Summary
Aquí describimos un procedimiento para probar la migración la célula en vitro con un microscopio de cámara óptica automatizada. El ensayo de rayado ha sido ampliamente utilizado donde el cierre de la raya es seguido por un período determinado. El microscopio óptico permite la detección confiable y barata de migración de la célula.
Abstract
Migración celular es un proceso importante que influye en muchos aspectos de la salud, como la cicatrización de heridas y el cáncer, y por lo tanto, es crucial para el desarrollo de métodos para el estudio de la migración. El ensayo de rayado ha sido el método más común de en vitro para probar compuestos con propiedades anti y pro migration debido a su bajo costo y simple procedimiento. Sin embargo, un problema a menudo informado del ensayo es la acumulación de células en el borde de la raya. Además, para obtener datos de lo análisis, imágenes de diferente exposición deben tomarse durante un período de tiempo en el mismo lugar exacto para comparar los movimientos de la migración. Programas de análisis diferentes pueden utilizarse para describir el cierre scratch, pero son intensivas en mano de obra, inexacto y las fuerzas de los ciclos de cambios de temperatura. En este estudio, demostramos un método optimizado para probar el efecto de la migración, por ejemplo con las proteínas que ocurren naturalmente humanos y bovinos lactoferrina y su péptido N-terminal Lactoferricin en la línea de células epiteliales HaCaT. Una optimización crucial es lavar y rayar en PBS, que elimina la mencionada acumulación de células en el borde. Esto podría explicarse por la eliminación de cationes, que han demostrado tener un efecto en la conexión de la célula de queratinocitos. Para asegurar la detección real de la migración, previo tratamiento con mitomicina C, un inhibidor de la síntesis de ADN, fue agregado al Protocolo. Finalmente, demostramos la automatizado óptica cámara, que elimina los ciclos de temperatura excesiva, mano de obra con el análisis de cierre scratch, mejora en la reproducibilidad y garantizando el análisis de secciones idénticas de cero con el tiempo.
Introduction
La migración es un proceso importante que influye en varios aspectos fisiológicos. En la cicatrización de heridas, migración facilita la re-epitelización de la piel. En las heridas no cicatrizan, como heridas crónicas, bacterias oportunistas causan infección de la herida, y las heridas abiertas son ideales para el crecimiento de bacterias y formación de biofilm1,2. Biofilm es una de las causas del desarrollo de bacterias resistentes, que es una de las mayores amenazas a nuestra sociedad moderna3. En la curación de la herida, las células inmunitarias no pueden penetrar el biofilm. En el cáncer, la migración de las células cancerosas es un paso fundamental de la metástasis, que es la principal causa de muerte para los pacientes con tumores sólidos4,5. Por lo tanto, es crucial poder estudiar la migración.
El ensayo de rayado se utiliza a menudo para probar la migración de la célula porque es barato y fácil de realizar en líneas de células adherentes, tales como fibroblastos endoteliales y células epiteliales líneas6,7. Hoy en día, existen varios métodos para realizar rayas8y diversos materiales se han divulgado para ser utilizado, incluyendo palillos9, celular raspadores10, láseres11y corrientes eléctricas12. Todos los métodos tienen desventajas y ventajas diferentes, y el método debe ser decidido según la herramienta de análisis, presupuesto y tipo de célula. Por ejemplo, si el tipo de celda utilizado requiere revestimiento, retiro de presión manual, por ejemplo con una punta de palillo de dientes o de la pipeta, influirá en la migración dentro de la zona, se debe usar un método diferente. En este estudio, nos centraremos en raspado manual.
Una desventaja para el raspado manual es la variación del tamaño, las formas de los arañazos y acumulación de células en los bordes del scratch. Existen muchos protocolos, y un papel altamente citado informa aumento de la velocidad o lavar bien después de rayar13. Además, se han utilizado varios métodos para reducir al mínimo la proliferación, ya que la proliferación de las células no se puede diferenciar de la migración y por lo tanto puede dar resultados falsos positivos de la migración. Algunos divulgan métodos son hambre suero precede el rasguño14 y disminuyendo la cantidad de suero15. Sin embargo, ninguno de estos métodos puede asegurar que no hay ninguna proliferación. Por lo tanto, se presenta un tratamiento previo de las células con el mitomycin C para obtener resultados verdaderos de la migración. La mitomicina C es un antibiótico que inhibe la síntesis de ADN mediante la formación de un enlace covalente con el ADN, lo que impide que el ADN separa16. Por el tratamiento con mitomicina C y lavar con PBS antes de rayar, el cierre detectado de la brecha muestra la verdadera migración de las células (figura 1).
Una característica de todos los métodos es la necesidad de un sistema para analizar el proceso de migración17. Común y un método económico para analizar el progreso es usar un microscopio de campo de luz para tomar imágenes de la cero en momentos predeterminados, seguidos de un análisis del cierre de la brecha en un software de imagen18,19. Este método es lento, poco fiable en cuanto a tomar fotografías en el mismo lugar y el enfoque, y el movimiento de la incubadora a cámara las fuerzas ciclos de cambios de temperatura mientras se toman fotos. Otros métodos se han desarrollado para detectar la migración midiendo el flujo de corriente. Los cambios actuales, como las células cubren más espacio en la placa, que se lee como un aumento en la impedancia20. Mediante la medición de impedancia, no se ve afectado el medio ambiente de las células, y por lo tanto se considera el método no invasivo. Este método se basa en platos especializados con electrodos de oro, que son caros, pero permiten la detección de muchos procesos, como la adhesión celular, proliferación, migración y muerte celular. Una gran desventaja de este método es que la medición de impedancia no indica directamente la migración, como factores como la temperatura tienen un gran impacto en la impedancia. Cambios en la impedancia pueden ser causadas por varios factores que no son revisados por el software, haciendo más difícil el análisis de los datos. Por lo tanto, la falta de visualización requiere un microscopio de luz convencional para verificar la migración.
Para superar muchos de los inconvenientes de las técnicas disponibles, utilizamos una cámara óptica automatizada en tiempo real. La cámara óptica es un sistema de detección con un microscopio de alto rendimiento en una plataforma pequeña con una lente, unidad de iluminación y una cámara digital. Cuenta con un software incorporado, que puede probar la migración y proliferación entre otras cosas. Para detectar la migración, se utilizan dos algoritmos para analizar el crecimiento y la cinética de la migración de las células, que se llaman la proliferación y la cicatrización análisis, respectivamente. El análisis de la proliferación se basa en un algoritmo de segmentación de imagen de dos etapas que se aplica el análisis de textura para detectar la diferencia entre zonas cubiertas de la célula (se muestra en amarillo) y vacío fondo áreas por análisis del histograma avanzado. La cicatrización de análisis se basa en un algoritmo de tres pasos que detecta la monocapa celular, localiza el boquete de la herida y determina el ancho de la brecha. Estos pasos se llevan a cabo en momentos determinados por el usuario y los datos se presentan como área cubierta, distancia y área de boquete. Una de las grandes ventajas de esta máquina es que permite la proyección de imagen de células adherentes a través de líquido debido al ángulo de la cámara21. Las imágenes de lenstakes inclinado de cámara que se proyectan a una pila de z de un solo plano z generan para asegurarse de que las fotos son foco (figura 2). pilas de z se generan por la fusión de la serie de fotografías (por ejemplo 40) perpendiculares al borde de la herida y a través de la herida toda. Las pilas de z permite la captación de la profundidad de la capa de células, así como un plano de foco a través de la herida. Además, la serie de imágenes se puede poner junto a una colección de vídeos de las imágenes con el clic de un botón.
Demostramos un protocolo optimizado para la detección de la migración en la línea celular de queratinocitos HaCaT. Hemos probado lactoferrina y su péptido N-terminal, Lactoferricin, de seres humanos y las vacas, para analizar su efecto sobre la migración como estas moléculas se han demostrado tener numerosas aplicaciones como antimicrobiano e inmune modulación de moléculas22 , 23. los cuatro compuestos se compararon con las células HaCaT no tratadas y factor de crecimiento epidérmico (EGF) fue utilizado como control positivo.
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Protocol
El montaje experimental no tiene ninguna restricción ética y jurídica y se llevó a cabo de acuerdo con la Universidad de Roskilde. Una visión general del montaje experimental se aprecia en la figura 1 y los mecanismos de la cámara óptica en la figura 2.
1. preparación
- Realizar todos los pasos en un banco de flujo laminar estéril limpiar la banca y todos los equipos con etanol al 70% antes del inicio del experimento.
- Coloque la cámara óptica en una incubadora convencional a 37 ° C con 5% CO2 para garantizar las condiciones óptimas para las células.
- Cultivar células HaCaT en medio DMEM con 10% FBS y 1 x antibióticos (penicilina y estreptomicina) en un matraz T75.
- Para separar las células y el cultivarlos cada 3-4 días, por la dispersión sobre la capa celular usar la tripsina de 1 x 1 mL. Precaliente a temperatura ambiente antes de usar.
2. generar una monocapa de HaCaT células en una placa de microtitulación de 48 pozos
- Retire el medio del frasco T75 con una pipeta Pasteur.
- Lavar las células adherentes en el matraz mediante la adición de 5 mL 1 x PBS estéril al matraz T75.
Nota: Asegúrese de que la PBS está libre de calcio y magnesio. - Circulan por el PBS y extraiga con una pipeta Pasteur.
- Repita el paso 2.2-2.3.
- Añadir tripsina de 1 x 1 mL en el matraz y dispersa a través de la capa de células.
- Incube el frasco a 37 ° C en una incubadora convencional hasta que las células son separadas (5-8 minutos es suficiente para la mayoría de las líneas de la célula).
- Ver bajo el microscopio si las células son separadas. Una vez que las células son separadas, añadir 9 mL de los medios de cultivo regular con 10% FBS para inactivar la tripsina 1 x.
- Cuenta la célula con cualquiera un hemocitómetro, un contador coulter o similares.
Nota: Azul de tripán puede utilizarse para ver las células muertas. Sin embargo, en tripsina 1 x HaCaT las células son redondas perfectamente cuando vivo. - Transferencia de 7.5 x 104 células/pozo en 250 μl 10% FBS media a una placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos fondo redondo (placa estándar).
Nota: ensayo también puede configurarse en 6, 12, 24-o placas de 96 pocillos, que todo pueden ser analizadas bajo el microscopio óptico. - Mueva suavemente la placa de lado a lado para asegurar que las células se distribuyen igualmente en los pozos o las células se reunirán en el centro de los pozos. Examinar bajo un microscopio de luz para asegurarse de que la célula es distribuida uniformemente en los medios de comunicación
- Poner la placa en un convencional incubador de CO2 a 37 ° C durante la noche o hasta que las células se han adherido a la parte inferior de los pozos.
3. Además de los estímulos para efectos de migración
- Comprobar si los pozos son confluentes de 90-95% bajo un microscopio de luz.
- Preparar 10 μg/mL de mitomicina C en una cantidad adecuada del medio.
Nota: En este estudio, la mitomicina C se mantiene a 4 ° C en una solución madre de 1 mg/ml. Mitomicina C en la solución puede ser almacenada una semana en la oscuridad a 2-8 ° C. - Retire los medios gastados con una pipeta Pasteur de cada pozo.
- Añadir 250 μl de 5 μg/mL de mitomicina C a cada pocillo.
- Incubar la placa por 2 h a 37 ° C y 5% CO2.
- Preparar estímulos de péptidos por diluir en una cantidad adecuada del medio.
Nota: En este estudio, tanto la humana y bovina lactoferrina y Lactoferricin fueron probados a 25 μg/mL en un volumen de 250 μl - Retire el medio con el mitomycin C con una pipeta Pasteur.
- Lave los pocillos 1 x con 250 μl de 1 x PBS (temperatura ambiente) y retire el lavado con un Pasteur pipeta.
- Añadir 250 μl de 1 x PBS y raspar manualmente los pozos verticalmente con una punta de pipeta de 200 μl. Utilice una nueva pipeta para cada pozo.
- Retirar el PBS y añadir estímulos de péptido de 250 μl.
- Monte la placa en sistema óptico de la cámara mediante el ajuste de los tornillos en ambos lados de la placa. Deje la tapa en la placa de microtitulación.
Nota: La cámara puede funcionar con la tapa abierta si es necesario.
4. configurar el programa para la cámara óptica en la computadora
- Haga clic en adquirir en la barra de tareas de la izquierda.
- Elija la función de la cicatrización de heridas en la barra de tareas de la izquierda.
- Seleccione el tipo de placa haciendo clic debajo de la ilustración de la placa.
- Anular la selección de pozos, no esté en uso, marcándolos y haga clic en Activar en la parte superior izquierda de la pantalla.
Nota: Todos los pozos se seleccionan por defecto. - Ajuste el enfoque de la lente en los pozos para ajustar la posición de las celdas haciendo clic derecho en uno de los pozos.
Nota: Enfoque automático también se puede ajustar manualmente moviendo la barra hacia la derecha de la ilustración de la placa. - Establecer el período de tiempo para imágenes en el Cuadro intervalo (por ejemplo, (00: 30:00)).
- Establecer el número de repetición para el período deseado (por ejemplo 97 repeticiones).
- Iniciar la ejecución pulsando el botón Start en la esquina inferior derecha.
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Representative Results
HaCaT es una línea de celular de queratinocitos, uno de los tipos celulares más abundantes en la piel. Cuando se produce una herida, las células de la piel comienzan a proliferar y migrar más al lecho de la herida para cerrar la herida (figura 3). Ambos procesos son, por lo tanto, de suma importancia para la curación adecuada.
La cámara óptica puede seguir ambos procesos en tiempo real. Para la migración, el sistema proporciona tres conjuntos de datos: célula cubierta área, distancia y área de boquete. Cuando supervisar rayas tratadas con lactoferrina, Lactoferricin o EGF, el microscopio óptico nos permite vigilar estos tres parámetros con el tiempo. Después de 48 h de incubación, se observa que la EGF ha dado como resultado 95% de cierre de la herida, en comparación con el 38% de cierre del control sin tratar (Figura 3A). Las diferentes versiones de lactoferrina y Lactoferricin se colocan entre 33% y 62% herida cierre con los péptidos siendo más potente que las proteínas de la matriz. El porcentaje de cierre de la herida, determinado a partir de cambios en el ancho de la brecha desde el cero inicial, también puede ser graficados (figura 3B).
Las células HaCaT tienen una interacción célula-célula fuerte y cuando las células migran, serie de pasos es necesarios24. Dentro de poco, las células principales interrumpen su sitio de adherencia, sobresalen y contratación el citoesqueleto para mover25. La protuberancia de las células principales se puede ver fácilmente con la cámara óptica (figura 4).
Figura 1 : Diagrama de flujo esquemático de la prueba de scratch para probar la migración con una cámara óptica. Las células HaCaT plateadas en una placa de 48 pozos y permitió a adherirse para 24 h. Las células son previamente tratadas con mitomicina C por 2 h para inhibir la proliferación, y el rasguño es realizado y seguido por la adición de estímulos de péptido. La placa se inserta en la unidad de la cámara óptica y migración es seguida por 48 h.
Figura 2 : La tecnología de exploración de la cámara óptica. El aparato óptico de la cámara óptica automatizada está en ángulo a 6,25 º respecto al plano horizontal para permitir la exploración de diferentes soluciones como bacteriana y celular. La serie adquirida de imágenes contiene pilas de imagen de los focos, fuera de foco y foco, para asegurar imágenes con las células en el foco. Modificado de26.
Figura 3 : Migración de la célula de pretratado mitomicina C HaCaT durante 48 horas. (A) migración se detecta de la cámara óptica automatizada cada media hora durante 48 h. Las células se tratan previamente con el mitomycin C para inhibir la proliferación. Las células se tratan con 25 μg/mL ya sea humano o bovino-frente a lactoferrina (LF H o B-LF) o - Lactoferricin (H-LFcin, B-LFcin). Factor de crecimiento epitelial (EGF) se utiliza como un control positivo a 500 ng/mL. Las células HaCaT no tratadas se utilizan como un control. (B) ilustración gráfica de la migración de los tratamientos. Los resultados son representantes de tres carreras independientes, y resultados se dan como un cierre de porcentaje de la inicial cero * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.
Figura 4 : Que sobresalen lamellipodia de trata las células HaCaT. Lamellipodia de las células HaCaT está marcada por las flechas negras. La interacción fuerte de la célula de la HaCaT resulta en movimiento dinámico de las células que migran y pueden ser observados fácilmente con el tiempo.
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Discussion
La importancia de la migración en los estudios del desarrollo, la cicatrización de heridas, Inmunología y cáncer ha llevado a varios métodos para estudiar la migración. La migración puede ser una expresión de la expansión o el cierre de la brecha por las células. Se prueba más a menudo posible cierre del cero, que es más fácil crecer las células en una monocapa y luego hacer un rasguño que el crecimiento de las células en forma específica8. Nuestro estudio demuestra un método optimizado para rayar manual, ya que la técnica es fácil de dominar y de bajo costo. Hemos introducido el ADN síntesis inhibidor la mitomicina C, un lavado extra para optimizar el rasguño comparado con métodos publicados18y el uso de una cámara óptica que permite estudios de alto rendimiento.
El ensayo de rayado en vitro requiere una línea de células adherentes que enlaza correctamente a la parte inferior de los pozos y para detectar la migración sobre un rasguño, proliferación debe ser inhibida. Estas dos características son esenciales para el análisis. Para detectar la verdadera migración, varios acercamientos se han descrito con reducción de la concentración del suero, hambre de la célula antes de rayar el14, DMSO o varios inhibidores 13,27. En general, puede utilizarse un medio libre de suero, sin embargo, algunas células, como las líneas de célula primaria, necesidad de suero para el movimiento y la supervivencia general. Por lo tanto, la elección debe hacerse según la línea celular. Líneas celulares que requieren recubrimiento pueden ser problemáticas en este ensayo, como rasguños manual alterará la capa así.
Diferentes tipos de células requieren el número diferente de células para formar una monocapa confluente dependiendo de su tamaño y tasa de crecimiento. Las células HaCaT adhieran después de alrededor de 4-6 h pero se dejan para resolver durante la noche para hacer una capa monomolecular estable. Una de las principales desventajas de la prueba de scratch es rayas irregulares8. En este estudio, mostramos que previamente lavado con PBS y el rasguño en PBS nuevo disminuyen acumulaciones de células heridas y dañadas a lo largo de los bordes del scratch. Esto podría explicar plausible por la Unión de desmosomas conectan las células de la piel. Las uniones son Ca2 +-dependiente24 y mediante el uso de PBS, se eliminan los cationes, que podría debilitar la adherencia de la célula-célula fuerte. Por lo tanto, el uso de PBS podría permitir la mejor eliminación de las células individualmente, llevando a menos acumulación de las células a lo largo del borde de la herida. Además, la cámara óptica mide una gran parte de los pozos de todos los tamaños de placa y se adapta a bents en cero a través de su algoritmo de tres pasos. Por lo tanto, previo lavado con PBS y utilizando la cámara óptica, se eliminan las desventajas de los rasguños manual. Z-apilado de imágenes hace centrándose en las células más precisas, pero dependiendo de cómo los diferentes tipos de células crecen, el foco puede ser un problema. Si las células crecen demasiado, el foco de la cámara cambiará de foco a fuera de enfoque. Por lo tanto, si la mitomicina C no se utiliza, puede ser ventajoso para establecer el foco un poco más alto si su disposición experimental tendrá una duración de más de 24 h. La cámara óptica tiene una configuración sencilla que funciona a través de una computadora estándar con un software intuitivo que puede medir las placas desde 6 a 96-bien las placas de microtitulación y por lo tanto permite varias configuraciones de prueba. Al elegir el número de imágenes a tomar, existen algunas limitaciones. Si se utiliza una placa de 96 pocillos, el número de imágenes se puede obtener es solo limitado a espacio en el equipo, como conjuntos de datos puede ser grande y por la velocidad de la cámara. Si se requieren muchas imágenes en una sucesión rápida, el movimiento de la cámara puede ser un factor limitante, ya que necesita tiempo para analizar cada uno bien.
El sistema óptico permite simple pero potente seguimiento. Las fotos de la raya se analizan en relación con el proceso del cierre de la brecha pero pueden utilizarse también para la caracterización morfológica de las células. El software marca las células de amarillo y deja el color de fondo gris como una característica estándar, para visualizar mejor el borde de la herida, aunque imágenes raw obviamente están disponibles sea necesario realizar por ejemplo, publicaciones. Las células HaCaT tienen interacciones célula-célula fuerte que hacen que la migración se presentan en una hoja dinámica28. Esta característica hace fácil ver lamellipodia de migración de las células con el tiempo (figura 4).
Este estudio demuestra el efecto de las proteínas lactoferrina y sus péptidos derivados del N-terminal Lactoferricin y EGF como control positivo, pero podría modificarse para probar diferentes fármacos, péptidos/proteínas y combinaciones, como inhibidores o estimuladores de de la cicatrización de heridas. El ensayo de rayado puede ser alterado y optimizado para adaptarse a diferentes líneas celulares y compuestos que pueden afectar a la migración. Juntos, con su bajo costo y fácil manejabilidad, este ensayo es muy accesible para la mayoría de los laboratorios. La cámara óptica podría usarse para probar diferentes fármacos, inhibidores o estimuladores de la migración y proliferación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Consejo Danés de investigación independiente, tecnología y producción, otorgar #4005-00029
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| oCelloScope | BioSense Solution ApS | Optical camera | |
| UniExplorer software | BioSense Solution ApS | (8.0.0.7144 (RL3)) | |
| HaCaT cell | Donated from Bispebjerg Hospital | ||
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | Medium for HaCaT |
| FBS | Gibco | 10270 | Fetal bovine serum |
| PBS | Gibco | D837 | Without Mg+ and Ca2+ |
| Pencillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | Antibiotics |
| Trypsin (10x) | Sigma | T3924 | |
| Mitomycin C | Tocris | 3258 | Inhibits proliferation |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 677 180 | |
| Incubator | Panasonic | 37°C, 5% CO2 | |
| Hemocytometer | Assistent | Türk (0.1 mm) | |
| Pipet boy | Accu-Jet pro |
References
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