Summary
Interazioni ospite-microbo intestino sono stati valutati utilizzando un approccio innovativo che unisce una comunità orale sintetica, la digestione gastrointestinale in vitro e un modello dell'epitelio dell'intestino tenue. Presentiamo un metodo che può essere adattato per valutare l'invasione delle cellule degli agenti patogeni e multispecie biofilm, o anche per testare la capacità di sopravvivenza dei probiotici formulazioni.
Abstract
L'interazione tra host e microbiota è stato a lungo riconosciuto e ampiamente descritto. La bocca è simile ad altre sezioni del tratto gastrointestinale, come microbiota residente si verifica e impedisce la colonizzazione di batteri esogeni. Infatti, più di 600 specie di batteri si trovano nella cavità orale, e un singolo individuo può trasportare circa 100 diversi in qualsiasi momento. I batteri orali possiedono la capacità di aderire alle varie nicchie nell'ecosistema orale, così diventando integrato all'interno della comunità microbica residente e favorire crescita e sopravvivenza. Tuttavia, il flusso di batteri nell'intestino durante la deglutizione è stato proposto a perturbare l'equilibrio del microbiota. Infatti, la somministrazione orale di p. gingivalis spostato composizione batterica nella microflora ileale. Abbiamo usato una comunità sintetica come una rappresentazione semplificata dell'ecosistema naturale orale, per delucidare la sopravvivenza e la vitalità dei batteri orali sottoposti a condizioni di transito gastrointestinale simulata. Quattordici specie sono stati selezionati, sottoposti in vitro salivare, gastrica e processi di digestione intestinale e presentati a un modello di vari compartimenti cellulari contenenti cellule Caco-2 e HT29-MTX per simulare l'epitelio della mucosa intestinale. Questo modello ha servito a svelare l'impatto di ingestione batteri su cellule coinvolte nella circolazione enteroepatica. Uso delle Comunità di sintetiche permette di controllabilità e riproducibilità. Così, questa metodologia può essere adattata per valutare la vitalità del patogeno e successive modifiche associate all'infiammazione, capacità di colonizzazione delle miscele di probiotici, e in ultima analisi, batterico potenziale impatto sulla circolazione presistemica.
Introduction
Gli esseri umani convivono con i batteri, che sono presenti presso lo stesso numero di cellule umane1. Quindi, è di fondamentale importante ottenere una comprensione globale del microbioma umano. La cavità orale è un ambiente unico, in quanto è diviso in parecchi più piccoli habitat, contenendo così una grande varietà di batteri e biofilm in quei luoghi diversi. Essendo un ecosistema aperto, alcune specie in bocca può essere transitori visitatori. Tuttavia, alcuni microrganismi colonizzano presto dopo la nascita e forma organizzata biofilm2. Questi si trovano sulla superficie dei denti sopra il crepaccio gengiva, subgingival interstiziale, linguetta, superfici mucose e protesi dentali e materiali da otturazione3. I batteri possono essere presenti anche come flocculi e cellule planctoniche nel lume del canale del dente, intervallate da tessuto della polpa necrotica o sospeso in una fase fluida.
C'è attivo, continuo cross-talk tra cellule dell'ospite e il microbiota residente4. Batteri comunicano all'interno e tra le specie, e solo una piccola percentuale dei colonizzatori naturale possa aderire ai tessuti, mentre altri batteri allegare Questi colonizzatori primari. Per esempio, l'associazione di cella tra microrganismi è essenziale per integrare colonizzatori secondari nel biofilm orali e costruzione di reti complesse di interazione cellule microbiche4. Circa il 70% degli aggregati batterici in un campione di saliva sono formate da Porphyromonas SP., Streptococcus SP., Prevotella SP., Veillonella SP. e non identificato Bacteroidetes. F. nucleatum è un colonizzatore intermedio nel biofilm subgengivale e aggregati con i colonizzatori tardi gingivalis del p., T. denticola e Tannerella forsythia, che sono implicati in periodontitis5. In più, Streptococcus mitis occupa habitat sia mucoso e dentale, mentre S. sanguinis e S. gordonii preferiscono colonizzare denti3. Così, S. sanguinis è presente in incisivi inferiori e canini, mentre Actinomyces naeslundii è stato trovato in anteriori superiore6.
Inoltre, il microbioma indigeno svolge un ruolo nel mantenimento della salute umana2. Microbiota residente partecipa alla formazione immune e nell'impedire l'espansione di agente patogeno. Questa resistenza di colonizzazione si verifica perché i batteri nativi possono essere meglio adattati al fissaggio su superfici e più efficienti a metabolizza le sostanze nutritive disponibili per la crescita. Sebbene ceppi probiotici sopravvivono al passare gastrointestinale e rimangono attive, la persistenza di batteri autoctoni inghiottito da una posizione superiore del tratto gastrointestinale non è stato completamente descritto. Così, abbiamo sottoposto una comunità artificiale, rappresentante dell'ecosistema orale, alle condizioni di transito gastrointestinale simulata. Attuabilità delle cellule batteriche è stata valutata utilizzando un modello multicomparto che assomiglia l'epitelio intestinale. Simulatori di intestino attuale offrono riproducibilità adatto in termini di analisi della comunità microbica luminal7. Tuttavia, adesione batterica e l'interazione ospite-microbo separatamente sono indirizzate, come combinazione di linee cellulari con comunità microbiche è impegnativo8. Al contrario, vi presentiamo un quadro che fornisce spiegazione meccanicistica potenziale di colonizzazione successo eventi segnalati sull'interfaccia dell'intestino. Infatti, questo modello può essere congiuntamente utilizzato con un modello statico dell'intestino per valutare l'impatto delle comunità microbiche su host superficie segnalazione.
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Protocol
1. ceppi e condizioni della coltura
Nota: La comunità orale sintetica è stata composta da ceppi comunemente presenti in microbioma orale3.
- Ottenere i seguenti ceppi da americano tipo Culture Collection (ATCC): Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Lo streptococco gordonii (ATCC 49818), Actinomyces viscosus (ATCC 15987) e Streptococcus mitis (ATCC 49456).
- Veillonella parvula dal Leibniz Institute DSMZ-tedesco collezione di microrganismi e colture cellulari (DSM 2007), Streptococcus sanguinis dall'insieme di batteri BCCM/LMG (LMG 14657) di acquisire e utilizzare Streptococco salivarius ceppo TOVE-R9e Streptococcus oralis10.
2. sviluppo di un rappresentante della Comunità multispecifica del microbioma orale
Nota: Generare una comunità sintetica per simulare la potenziale capacità di adesione dei batteri orali per l'epitelio intestinale in vitro . Crescere batteri su piastre di agar sangue completati con 5 Emina μg/mL, 1 µ g/mL menadione e defibrinato sterile 5% sangue di cavallo, come descritto in Hernandez-Sanabria et al. (2017) 11. In breve:
- Sciogliere 100 mg di Emina in 2 mL di NaOH M 1, aggiungere 100 mL di acqua distillata in autoclave. Conservare in un contenitore scuro. Sterilizzare attraverso un filtro da 0,22 µm prima di aggiungere al mezzo.
- Sciogliere 100 mg del menadione in 20 mL di etanolo al 96%. Sterilizzare attraverso un filtro da 0,22 µm prima di aggiungere al mezzo.
- Preparare 1 L di terreno agar sangue (Vedi Tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore e autoclave. Lasciate raffreddare prima di aggiungere il sangue di cavallo e i supplementi. Mescolare e versare le piastre.
- Preparare brodo modificate cervello cuore infusione (BHI) come precedentemente segnalati12. Aggiungere 5 μg/mL di Emina e 1 μg/mL del menadione dopo sterilizzazione in autoclave.
- Dispensare 9 mL di terreno in provette Hungate e chiudere con un tappo di gomma e ghiera di alluminio. Svuotare i tubi con N2Co2 (90% / 10%).
- Recuperare 1 mL di terreno anaerobico con una siringa e metterlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Scegliere singole colonie di ogni specie batteriche, risospendere in mezzo e trasferire nuovamente dentro il BHI modificate anaerobica. Incubare per 48 h a 37 ° C, ad eccezione di S. salivarius, che devono essere incubate per 24 h.
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Se necessario, confermare la purezza delle culture prima del montaggio della Comunità sintetica. In breve:
- Estrarre il DNA dalle colture del liquide come Hernandez-Sanabria et al. (2010) 13 e amplificare il gene del rRNA 16S, utilizzando i primers 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) e 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT) e il seguente programma: 5 minuti a 95 ° C, 30 cicli di 95 ° C per 1 min, 55 ° C per 1 min e 72 ° C per 1,5 minuti, seguita da una fase di estensione finale di 5 min a 72 ° C.
- Purificare il prodotto di PCR con uno spot pubblicitario kit (Vedi Tabella materiali), seguendo le istruzioni del produttore.
- Eseguire la reazione di sequenziamento dei prodotti purificati in un volume totale di 10 μL contenente 0,5 μL di colorante (Vedi Tabella materiali), 3,2 pmol di primer M13f (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC), 2.0 μL di sequenziamento buffer 5x e 20 ng di modello, utilizzando un sistema commerciale sequenziamento con kit (Vedi Tabella materiali).
Nota: Abbiamo avuto questa procedura eseguita in commercio. - Eseguire una ricerca BLAST su tutte le sequenze (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) per determinare il taxon più noto e confrontare con la sequenza del ceppo originario utilizzando lo strumento online di RDP classificatore (http://rdp.cme.msu.edu/) e il SINA Servizio di allineamento (https://www.arb-silva.de/aligner/).
- Misurare il numero di cellulare alla fine dell'incubazione, tramite flusso cytometry e macchia SYBR Green/propidio ioduro, come descritto nella Hernandez-Sanabria et al. (2017) 11. Diluire le culture a 105 cellule mL-1, utilizzando modificato BHI.
- Aggiungere 1 mL di S. mitis in 75 mL di BHI anaerobica e incubare fino alla fase stazionaria (6h). In seguito, raccogliere 0,75 mL di ogni ceppo diluito e mescolare in condizioni anaerobiche.
- Una volta che tutte le culture sono state mescolate, prendere 1 mL del microcosmo e aggiungere i 75 mL di BHI. Incubare la comunità sintetica sotto il 10% di CO2, 10% H2, 80% N2 per 48 h a 37 ° C e 200 giri/min (Vedi Tabella materiali).
- Misurare la densità delle cellule come in 2.8. prima di presentare la Comunità per il modello di cellulare. Composizione della Comunità può essere valutato con quantitativa Real-Time PCR, utilizzando i primers e ricottura temperature nella tabella 1 di Slomka et al. (2017) 10. Inoltre, utilizzare amplicon di gene del rRNA 16S per fornire informazioni sui membri iniziali presenti13,14. Per entrambi i protocolli conferma di identità, utilizzare cDNA come modello per indicare i batteri attivamente trascrizione proteine e utilizzare il DNA come un modello per rivelare la presenza/assenza dei ceppi.
3. pratiche di coltura cellulare generale
Nota: Per gli aspetti generali della coltura delle cellule, gli autori si riferiscono al Maestro e Stacey (2007)15. Ottenere linee cellulari usate da collezione di autenticato Cell Culture europee (Caco-2 ECACC 86010202 e HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, sanità pubblica in Inghilterra, UK). Reagenti per colture cellulari possono essere acquistati (Vedi Tabella materiali), se non diversamente specificato.
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La manutenzione e il passaggio delle linee di cellule Caco-2 e HT29-MTX
Nota: Le cellule Caco-2 e HT29-MTX ordinariamente sono coltivate in recipienti di coltura del tessuto2 25 cm contenenti la completati DMEM medio (tabella 1). Le cellule vengono tripsinizzate quando viene raggiunta la confluenza di 60 – 70%.- Rimuovere il mezzo di coltura cellulare dai palloni. Lavare due volte con 5 mL di PBS senza /Mg Ca ++++.
- Aggiungere 2 mL di una soluzione di 0,5 mg/L di tripsina e acido etilendiamminotetraacetico 0,22 g/L (EDTA). Distribuire la soluzione di tripsina muovendo delicatamente il pallone. Rimuovere 1,5 mL di soluzione di tripsina e incubare la beuta a 37 ° C per 10 min.
- Controllare al microscopio se le cellule si staccano dalla superficie del pallone. Incubare per ulteriori 5 minuti, se necessario.
- Aggiungere 5 mL di terreni di coltura cellulare completati al pallone per inattivare la tripsina. Dispensare su e giù per ottenere una sospensione omogenea singola cella.
- Immediatamente, prendere un 50 µ l aliquota della sospensione cellulare e mescolare con soluzione sterile di Trypan blu 0,4% in una proporzione di 1:1 (v/v) per le cellule Caco-2 o 1:5 v/v per HT29-MTX. Mix di pipettaggio e carico in una camera di conteggio (Vedi Tabella materiali).
- Contare le cellule vitali (cellule bianche brillanti) sotto il microscopio (Vedi istruzioni del produttore).
- Seme in un fiasco di nuovo ad una densità di 4 x 105 cellule/cm2 e 1 x 104 cellule/cm2, per Caco-2 e HT29-MTX, rispettivamente.
Nota: (1) Caco-2 cellule differenziano e formano giunzioni strette, una volta raggiunta la confluenza. È estremamente importante evitare over-confluency prima trypsinization. Crescita eccessiva delle cellule nella beuta possa causare errori in distacco cellulare dopo ciuffi trypsinization e/o cellulare. (2) le cellule HT29-MTX sono diproduzione cellule con alta attività metabolica16. Queste caratteristiche possono causare un veloce acidificazione dei terreni di coltura delle cellule, soprattutto se le cellule sono ad alta densità. Tampone HEPES possa essere aggiunti al terreno di coltura delle cellule (tabella 1) per mantenere il pH tra 7 e 7.2. Se il pH scende, il mezzo può essere scambiati quando confluenza è inferiore al 50%. Tuttavia, se confluenza > 50%, la coltura delle cellule deve essere suddivisa.
4. montaggio di un modello di vari compartimenti cellulari che simula l'interfaccia di ospite-microbo Gut
Nota: Completare la co-cultura in doppia pozzetti di alloggiamento (diametro 24mm, poro taglia 0,4 μm; Vedi Tabella materiali).
- Aggiungere 1,5 mL di terreni di coltura cellulare completo al compartimento apicale e 2 mL al basale. Pre-Incubare per 20 – 30 minuti per ottenere una distribuzione uniforme della sospensione delle cellule quando semina.
- Tripsinizzano la cultura delle cellule Caco-2 e HT29-MTX come descritto nella sezione 3. La procedura di trypsinization dovrà essere seguita con precisione per ottenere una distribuzione omogenea di entrambe le linee cellulari, in una sospensione singola cella, senza grumi.
- Contare le cellule vitali come descritto in 3.1.8.
- Regolare la densità delle cellule a 6.5 x 104 cellule/cm2 in una proporzione di 90/10 delle cellule Caco-2/HT29-MTX.
- Omogeneizzare le sospensioni cellulari e aggiungere il corrispondente volume di cellule Caco-2 e HT29-MTX in un contenitore sterile preriempito con terreni di coltura cellulare completati. Rimuovere il supporto pre-incubato dal lato apicale della camera di aspirazione.
- Delicatamente miscelare la sospensione delle cellule pipettando e trasferire 1,5 mL al compartimento apicale degli inserti da camera. La procedura di semina richiede una costante omogeneizzazione della sospensione delle cellule, come le cellule tendono a sedimenti. A seconda dell'esperienza dell'utente e della velocità di lavoro, la sospensione cellulare deve essere mescolato dopo 1 – 3 pozzi di erogazione.
- Spostare piastre delicatamente avanti e indietro e poi a destra a sinistra a destra (5 – 10 volte) per ottenere un uniforme diffusione delle cellule nel pozzo. Trasferimento in incubatrice e ripetere il movimento delle placche.
- Mantenere la co-coltura delle cellule Caco-2/HT29-MTX per 15 giorni, rinfrescante compartimenti apicale e basale ogni 2 giorni con DMEM completati. Dopo questo tempo, i terreni di coltura delle cellule sono modificabili a DMEM completati senza soluzione di antibiotico/antimicotico.
- Mantenere il sistema fino a 20 – 21 giorni post-semina aggiornando il mezzo ogni 2 giorni.
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Misurare l'integrità della barriera epiteliale prima di iniziare l'analisi, utilizzando un sistema elettrico di resistenza (Vedi tabella materiali), seguendo le istruzioni del produttore.
- Garantire che le attrezzature TEER sono completamente carica (> 24 ore) prima di iniziare le misurazioni.
- Scollegare l'apparecchiatura TEER dall'alimentazione elettrica e coprire con un sacchetto di plastica autoclave. Fare un buco nel sacchetto per introdurre l'elettrodo e collegare la porta di ingresso sul misuratore. Spruzzare con 70% di etanolo/acqua (v/v) prima di introdurre l'apparecchiatura TEER nel mobile del flusso.
- Per disinfettare l'elettrodo, immergere le punte dell'elettrodo nella soluzione di etanolo/acqua (v/v) di 70% per 15 min. Consenti all'aria secca per 15 s. Risciacquare l'elettrodo in terreni di coltura delle cellule pre-riscaldato.
- Prendere le cellule fuori l'incubatrice e permettono alle cellule di venire a temperatura all'interno del flusso mobile.
- Assicurarsi che il metro sia scollegato dal caricabatterie. Impostare il selettore di modalità su ohm e accendere l'alimentazione.
- Misurare la resistenza di cella immergendo l'elettrodo con la punta più corta nell'inserto e la punta più a lungo fuori del pozzo. Tenere l'elettrodo ad angolo 90° per l'inserimento della piastra.
5. batterica sopravvivenza seguenti In Vitro condizioni transito gastrointestinale
Nota: Preparare digestione simulata fluidi seguendo il protocollo di Minekus et al. (2014) 17, con le modifiche descritte di seguito. Preparare tutte le diluizioni con acqua ultrapura. Filtro-sterilizzare tutte le soluzioni attraverso un filtro di 0,22 µm ed eseguire la procedura di digestione in condizioni sterili.
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Digestione orale:
- Posizionare 3 mL della comunità batterica in una provetta sterile da 50 mL, mescolare con 3 mL di fluido di saliva simulata (SSF), contenente (in mmol L-1): KCl, 15,1; KH2PO4, 3,7; NaHCO3, 6,8; MgCl2(H2O)6, 0.5, (NH4) CO3, 0,06; HCl, 1.1; CaCl2(H2O)2, 0.75. Aggiungere 75 U/mL di α-amilasi da saliva umana tipo IX-A e 2 g/L mucina da tipo II di stomaco suino per la SSF.
- Incubare la miscela per 2 min a 37 ° C e 100 giri/min. Raccogliere un campione di 2 mL per estrazione del DNA e quantificazione di citometria a flusso (S1).
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Digestione gastrica:
- Aggiungere 4 mL di liquido gastrico simulato (SGF), contenente (in mmol L-1): KCl, 6,9; KH2PO4, 0,9; NaHCO3, 25; NaCl, 47.2; MgCl2(H2O)6, 0,1, (NH4) CO3, 0,5; HCl, 15,6; CaCl2(H2O)2, 0,075. Inoltre, la SGF contenute 2 g/L di mucina da tipo II di stomaco suino.
- Misurare il pH e regolare il pH 3 con 1M HCl, se necessario. Incubare a 37 ° C e 100 giri/min. Raccogliere un campione di 2 mL (S2).
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Piccolo intestino digestione:
- Aggiungere 4 mL di liquido intestinale simulato (SIF) che contiene (in mmol L-1): KCl, 6,8; KH2PO4, 0,8; NaHCO3, 85; NaCl, 38,4; MgCl2(H2O)6, 0,33; HCl, 8.4; CaCl2(H2O)2, 0.3; per il tubo di digestione.
- Se necessario, regolare a pH 7 con 1 M NaOH. Incubare a 37 ° C e 100 giri/min. Raccogliere un campione di 2 mL (S3).
6. capacità di colonizzazione batterica seguenti In Vitro condizioni transito gastrointestinale
- Centrifugare 2 mL della digestione nell'intestino tenue, per 10 min a 2.650 x g.
- Rimuovere il supernatante e mescolare il pellet batterico con 5 mL di DMEM completati senza antibiotici e antimicotici.
- Macchia e quantificare le cellule intatte/danneggiato utilizzando un citometro a flusso (Vedi Tabella materiali), come descritto da Hernandez-Sanabria et al. (2017) 11.
- Regolare la densità delle cellule a 105 vitali cellule/mL diluendo in DMEM completati senza antibiotici e antimicotici.
- Rimuovere il supporto apicale del sistema transwell e aggiungere 1,5 mL di sospensione batterica. Co-coltura del sistema per 2 h in condizioni di coltura cellulare generale (37 ° C, umidità 95%, 5% CO2).
Nota: Questo tempo può essere esteso fino a 48 ore, a seconda del protocollo sperimentale necessaria. La co-coltura possa essere mantenuta in un incubatore diverso da quello utilizzato per la manutenzione ordinaria delle cellule, per evitare contaminazioni. - Misurare i valori TEER dopo l'incubazione, per valutare l'integrità della barriera epiteliale, come descritto in 4.11.
- Al termine dell'incubazione, rimuovere supporti apicali e raccogliere 0,5 mL per ulteriori analisi (S4). Un sottocampione di media può essere utilizzato per la valutazione di attuabilità delle cellule dall'analisi di lattato deidrogenasi (LDH) (Vedi Tabella materiali), seguendo le istruzioni del produttore.
- Aggiungere 0,5 mL di 10 millimetri di N-acetilcisteina in HBSS (NAC-buffer) per solubilizzare il muco prodotto da HT29-MTX e recuperare batteri aderiti. Incubare le piastre a 37 ° C per 1 h, sotto agitazione (135 giri/min, Vedi Tabella materiali).
- Recuperare il NAC-HBSS in un tubo del microcentrifuge (S5) e lavare due volte le cellule con 1 mL DPBS.
- Aggiungere 0,5 mL di 0.5% Triton X-100 (w/v) in cima i monostrati, frantumare le cellule pipettando, recuperare il liquido e vortexare per 1 min velocità è fondamentale per evitare di danneggiare le cellule batteriche con il detersivo.
- Centrifugare le cellule per 5 min a 2.650 x ge separare il surnatante (S6) e il pellet (S7).
7. esempio analisi
Nota: Analizzare campioni raccolti (S1-S7) per valutare la vitalità batterica e adesione potenziali alle cellule intestinali, seguendo una digestione gastrointestinale simulata.
- Vitalità batterica: passare campioni S1-S5 due volte attraverso una 0,45 µm e quantificare le cellule batteriche usando la macchiatura delle cellule vive/morte e flusso cytometry, come indicato al punto 2.811.
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Potenziale di adesione: preparare diluizioni seriali (-1 -8) per S1-S6 e streak 10 µ l in agar sangue e modificati piastre BHI. Incubare a 37 ° C in condizioni anaerobiche per 24 – 48 h. piastra lo stesso volume di S7 non diluito.
- Identificazione tassonomica dei batteri aderiti:
- Scegli diverse colonie con un ciclo di cultura e risospendere ciascuno su 10 µ l di acqua priva di nucleasi. Raccogliere 4 µ l di questa sospensione e utilizzarlo come modello per l'amplificazione di PCR del gene del rRNA 16S utilizzando i primer e le condizioni descritte nella 2.7.1.
- Eseguire sequenziamento seguendo il protocollo in 2.7.3 e convalida della sequenza utilizzando la procedura inclusa in 2.7.4.
- Identificazione tassonomica dei batteri aderiti:
- Fare ulteriori analisi a valle come totale estrazione del DNA, qPCR quantificazione e/o 16S rRNA amplicone Ordina, estrazione del RNA e trascrittomica profiling come desiderato.
Nota: La quantificazione di citometria a flusso è stata eseguita immediatamente dopo il campionamento. Come controllo per celle a membrana-permeabilized, è stato utilizzato un campione esposto a 70 ° C per 3 min. Rumore di fondo è stata valutata misurando con citometria a flusso, i liquidi di digestione o campioni ottenuti dal modello della coltura cellulare senza batteri. Ogni campione è stata misurata in triplice copia.
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Representative Results
Questo protocollo conduce alla generazione di un modello adatto di delucidare la sopravvivenza e la vitalità dei batteri orali sottoposti a condizioni di transito gastrointestinale simulata. I conteggi delle cellule intatte da singoli ceppi è di circa 108 cellule mL-1 prima della creazione della Comunità sintetica, mentre il microcosmo multispecifica contenuto superiore al 90% di cellule vitali durante la creazione di comunità ( Figura 1A e 1B). Basata sulla quantificazione Live/Dead, vitalità batterica diminuisce dopo ogni fase di digestione (Figura 2). Questo può essere un risultato di pH acido durante il passaggio gastrico e dei sali biliari contenuti nei liquidi di digestione intestino tenue, come che si verificano in condizioni fisiologiche. Vitalità durante il transito attraverso la digestione gastrointestinale sia in vitro che in vivo può dipendere da variazioni nell'ambiente (ad es., alimentato vs digiunato condizioni), o anche sui processi di protezione di batteri (spora rivestimento enterico o formazione).
Conteggi di cytometric di flusso devono essere confrontati con opportuni controlli, come il calore-ucciso i batteri o i campioni di sfondo, per eseguire cellule vitali accurata quantificazione18. Le dure condizioni della digestione dello stomaco e dell'intestino tenue possono passare batteri alle cellule vitali ma non coltivabili, che sono batteri vivi che non crescere o dividere. Per questo motivo, conta su piastra differisce dai conteggi di cellule vitali ottenuti con la citometria a flusso. Per esempio, in Figura 3, cellule vitali recuperate dall'interfaccia della mucosa sono colorate in blu nella trama di citometria a flusso. Tuttavia, nessuna crescita è stata osservata quando questi campioni di muco erano placcati (risultati non mostrati).
La frazione in cui i batteri mostrano tassi più elevati di redditività è i detriti cellulari (S7), come rivelato dal piatto di conteggio (Figura 4). Il numero di colonie può essere variabile, ma la presenza di batteri metabolicamente attivi è trovato nei campioni meno diluiti.
Figura 1: Vitalità dei batteri che compongono la comunità microbica multispecifica all'inizio della digestione gastrointestinale in vitro di cellulare. (A) conta delle cellule vitali (unità del ceppo) quantificato mediante citometria a flusso e macchiatura live/morte (media ± deviazione standard, n = 3). (B) trama di citometria a flusso rappresentativo della comunità microbica multispecifica dopo 48 h di co-coltura. Puntini in verde, rosso e nero rappresentano valida, danneggiata e sfondo o batteri non classificati, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: vitalità dei batteri cellulare dopo la digestione gastrointestinale simulata. Barre rappresentano il numero di cellule vitali (unità del ceppo) dopo la procedura orale, gastrica e piccola digestione intestinale (media ± deviazione standard, n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: rappresentanza trama di cellule batteriche vitali nel interphase mucoso. Punti rossi rappresentano i punti di bianco e blu le cellule vitali. Condizioni di citometria a flusso sono state stabilite in base puntelli et al. (2016) 19. mucosa campioni sono stati diluiti 1: 100 (v/v) e macchiato con Sybr Green/propidio ioduro per 15 min e 100 µ l di campione è stata misurata a FL1: 533/30 nm, FL2: 585/40 nm, FL3: > 670 nm lungo pass e FL4: 675/25 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: unità formanti colonia (UFC cresciuta da detriti cellulari in) per volta piastre BHI. Tre replicati biologici sono stati utilizzati per il test di adesione batterica e tre replicati tecnici sono stati effettuati per la quantificazione di CFU. Due piastre replicare contenente -1 a-6 diluizioni dei detriti cellulari (S7) sono mostrati in figura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Coltura cellulare | Aderente / sospensione | Medium di coltura | Generali integratori | Integratori specifici | Tempo di raddoppiamento | Condizioni di incubazione |
| Caco-2 (ECACC 86010202) | Aderente | Per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco) con glucosio a 4,5 g/L | Siero bovino fetale inattivato (10% v/v) Penicillina (100 U/mL) * Streptomicina (0,1 mg/mL) * Amfotericina (0,0025 mg/mL) * |
Glutamax (4 mM) Aminoacidi non essenziali (1% v/v) Piruvato (1 mM) |
65 – 72 h | 95% umidità e 10% di CO2 Incubatore a CO2 (Vedi Tabella materiali) |
| HT29-MTX (ECACC 12040401) | Aderente | HEPES (1 mM) | 20 – 24 h | |||
| * Antibiotici e antimicotici sono stati rimossi dal terreno di coltura cellulare 2 giorni prima di iniziare l'analisi. | ||||||
Tabella 1: Descrizione della composizione cellulare linee e mezzi per mantenimento di coltura delle cellule.
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Discussion
Il microbioma orale è un elemento chiave nella salute umana, come recentemente riportato da diversi autori20,21. I risultati precedenti suggeriscono che l'ingestione di saliva che contiene grandi carichi di batteri può influenzare l'ecosistema microbico dell'intestino tenue, che è uno dei principali siti per l'adescamento immune. La combinazione di un modello statico di digestione gastrointestinale superiore con l'interfaccia host rappresentato dalle cellule epiteliali e che secernono muco intestinale, servita a svelare l'impatto della componente microbica nell'host.
Modelli in vitro sono strumenti base per la ricerca, consentendo lo svolgimento di studi meccanicistici e giungere alla conoscenza di fondo destinato a ridurre, rendere più efficiente e migliore destinazione in vivo gli studi. Per questo motivo, è fondamentale per garantire la purezza, la vitalità e la crescita ottima delle colture axeniche prima che istituisce la comunità microbica sintetica. Si consiglia di valutare la fattibilità e la composizione della comunità batterica prima dell'esposizione alle colture cellulari, per evitare distorsioni nell'analisi. Elevato numero di batteri danneggiati può ostacolare l'adesione e influire ulteriormente l'integrità del modello di cellulare. Inoltre, l'uso di una fonte affidabile di linee cellulari ridurrà errata identificazione di linea cellulare, contaminazione e povera annotazione, migliorare la riproducibilità sperimentale22.
Tra cui le cellule che producono muco consente rassomiglianza all'intestino tenue, come muco e mucine rappresentano la prima linea di difesa del tratto gastrointestinale23. Inoltre, lo strato mucoso è adatto per la colonizzazione batterica, permettendo per trasporto caratterizza bilaterale dei metaboliti batterici. Inoltre, condizioni gastrointestinali simulate aumentano la capacità di adesione di ceppi di Lactobacillus paracasei di Caco-2 e la mucina24, sostenendo l'importanza di integrare processi digestivi nel nostro modello.
Ulteriori miglioramenti nel modello possono essere introdotte per incorporare il componente host immune, come precedentemente esaminati25. Tuttavia, corrente sistemi di co-coltura delle cellule epiteliali e immuni non sono stati utilizzati per le applicazioni di interazione ospite-microbo (ad es., valutazione di composti bioattivi cibo o probiotici), che potrebbero indicare che tali sistemi possono non riproducibilità25.
La ricerca precedente con Caco-2, HT29-MTX o co-colture valutato l'adesione dei probiotici o ceppi patogeni di cellule di mammifero26,27. Utilizzando singole macchie o associazioni di alcuni microrganismi possono fornire una visione limitata sull'ospite-microbo interazioni, e non è rappresentativo della complessità del tratto gastrointestinale umano. Anche se l'uso delle comunità microbiche naturali può essere più rappresentativo dello scenario in vivo , sono difficili da caratterizzare e studiare. Al contrario, la nostra metodologia offre l'opportunità di valutare molteplici interazioni ospite-microbo, utilizzando un microcosmo complesso e rappresentativo. L'uso di una definita comunità microbica sintetica consente la generazione di un sistema con complessità ridotta28. Cambiamenti nella Comunità possono essere un risultato delle condizioni microambientali nel contesto dei singoli esperimenti. Così, la componente microbica di questo modello può essere facilmente scalata verso l'alto o verso il basso per decostruire l'impatto dell'ambiente come una forza selettiva. Infine, l'accessibilità di campionamento garantisce ulteriore caratterizzazione delle attività funzionali di cellule umane e di comunità microbica associata.
Negli ultimi anni, sono stati sviluppati nuovi modelli in vitro basati su tecnologia organoid. Organoids sono colture cellulari 3D che incorporano alcune delle caratteristiche chiave del tessuto primario rappresentato. Anche se organoids intestinale sono un sistema quasi-fisiologiche per lo studio delle cellule staminali adulte e tessuti, tale modello ha anche alcune limitazioni. Organoids intestinale hanno un uso limitato in simile a risposte infiammatorie all'infezione o droghe, mentre mancano le cellule immuni. Inoltre, organoids sono eterogenee per quanto riguarda la redditività, dimensione e forma, che impediscono lo screening del fenotipo e standardizzazione di rendering complessi. Nonostante la limitazione delle linee cellulari immortalizzate per in vitro modellazione dei tessuti sani, l'uso di linee cellulari stabili e ben caratterizzati offre anche vantaggi come ripetibilità, riproducibilità e basso costo. Questi vantaggi consentono selezione simultanea di diverse condizioni, ma l'uso traslazionale dei dati è discutibile. Cellule primarie può essere più rappresentativo di fisiologia in vivo ; Tuttavia, essi hanno un'elevata variabilità inter-individuale, non sono completamente caratterizzati, sono eterogenei e dispone di un limitato lasso di tempo. Questi fattori sono un inconveniente per l'inclusione di più condizioni o viene replicato in un saggio.
Come la combinazione di linee cellulari con comunità microbiche complesse può rappresentare una sfida, ci siamo concentrati sullo sviluppo di un modello riproducibile e ripetibile con elevata flessibilità e l'applicabilità nei laboratori con attrezzature di base delle cellule, fino al più rappresentativo modelli sono diventato disponibili e ben caratterizzati. Abbiamo valutato la funzionalità delle diverse comunità batteriche utilizzando questi modelli multicomparto, per esempio, per valutare il comportamento di probiotici nel tratto gastrointestinale superiore e per impatto caratterizza xenobiotici sull'interfaccia dell'intestino. Quindi, proponiamo questo modello come base per ulteriori analisi con un'ampia varietà di probiotici, farmaci o alimenti composti, all'interno di un ecosistema pertinenti e definite in vitro .
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Acknowledgments
Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno finanziario della Fondazione di ricerca Fiandre a Marta Calatayud Arroyo (FWO postdoctoral fellowship-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria è un postdoctoral fellow supportato da Flanders innovazione e imprenditorialità (Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie, IWT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | - | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | - | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
References
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