrasjon av migrering av behandlingene. Resultatene er representanter for tre uavhengige kjører, og resultatene er gitt som en prosentandel nedleggelse av første scratch * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Figure 4
Figur 4 : Stikker lamellipodia av behandlet HaCaT celler. Lamellipodia HaCaT cellene er preget av svarte pilene. Sterk celle-celle samspillet av HaCaT gir dynamisk bevegelse av cellene som de migrere og kan lett observeres over tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Betydningen av migrasjon i studier av utvikling, sårheling, immunologi og kreft har ført til flere forskjellige metoder å studere migrasjon. Migrasjon kan være et uttrykk for utvidelse eller nedleggelsen av gapet av cellene. Oftest nedleggelsen av scratch er testet, som det er lettere å vokse celler i en monolayer og deretter lage en ripe enn stadig cellene i et bestemt skjema8. Vår studie viser en optimalisert metode for manuell avlysning, teknikken er lett å mestre og lav pris. Vi introdusert DNA syntese hemmer mitomycin C, en ekstra vask å optimalisere scratch sammenlignet publiserte metoder18, og bruken av en optisk kameraet det innrømmer høy gjennomstrømming studier.

I vitro scratch analysen krever en tilhenger cellen linje som bindes riktig til bunnen av brønnene og for å oppdage overføring over en ripe, spredning må bli hemmet. Disse to funksjonene er avgjørende for analysen. For å oppdage sanne migrasjon, har flere tilnærminger blitt beskrevet med å senke serum konsentrasjonen, sulter cellen før skrape14, DMSO eller ulike hemmere 13,27. Generelt, en serum-ledig media kan brukes, men noen celle linjer, for eksempel primær cellelinjer, trenger serum for bevegelsen og total overlevelse. Valget bør derfor gjøres i henhold til celle linjen. Linjer som krever belegg kan være problematisk i denne analysen, som manuell riper vil forstyrre belegget også.

Ulike celletyper krever forskjellige antall celler å danne en confluent monolayer avhengig av deres størrelse og vekst rate. HaCaT cellene følge etter ca 4-6 h, men er igjen for å bosette over natten for å lage en stabil monolayer. En av de store ulempene til scratch analysen er uregelmessig riper8. I denne studien viser vi at før vask med PBS og gjør scratch i nye PBS redusere ansamlinger av såret og skadede celler langs kantene av scratch. Dette kunne plausibly forklares med desmosomes krysset koble cellene i huden. Knutepunktene er Ca2 +-avhengige24 og bruke PBS, kasjoner fjernes, som kan svekke de sterke celle-celle adhesjon. Dermed kan bruk av PBS tillate bedre fjerning av cellene enkeltvis, fører til mindre opphopning av cellene langs såret kanten. Videre optisk kameraet måler en bred del av brønnene i alle plate størrelser og tilpasser seg bents i grunnen via sin tretrinns algoritme. Ved før vask med PBS og bruke optiske kameraet, elimineres dermed ulempene ved manuell riper. Z-stabling bilder lager fokusere på cellene mer presis, men avhengig av hvordan ulike celletyper vokse, fokus kan være et problem. Hvis cellene vokse mye, flyttes fokus for kameraet fra i fokus til ut-av-fokus. Dermed, hvis mitomycin C ikke brukes, kan det være fordelaktig å sette fokus litt høyere hvis eksperimentelle oppsettet vil kjøre i mer enn 24 timer. Optisk kameraet har et enkelt oppsett som drives via en standard datamaskin med en intuitiv programvare som kan måle plater fra 6 - til 96-brønnen microtiter plater og derfor gjør ulike test set-ups. Når du velger antall bilder tas, finnes noen begrensninger. Hvis en 96-brønns plate brukes, er antall bilder kan man få bare begrenset plass på datamaskinen, som datasett kan bli store, og hastigheten på kameraet. Hvis mange bilder i rask rekkefølge, bevegelsen av kameraet kan være en begrensende faktor, som den trenger tid til å skanne hver godt.

Det optiske systemet muliggjør enkel, men kraftig overvåking. Bilder av scratch er analysert i forhold til prosessen med nedleggelsen av gapet, men kan også brukes for morfologiske karakteristikk av cellene. Programvaren merker cellene gul og forlater bakgrunnsfargen grå som standardfunksjon, bedre visualisere såret kanten, om raw-bilder selvsagt er tilgjengelig bør som behøves for eksempel publikasjoner. HaCaT cellene har sterk celle-celle interaksjoner som gjør overføringen skjer i en dynamisk ark28. Denne funksjonen gjør det lett å se lamellipodia overfører cellene over tid (Figur 4).

Denne studien viser effekten av proteiner Laktoferrin og deres avledet N-terminal peptider Lactoferricin og EGF som en positiv, men kan endres for å teste ulike legemidler, peptider/proteiner og kombinasjoner, hemmere eller stimulators av sårtilheling. Scratch analysen kan endres og optimalisert for å passe ulike linjer og forbindelser som kan påvirke overføringen. Sammen med sin lave kostnader og enkel administrasjon er denne analysen veldig tilgjengelig for de fleste laboratorier. Optisk kameraet kan brukes til å teste ulike stoffer, hemmere eller stimulators for overføring, men også spredning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Danske råd for uavhengig forskning, teknologi og produksjon, gi #4005-00029

Materials

Name Company Catalog Number Comments
oCelloScope BioSense Solution ApS Optical camera
UniExplorer software  BioSense Solution ApS (8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX Gibco 31966-021 Medium for HaCaT
FBS Gibco 10270 Fetal bovine serum
PBS Gibco D837 Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin Sigma P0781 Antibiotics
Trypsin (10x) Sigma T3924
Mitomycin C Tocris 3258 Inhibits proliferation
Microtiter plate Greiner Bio-one 677 180
Incubator Panasonic 37°C, 5% CO2
Hemocytometer Assistent Türk (0.1 mm)
Pipet boy Accu-Jet pro

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the Treatment of Chronic Wounds. Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).
  2. da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing. Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).
  3. Vyas, K. S., Wong, L. K. Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity. Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).
  4. Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces. Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).
  5. Folkman, J. Angiogenesis. Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).
  6. Monsuur, H. N., et al. Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro. Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).
  7. Tang, L., et al. Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization. The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).
  8. Ashby, W. J., Zijlstra, A. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).
  9. Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis. British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).
  10. Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. The effects of energy beverages on cultured cells. Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).
  11. Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay. Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).
  12. Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).
  13. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  14. Räsänen, K., Vaheri, A. TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes. Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).
  15. Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation. Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).
  16. Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).
  17. Stamm, A., Reimers, K., Strauß, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. In vitro wound healing assays - state of the art. BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).
  18. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).
  19. Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 440-451 (2016).
  20. Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study. The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).
  21. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  22. Jenssen, H. Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).
  23. Jenssen, H., Hancock, R. E. W. Antimicrobial properties of lactoferrin. Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).
  24. Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. The desmosome. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).
  25. Ponti, A. Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
  26. Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).
  27. Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
  28. Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).

Tags

Biologi problemet 138 Scratch analysen migrasjon HaCaT peptid behandling optisk mikroskop epidermal vekstfaktor Lactoferrin Lactoferricin
Optimalisert Scratch analysen for <em>In Vitro</em> Testing av celle migrasjon med et automatisert optisk kamera
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vang Mouritzen, M., Jenssen, H.… More

Vang Mouritzen, M., Jenssen, H. Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera. J. Vis. Exp. (138), e57691, doi:10.3791/57691 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter