Summary
Gut vært-mikrobe interaktioner blev vurderet ved hjælp af en ny tilgang, der kombinerer en syntetisk mundtlige Fællesskabet, in vitro- mave fordøjelse og en model af tyndtarmen epitel. Vi præsenterer en metode, der kan tilpasses til at evaluere celle invasion af patogener og flere arter biofilm, eller selv at teste probiotiske formuleringer overlevelsesevne.
Abstract
Samspillet mellem vært og mikrobiota har længe erkendt og udførligt beskrevet. Munden er magen til andre dele af mave-tarmkanalen, som hjemmehørende mikrobiota opstår og forhindrer kolonisering af eksogene bakterier. Ja, mere end 600 arter af bakterier findes i mundhulen, og et enkelt individ kan bære omkring 100 forskellige når som helst. Orale bakterier besidder evnen til at overholde de forskellige nicher i den mundtlige økosystem, således at blive integreret i resident mikrobielle samfund, og fremme vækst og overlevelse. Strømmen af bakterier i tarmen under synke har imidlertid været foreslået at forstyrre balancen i gut mikrobiota. I virkeligheden, flyttet oral administration af P. gingivalis bakteriel sammensætning i ileal mikrofloraen. Vi brugte en syntetisk Fællesskabet som en forenklet gengivelse af den naturlige mundtlige økosystem, for at belyse overlevelse og rentabilitet af orale bakterier udsat for simuleret gastrointestinale transit betingelser. 14 arter blev valgt, udsat for in vitro- spyt, mavens og tarm fordøjelsen processer og præsenteret for en multicompartment celle model Caco-2 og HT29-MTX celler for at simulere gut slimhinde epitel. Denne model tjente til at udrede konsekvenserne af indtagelse bakterier på celler involveret i den enterohepatiske cirkulation. Ved hjælp af syntetiske Fællesskaber giver kontrollerbarhed og reproducerbarhed. Således, denne metodologi kan tilpasses til at vurdere patogen levedygtighed og efterfølgende betændelse-associerede forandringer, kolonisering kapacitet af probiotiske blandinger, og i sidste ende, potentielle bakteriel påvirke præsystemisk cirkulation.
Introduction
Mennesker bor sammen med bakterier, som findes på det samme nummer som menneskelige celler1. Derfor er det af afgørende vigtigt at opnå en omfattende forståelse af den menneskelige microbiome. Mundhulen er et unikt miljø, idet den er opdelt i flere mindre levesteder, som således indeholder en lang række bakterier og biofilm i de forskellige steder. Som et åbent økosystem, kan nogle arter i munden være forbigående besøgende. Dog kolonisere visse mikroorganismer snart efter fødslen og form organiseret biofilm2. Disse findes i tænder overfladen ovenfor gingival sprække, subgingival sprække, tunge, slimhindeinfektioner og dental proteser og fyld3. Bakterier kan også være til stede som flocs og planktoniske celler i lumen af tand-kanalen, enten blandet med nekrotisk pulp væv eller opslæmmet i en væske fase.
Der er aktive, sammenhængende cross-talk mellem værtsceller og bosiddende mikrobiota4. Bakterier kommunikere inden for og mellem arter, og kun en lille del af de naturlige kolonisatorer kan overholde væv, mens andre bakterier tillægger disse primære kolonisatorer. F.eks. celle-celle bindingen mellem mikroorganismer er nøglen for at integrere sekundære kolonisatorer i orale biofilm, og opbygge komplekse net af vekselvirkende mikrobielle celler4. Omkring er 70% af bakteriel aggregater i en spyt prøve dannet af Porphyromonas sp., Streptococcus sp., Prevotella sp., Veillonella sp. og uidentificerede Bacteroidetes. F. nucleatum er en mellemliggende kolonisator i subgingival biofilm og aggregater med de sene kolonisatorer P. gingivalis, T. denticola, og Tannerella forsythia, som er impliceret i parodontitis5. Derudover indtager Streptococcus mitis både slimhinde og dental levesteder, mens S. sanguinis og S. gordonii foretrækker at kolonisere tænder3. Således er, S. sanguinis til stede i nedre fortænder og hjørnetænder, mens Actinomyces naeslundii er blevet fundet i øvre anteriors6.
Derudover spiller de indfødte microbiome en rolle i at bevare sundhed2. Hjemmehørende mikrobiota deltager i immun uddannelse og forebyggelse af patogenet ekspansion. Denne kolonisering resistens opstår, fordi de indfødte bakterier kan være bedre tilpasset på knyttet til overflader, og mere effektiv på metabolising de tilgængelige næringsstoffer for vækst. Selvom probiotiske stammer overleve den gastrointestinale passage og forbliver aktive, er persistens på autoktont bakterier slugt en øvre beliggenhed af mave-tarmkanalen ikke blevet fuldt beskrevet. Dermed, vi underkastes en kunstig Fællesskabet, repræsentant for den mundtlige økosystem, simulerede gastrointestinale transit betingelser. Levedygtighed af bakterieceller blev vurderet ved hjælp af en multicompartment model, der ligner tarm epitel. Nuværende gut simulatorer tilbyde passende reproducerbarhed hvad angår analyse af den luminale mikrobielle samfund7. Dog er bakteriel adhæsion og vært-mikrobe interaktion særskilt behandlet, som kombinerer cellelinjer med mikrobielle samfund er udfordrende8. Derimod præsenterer vi en ramme, der giver potentielle mekanistiske forklaring af vellykket kolonisering begivenheder rapporteret på grænsefladen gut. Ja, denne model kan i fællesskab bruges med en statisk gut model til at evaluere virkningen af mikrobielle samfund på vært overflade signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. stammer og kultur betingelser
Bemærk: Syntetisk mundtlige Fællesskabet blev komponeret af stammer ofte er til stede i den mundtlige microbiome3.
- Opnå de følgende stammer fra amerikansk Type kultur samling (ATCC): Aggregatibacter tanddannelsesforstyrrelser (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Streptococcus gordonii (ATCC 49818), Actinomyces viscosus (ATCC 15987), og Streptococcus mitis (ATCC 49456).
- Erhverve Veillonella parvula fra Leibniz Institut DSMZ-tysk samling af mikroorganismer og cellekulturer (DSM 2007), Streptococcus sanguinis fra samlingen BCCM/LMG bakterier (LMG 14657) og bruge Streptococcus salivarius stamme TOVE-R9, og Streptococcus oralis10.
2. udvikling af en Multispecies Fællesskabets repræsentant for den mundtlige Microbiome
Bemærk: Generere en syntetisk samfund til at simulere den potentielle vedhæftning kapacitet af orale bakterier til in vitro- tarm epitel. Vokse bakterier på blod agar plader suppleret med 5 μg/mL Pia, 1 μg/mL menadion og 5% sterilt defibrinated hest blod, som beskrevet i Hernandez-Sanabria et al. (2017) 11. I korte træk:
- Opløs 100 mg af Pia i 2 mL 1 M NaOH, tilsættes 100 mL destilleret autoklaveres vand. Opbevares i en mørk beholder. Sterilisere gennem et 0,22 µm filter før du tilføjer til medium.
- Opløs 100 mg af menadion i 20 mL 96% ethanol. Sterilisere gennem et 0,22 µm filter før du tilføjer til medium.
- Forberede 1 liter blod agarsubstratet (Se Tabel af materialer) ifølge producentens anvisninger og autoklave. Lad køle før du tilføjer hest blod og kosttilskud. Bland og hæld pladerne.
- Forberede modificerede hjernen hjerte Infusion (BHI) bouillon som tidligere rapporteret12. Tilføj 5 μg/mL af Pia og 1 μg/mL menadion efter autoklavering.
- Give afkald 9 mL medium i Hungate rør, og lukkes med en gummiprop og en aluminium cap. Skyl rør med N2/CO2 (90% / 10%).
- Hente 1 mL af anaerobe medium med en sprøjte og læg det i 1,5 mL microcentrifuge rør. Vælge enkelt kolonier af hver bakteriearter, resuspend på mellemlang og overføre tilbage i den anaerobe modificerede BHI. Der inkuberes i 48 timer ved 37 ° C, med undtagelse af S. salivarius, som skal være inkuberes i 24 timer.
-
Hvis det er nødvendigt, bekræfte renhed af kulturer inden montering syntetiske Fællesskabet. I korte træk:
- Uddrag DNA fra de flydende kulturer som Hernandez-Sanabria et al. (2010) 13 og forstærke 16S rRNA gen ved hjælp af primere 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) og 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT), og følgende program: 5 min. ved 95 ° C, 30 cykler på 95 ° C i 1 minut, 55 ° C i 1 min., og 72 ° C i 1,5 min, efterfulgt af en sidste udvidelse trin 5 min. på 72 ° C.
- Rense PCR produktet med en kommerciel kit (Se Tabel af materialer), efter fabrikantens anvisninger.
- Udføre sekventering reaktion af de oprensede produkter i en 10 μL samlede volumen indeholdende 0,5 μl af farvestof (Se Tabel af materialer), 3,2 pmol M13f primer (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC), 2,0 μL af 5 x sekventering buffer og 20 ng af skabelonen, ved hjælp af en kommercielle sekventering system med kit (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Vi havde denne procedure udføres kommercielt. - Udføre en BLAST søgning på alle sekvenser (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) til at bestemme den nærmeste kendte taksionomiske gruppe og sammenligne med rækkefølgen af den oprindelige stamme ved hjælp af RDP klassificeringen online værktøj (http://rdp.cme.msu.edu/) og SINA Tilpasning service (https://www.arb-silva.de/aligner/).
- Måle celle nummer i slutningen af inkubation, ved hjælp af flowcytometri og SYBR Green/Propidium Iodid pletten som beskrevet i Hernandez-Sanabria et al. (2017) 11. fortyndet kulturer til 105 celler mL-1, ved hjælp af modificeret BHI.
- Der tilsættes 1 mL af S. mitis til 75 mL af anaerobe BHI og inkuberes indtil stationære fase (6 h). Efter, indsamle 0,75 mL hver fortyndet stamme og blandes under anaerobe forhold.
- Når alle kulturer har været blandede, tage 1 mL af mikrokosmos, og tilføje til BHI 75 mL. Inkuber syntetiske Fællesskabet under 10% CO2, 10% H2, 80% N2 i 48 timer ved 37 ° C og 200 rpm (Se Tabel af materialer).
- Måle celle tæthed som 2,8. forelægge EF til celle model. Sammensætning af Fællesskabet kan vurderes med kvantitative Real-Time PCR, ved hjælp af primere og udglødning temperaturer i tabel 1 i Slomka et al. (2017) 10. Derudover bruge 16S rRNA gen-amplikon sekvensering til at give oplysninger om de oprindelige medlemmer til stede13,14. Enten bekræftelse af identitet-protokollen bruger cDNA som en skabelon til at angive bakterier aktivt transskribere proteiner og bruge DNA som en skabelon til at afsløre tilstedeværelsen eller mangler stammer.
3. generelle cellekultur praksis
Bemærk: For generelle aspekter af cellekultur, forfatterne henvise til Master og Stacey (2007)15. Få cellelinjer anvendes fra den europæiske samling af godkendte cellekulturer (Caco-2 ECACC 86010202 og HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, Public Health England, UK). Reagenser til cellekultur kan købes (Se Tabel af materialer), medmindre andet er angivet.
-
Vedligeholdelse og passaging af Caco-2 og HT29-MTX cellelinjer
Bemærk: Caco-2 og HT29-MTX celler dyrkes rutinemæssigt i 25 cm2 vævskultur flasker der indeholder suppleret DMEM medium (tabel 1). Celler er trypsinized når 60 – 70% sammenløbet er nået.- Fjerne cellekulturmedium fra kolberne. Vaskes to gange med 5 mL PBS uden Ca++/Mg++.
- Der tilsættes 2 mL 0,5 mg/L opløsning af trypsin og 0,22 g/L ethylendiamin tetraacetic acid (EDTA). Distribuere trypsin løsning ved at forsigtigt flytte kolben. Fjerne 1,5 mL trypsin opløsning og inkuberes i kolben ved 37 ° C i 10 min.
- Check under mikroskop hvis celler er løsrevet fra kolben overflade. Der inkuberes i yderligere 5 min, hvis det er nødvendigt.
- Tilsættes 5 mL af suppleret celle kultur medier kolben til at inaktivere trypsin. Med pipette overfoeres op og ned for at opnå en homogen enkelt cellesuspension.
- Straks, tage en 50 µL alikvot af cellesuspension og bland med steril 0,4% Trypan blå opløsning i en 1:1 (v/v) andel for Caco-2-celler eller 1:5 v/v for HT29-MTX. Mix af pipettering og belastning i en optælling kammer (Se Tabel af materialer).
- Tælle de levedygtige celler (hvide lyse celler) under mikroskop (Se producentens instruktioner).
- Frø i en ny kolbe med en tæthed på 4 x 105 celler/cm2 og 1 x 104 celler/cm2, Caco-2 og HT29-MTX, henholdsvis.
Bemærk: (1) Caco-2 celler differentiere og danner stramme kryds én gang at nå confluency. Det er yderst vigtigt at undgå over-confluency før trypsinization. Overvækst af celler i kolben kan forårsage svigt i celle løsrivelse efter trypsinization og/eller celle klumper. (2) HT29-MTX celler er slim-producerende celler med høje metaboliske aktivitet16. Disse funktioner kan give en hurtig forsuring af celle kultur medier, især hvis celler er på høj densitet. HEPES buffer kan føjes til cellekulturmedium (tabel 1) for at opretholde pH mellem 7 og 7.2. Hvis pH falder, medium kan blive udvekslet når confluency er mindre end 50%. Men hvis confluency > 50%, den cellekultur skal opdeles.
4. montering af en Multicompartment celle Model simulerer den Gut Host-mikrobe grænseflade
Bemærk: Fuldføre fælles kultur i dobbelt kammer wells (diameter 24 mm, pore størrelse 0,4 μm; Se Tabel af materialer).
- Tilsættes 1,5 mL komplet celle kultur medier til apikale rum og 2 mL til det basale. Pre Ruger i 20-30 min. at få jævn fordeling af cellesuspension når såning.
- Trypsinize cellekultur af Caco-2 og HT29-MTX, som beskrevet i afsnit 3. Trypsinization procedure skal følges nøjagtigt for at opnå homogen fordeling af begge cellelinjer, i en enkelt cellesuspension, uden klumper.
- Tælle de levedygtige celler, som beskrevet i 3.1.8.
- Justere celle tæthed til 6,5 x 104 celler/cm2 i en 90/10 del af Caco-2/HT29-MTX celler.
- Homogeniseres celle suspensioner og tilføje de tilsvarende volumen af Caco-2 og HT29-MTX celler til en fyldt steril beholder med suppleret celle kultur medier. Fjerne præ rugede medier fra den apikale side af kammeret ved aspiration.
- Forsigtigt blandes cellesuspension af pipettering, og overføre 1,5 mL til den apikale rum af kammeret skær. Proceduren for såning kræver en konstant homogenisering af cellesuspension, som cellerne har tendens til at sediment. Afhængigt af erfaring med bruger og arbejder hastighed, skal cellesuspension blandes efter udlevering 1 – 3 brønde.
- Flytte plader forsigtigt frem og tilbage og derefter til højre til venstre mod højre (5 – 10 gange) at opnå en endnu spredning af celler i brønden. Overføre til rugemaskine og Gentag bevægelsen af pladerne.
- Opretholde fælles kultur af Caco-2/HT29-MTX celler for 15 dage, forfriskende apikale og basal rum hver 2 dage med suppleres med DMEM. Efter dette tidspunkt, kan celle Kulturmedier ændres til suppleres med DMEM uden antibiotika/antimykotikum løsning.
- Vedligeholde systemet indtil 20 – 21 dage efter såning af forfriskende medium hver 2 dage.
-
Måle epitel barriere integritet før du starter assay, ved hjælp af en elektrisk modstand System (se tabel af materialer), efter producentens anvisninger.
- Sikre at TEER udstyr er fuldt opladet (> 24 timer) før du starter målingen.
- Afbryde TEER udstyr fra strømforsyningen og dækslet med en plastik autoklave taske. Lav et hul i posen til at indføre elektroden og tilsluttes inputport på måleren. Spray med 70% ethanol/vand (v/v) før at indføre TEER udstyr ind i flow kabinettet.
- For at desinficere elektroden, fordybe elektrode tips i 70% ethanol/vand (v/v) opløsning i 15 min. Tillad til luft tørre for 15 s. Skyl elektrode i pre varmede celle kultur medier.
- Tage celler ud af rugemaskinen og tillade celler til at komme til stuetemperatur inden strømmen kabinet.
- Kontroller, at måleren er afbrudt fra opladeren. Indstil tilstand på ohm og slå afbryderen på.
- Måle celle modstand ved at nedsænke elektroden med kortere spidsen i indsatsen og den længere spids ud af brønden. Holde elektrode i en 90° vinkel på plade Indsæt.
5. bakterielle overlevelse efter In Vitro gastrointestinale Transit betingelser
Bemærk: Forberede simulerede fordøjelsen væsker efter protokollen af Minekus et al. (2014) 17, med de ændringer, der er beskrevet nedenfor. Forberede alle fortyndinger med ultrarent vand. Filter-sterilisere alle løsninger gennem et 0,22 µm filter og udføre vådforaskningen under sterile forhold.
-
Mundtlige fordøjelsen:
- Placer 3 mL af den bakterielle samfund i en 50 mL sterilt tube, blandes med 3 mL af simulerede spyt væske (SSF), der indeholder (i mmol L-1): KCl, 15.1; KH2PO4, 3.7; NaHCO3, 6.8; MgCl2(H2O)6, 0,5, (NH4) CO3, 0,06; HCl, 1.1; CaCl2(H2O)2, 0,75. Tilføje 75 U/mL af α-amylase fra humant spyt Type IX-A og 2 g/L mucin fra svin mave type II til SSF.
- Inkuber blanding for 2 min. ved 37 ° C, og 100 rpm. Indsamle en 2 mL prøve for DNA-ekstraktion og flow flowcytometri kvantificering (S1).
-
Gastrisk fordøjelsen:
- Der tilsættes 4 mL af simulerede gastrisk væske (SGF), der indeholder (i mmol L-1): KCl, 6.9; KH2PO4, 0,9; NaHCO3, 25; NaCl, 47.2; MgCl2(H2O)6, 0,1, (NH4) CO3, 0,5; HCl, 15,6; CaCl2(H2O)2, 0.075. Derudover indeholdt SGF 2 g/L af mucin fra svin mave type II.
- Måle pH og justeres til pH 3 med 1 M HCl, hvis nødvendigt. Der inkuberes ved 37 ° C og 100 rpm. Indsamle en 2 mL prøve (S2).
-
Tyndtarmen fordøjelsen:
- Der tilsættes 4 mL af simulerede intestinal væske (SIF) indeholdende (i mmol L-1): KCl, 6.8; KH2PO4, 0,8; NaHCO3, 85; NaCl, 38,4; MgCl2(H2O)6, 0,33; HCl, 8.4; CaCl2(H2O)2, 0,3; til fordøjelsen tube.
- Justeres til pH 7 med 1 M NaOH, hvis nødvendigt. Der inkuberes ved 37 ° C og 100 rpm. Indsamle en 2 mL prøve (S3).
6. bakteriel kolonisering evne efter In Vitro gastrointestinale Transit betingelser
- Der centrifugeres 2 mL af tyndtarmen fordøjelse, for 10 min. ved 2.650 x g.
- Fjern supernatanten og bland den bakterielle pellet med 5 mL af suppleres med DMEM uden antibiotika og antimykotikum.
- Pletten og kvantificere intakt/beskadigede celler ved hjælp af en flow forskellige (Se Tabel af materialer), som beskrevet af Hernandez-Sanabria et al. (2017) 11.
- Justere celle tæthed til 105 levedygtige celler/mL ved fortynding i suppleres med DMEM uden antibiotika og antimykotikum.
- Fjerne den apikale medium af transwell systemet og der tilsættes 1,5 mL af den bakterielle suspension. Co kultur system for 2 h under generelle celle kultur betingelser (37 ° C, luftfugtighed 95%, 5% CO2).
Bemærk: Denne periode kan forlænges op til 48 timer, afhængigt af den eksperimentelle protokollen kræves. Fælles kultur kan fastholdes i en anden rugemaskine end der anvendes til rutinemæssig celle vedligeholdelse, for at undgå kontaminering. - Måle TEER værdier efter inkubation, at evaluere integriteten af den epitel barriere, som beskrevet i 4.11.
- Efter at have afsluttet inkubationstiden, fjerne apikale medier og indsamle 0,5 mL for yderligere analyser (S4). En delprøve af medier kan bruges til vurdering af cellernes levedygtighed af laktat Dehydrogenase (LDH) assay (Se Tabel af materialer), efter producentens anvisninger.
- Tilføje 0,5 mL af 10 mM N-acetylcystein i HBSS (NAC-buffer) solubilize Slim produceret af HT29-MTX og genoprette overholdt bakterier. Inkuber plader ved 37 ° C i 1 h, under omrøring (135 rpm, se Tabel af materialer).
- Genskab NAC-HBSS i et microcentrifuge rør (S5) og to gange cellerne vaskes med 1 mL DPBS.
- Der tilsættes 0,5 mL 0,5% Triton X-100 (w/v) på toppen af encellelag, cellerne sprænges af pipettering, genoprette væske og vortex for 1 min. hastighed er afgørende for at undgå at beskadige bakterieceller med vaskemiddel.
- Centrifugeres celler i 5 min på 2.650 x g, og separat supernatanten (S6) og pellet (S7).
7. prøve analyse
Bemærk: Analysere indsamlede prøver (S1-S7) at evaluere bakteriel levedygtighed og vedhæftning potentielle til tarmcellerne, efter en simuleret gastrointestinale fordøjelsen.
- Bakteriel levedygtighed: passere prøver S1-S5 to gange gennem et 0,45 µm og kvantificere bakterieceller ved hjælp af live/døde celle farvning og flow flowcytometri, som angivet i trin 2.811.
-
Vedhæftning potentielle: forberede serielle fortyndinger (-1 til -8) til S1-S6 og streak 10 µL i blod agar og modificeret BHI plader. Der inkuberes ved 37 ° C under anaerobe forhold for 24-48 h. plade i samme mængde ufortyndet S7.
- Taksonomisk identifikation af bakterier, overholdt:
- Vælge enkelte kolonier med en kultur loop og resuspend hver på 10 µL af nukleasen-gratis vand. Indsamle 4 µL af denne suspension og bruge det som skabelon til PCR-amplifikation af 16S rRNA-genet ved hjælp af primere og betingelserne beskrevet i 2.7.1.
- Udføre sekventering efter protokollen i 2.7.3 og validering af sekvensen ved hjælp af den procedure, der findes i 2.7.4.
- Taksonomisk identifikation af bakterier, overholdt:
- Gøre videre downstream analyse som samlede DNA-ekstraktion, qPCR kvantificering og/eller 16S rRNA-amplikon sekventering, RNA udvinding og transkriptom profilering som ønsket.
Bemærk: Strømmen flowcytometri kvantificering blev udført umiddelbart efter prøveudtagning. Som kontrol for membran-permeabilized celler anvendtes en prøve udsat til 70 ° C i 3 min. Baggrundsstøj blev vurderet ved at måle med flowcytometri fordøjelsen væsker eller prøver fra celle kultur model uden bakterier. Hver prøve blev målt i tre eksemplarer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol fører til generation af en model velegnet til belyse overlevelse og rentabilitet af orale bakterier udsat for simuleret gastrointestinale transit betingelser. Greverne af intakt celler fra enkelte stammer er ca 108 celler mL-1 før oprettelsen af syntetiske Fællesskabet, mens multispecies mikrokosmos indeholdt over 90% af levedygtige celler under oprettelsen af Fællesskabet ( Figur 1A og 1B). Baseret på Live/døde kvantificering, falder bakteriel levedygtighed efter hver fordøjelse trin (figur 2). Dette kan være et resultat af sure pH under gastrisk passage og af galde salte indeholdt i tyndtarmen fordøjelsen væsker, som forekommer under fysiologiske forhold. Levedygtighed under transitten gennem både in vitro og i vivo gastrointestinale fordøjelsen kan afhænge af variationer i miljøet (f.eks. fed vs fastede betingelser), eller endda på bakterier beskyttelse processer (spore dannelse eller enterisk belægning).
Flow cytometric tæller skal sammenlignes med passende Kontroller, såsom varme-dræbte bakterier eller baggrunden prøver, at udføre nøjagtige levedygtige celle kvantificering18. De barske betingelser i mave og tyndtarm fordøjelsen kan skifte bakterier til levedygtige, men ikke-bestemmelse celler, som er levende bakterier, der ikke enten vokse eller opdele. Af denne grund afviger plade tæller fra levedygtige celletal fremstillet med flowcytometri. For eksempel, i figur 3, er levedygtige celler inddrives fra grænsefladen slimhinde farvet i blå i flow flowcytometri plot. Dog blev ingen vækst observeret, når disse Slim prøver var forgyldt (resultater ikke vist).
Den brøkdel, som bakterier Vis højere levedygtighed satser er celleaffald (S7), som fremgår af plade tælle (figur 4). Antallet af kolonier kan være variabel, men tilstedeværelsen af metabolisk aktive bakterier er fundet i de mindre fortyndede prøver.
Figur 1: Cellernes levedygtighed af bakterier komponere den multispecies mikrobielle samfund i begyndelsen af in vitro- mave fordøjelsen. (A) levedygtige celletal (log enheder) kvantificeres ved live/død farvning og flow flowcytometri (gennemsnit ± standardafvigelse, n = 3). (B) repræsentative flow flowcytometri plot af den multispecies mikrobielle samfund efter 48 h, fælles kultur. Prikker i grøn, rød og sort repræsenterer levedygtige, beskadiget og baggrund eller ikke-klassificerede bakterier, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: cellernes levedygtighed af bakterier efter den simulerede gastrointestinale fordøjelse. Søjler repræsenterer antallet af levedygtige celler (log enheder) efter de mundtlige, gastriske og lille tarm fordøjelsen trin (gennemsnit ± standardafvigelse, n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant plot af levedygtige bakterieceller i den slimhinde interfasen. Røde prikker repræsenterer baggrund og blå prikkerne de levedygtige celler. Flowcytometri strømningsforhold blev udarbejdet på grundlag af rekvisitter et al. (2016) 19. slimhinde prøver blev fortyndet 1: 100 (v/v) og farves med Sybr Green/Propidium Iodid til 15 min, og 100 µL af prøven blev målt til FL1: 533/30 nm, FL2: 585/40 nm, FL3: > 670 nm lang pass, og FL4: 675/25 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: kolonidannende enheder (CFU) vokset fra celleaffald i modificeret BHI plader. Tre biologiske replikater blev brugt til bakteriel adhæsion assay og tre tekniske replikater blev udført for CFU kvantificering. To Repliker plader der indeholder -1 til-6 fortyndinger celle debris (S7) er vist i figur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Cellekultur | Tilhænger / Suspension | Dyrkning Medium | Almindelige kosttilskud | Specifikke kosttilskud | Fordobling tid | Inkubation betingelser |
| CaCO-2 (ECACC 86010202) | Tilhænger | Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) med 4,5 g/L glukose | Inaktiverede føtal bovint serum (10% v/v) Penicillin (100 U/mL) * Streptomycin (0,1 mg/mL) * Amphotericin (0.0025 mg/mL) * |
Glutamax (4 mM) Ikke essentielle aminosyrer (1% v/v) Pyruvat (1 mM) |
65-72 h | 95% fugtighed og 10% CO2 CO2 inkubator (Se Tabel af materialer) |
| HT29-MTX (ECACC 12040401) | Tilhænger | HEPES (1 mM) | 20 – 24 h | |||
| * Antibiotika og svampemidler blev fjernet fra celle kultur media 2 dage før du starter assays. | ||||||
Tabel 1: Beskrivelse af celle linjer og medierne sammensætning for celle kultur vedligeholdelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mundtlige microbiome er et centralt element i den menneskelige sundhed som for nylig rapporteret af flere forfattere20,21. Tidligere resultater antyder, at indtagelse af spyt, som indeholder store masser af bakterier kan påvirke det mikrobielle økosystem af tyndtarmen, som er en af de vigtigste steder for immun priming. Kombinationen af en statisk øvre gastrointestinal fordøjelsen model med værtsinterface repræsenteret af epitel og slim-secernerende tarmcellerne, tjente til at optrævle virkningen af den mikrobielle komponent på værten.
In vitro modeller er grundlæggende værktøjer til forskning, giver mulighed for gennemførelse af Mekanistiske undersøgelser og opnå baggrundsviden til formål at reducere, gøre mere effektiv og bedre mål i vivo undersøgelser. Derfor er det afgørende at sikre renhed, levedygtighed og optimal vækst af axenic kulturer inden fastsættelsen af syntetiske mikrobielle samfund. Vi anbefaler, vurderingen af levedygtighed og sammensætningen af bakterielle samfund før eksponering til cellekulturer, at undgå skævhed i analysen. Høje antal beskadigede bakterier kan hæmme vedhæftningen og yderligere påvirke integriteten af celle model. Desuden vil brug af en trustable kilde til cellelinjer minimere celle linje fejlidentifikation, forurening og dårlig anmærkning, forbedre eksperimentelle reproducerbarhed22.
Herunder Slim-producerende celler giver lighed til tyndtarmen, som slim og Muciner give den første forsvarslinje i mave-tarmkanalen23. Derudover er det slimhinde lag egnet til bakteriel kolonisering, giver mulighed for at karakterisere bilateral transport af bakteriel metabolitter. Desuden øger simuleret gastrointestinale betingelser vedhæftning af Lactobacillus paracasei stammer Caco-2 og mucin24, støtte relevansen af inkorporerer fordøjelsessystem processer i vores model.
Yderligere forbedringer i modellen kan indføres for at indarbejde immun vært komponenten, som tidligere gennemgået25. Dog har aktuelle Co kultur systemer af epitel og immun celler ikke været anvendt i host-mikrobe interaktion programmer (f.eks. evaluering af mad bioaktive stoffer eller probiotika), som viser, at disse systemer kan mangle reproducerbarhed25.
Tidligere forskning med Caco-2, HT29-MTX eller co kulturer vurderet vedhæftning af probiotiske eller patogene stammer til pattedyrceller26,27. Ved hjælp af enkelt pletter eller sammenslutninger af par mikroorganismer kan fastsætte en begrænset oversigt på host-mikrobe interaktioner, og det er ikke repræsentativ for kompleksiteten af den menneskelige mave-tarmkanalen. Selv om brugen af naturlige mikrobielle samfund kan være mere repræsentativ for i vivo scenariet, er de svært at karakterisere og studere. Derimod giver vores metode mulighed for at vurdere flere vært-mikrobe interaktioner, ved hjælp af en kompleks og repræsentative mikrokosmos. Brug af en defineret syntetiske mikrobielle samfund giver mulighed for generation af et system med reduceret kompleksitet28. Ændringer i Fællesskabet kan være et resultat af de microenvironmental betingelser i forbindelse med individuelle eksperimenter. Således, den mikrobielle element i denne model kan let skaleres op eller ned for dekonstruktion virkningen af miljøet som en selektiv kraft. Endelig, prøveudtagning tilgængelighed sikrer yderligere karakterisering af både menneskelige celler og den tilknyttede mikrobielle samfund funktionelle aktiviteter.
I de seneste år, er blevet udviklet nye in vitro- modeller baseret på organoid teknologi. Organoids er 3D cellekulturer, der indeholder nogle af de vigtigste funktioner af de repræsenterede primære væv. Selvom tarm organoids er en nær-fysiologiske system til forskning i voksne stamceller og væv, har denne model også nogle begrænsninger. Tarm organoids har begrænset anvendelse i ligner inflammatoriske respons til infektion eller medicin, da de mangler immunceller. Derudover er organoids heterogen med hensyn til rentabilitet, størrelse og form, vanskeliggør fænotype screening og rendering standardisering komplekse. Trods begrænsningen af udødeliggjort cellelinjer til in vitro- modellering af sunde væv, giver brugen af godt karakteriseret og stabil cellelinjer også fordele som repeterbarhed, reproducerbarhed og lave omkostninger. Disse fordele mulighed for samtidige screening af flere andre betingelser, men translationel brugen af dataene, der er kontroversielle. Primære celler kan være mere repræsentativ for i vivo fysiologi; men de har høj mellem individuelle variation, er ikke fuldt karakteriseret, er heterogen og har en begrænset tidsperiode. Disse faktorer er en ulempe for at medtage flere betingelser eller kopierer i en analyse.
Som kombinerer cellelinjer med komplekse mikrobielle samfund kan repræsentere en udfordring, fokuseret vi på at udvikle en reproducerbar og repeterbare model med høj fleksibilitet og anvendelighed i laboratorier med grundlæggende celle udstyr, indtil mere repræsentativ modeller blev tilgængelige og godt præget. Vi har vurderet funktionaliteten af forskelligartede bakterielle samfund ved hjælp af disse multicompartment modeller, for eksempel for evaluering af probiotiske adfærd i øvre mave-tarmkanalen og karakterisere xenobiotiske indvirkning på grænsefladen gut. Derfor foreslår vi denne model som en base for yderligere assays med en bred vifte af probiotika, medicin eller fødevarer forbindelser, inden for en relevant og defineret i vitro økosystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
Forfatterne parlamentsarbejdet finansiel støtte fra Flandern Research Foundation til Marta Calatayud Arroyo (CVE postdoc stipendium-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria er postdoc stipendiat understøttes af Flandern Innovation og Entrepreneurship (Agentschap voor Innovatie dør Wetenschap da Technologie, IWT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | - | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | - | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533 (2016).
- Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
- Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
- Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
- Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
- Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133 (2014).
- Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
- Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235 (2017).
- Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
- Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340 (2018).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
- Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
- Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
- Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
- Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
- Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
- Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307 (2015).
- Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
- Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
- Kleiveland, C. R., et al. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Springer International Publishing. 197-205 (2015).
- Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
- Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
- Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).
