Summary
Gut vert-mikrobe interaksjoner ble vurdert ved hjelp av en ny tilnærming som kombinerer et syntetisk muntlig fellesskap, i vitro gastrointestinal fordøyelsen og en modell av tynntarmen epitel. Vi presenterer en metode som kan tilpasses for å vurdere celle invasjon av patogener og flere arter biofilm, eller til å teste probiotiske formuleringer survivability.
Abstract
Samspillet mellom vert og bakterieflora har lenge anerkjent og grundig beskrevet. Munnen ligner på andre deler av gastrointestinaltraktus, som bosatt bakterieflora skjer og hindrer kolonisering av eksogene bakterier. Faktisk mer enn 600 arter av bakterier finnes i munnhulen, og et enkelt individ kan bære rundt 100 forskjellige når som helst. Oral bakterier har muligheten til å følge de forskjellige nisjene i muntlig økosystemet, bli integrert i bosatt mikrobielle samfunn, og favoriserer vekst og overlevelse. Imidlertid har flyten av bakterier i tarmen under svelging blitt foreslått å forstyrre balansen av tarmen bakterieflora. Faktisk har skiftet peroral administrering av P. gingivalis bakteriell komposisjon i den chymet mikroflora. Vi brukte en syntetisk samfunnet som en forenklet visning av naturlige muntlig økosystemet, for å belyse overlevelse og gjennomførbarheten av oral bakterier utsatt for simulert gastrointestinal transitt forhold. Fjorten arter ble valgt, utsatt for i vitro salivary, mage og intestinal fordøyelsen prosessene og presentert i en multicompartment celle modell som inneholder Caco-2 og HT29-MTX celler for å simulere gut mucosal epitel. Denne modellen fungerte å rakne virkningen av svelget bakterier på celler involvert i enterohepatisk sirkulasjon. Bruker syntetiske communities tillater kontrollerbarhet og reproduserbarhet. Dermed denne metodikken kan tilpasses å vurdere patogen levedyktighet og påfølgende betennelse forbundet endringer, kolonisering kapasitet probiotiske blandinger, og til slutt, potensielle bakteriell innvirkning på presystemic sirkulasjonen.
Introduction
Mennesker cohabit med bakterier, som finnes på samme nummer som menneskelige celler1. Derfor er det av avgjørende viktig å få et konstitusjonelt forståelse av den menneskelige microbiome. Munnhulen er et unikt miljø ved at det er delt inn i flere mindre habitater, dermed inneholder en rekke bakterier og biofilm på de forskjellige stedene. Å være åpen økosystemet, kan noen arter i munnen være forbigående besøkende. Imidlertid kolonisere visse mikroorganismer kort tid etter fødselen og skjemaet organisert biofilm2. Disse finnes i tennene overflaten over gingival kløft, subgingival kløft, tunge, mucosal overflater og dental prosthetics og fyllinger3. Bakterier kan også finnes som flocs og planktoniske celler i lumen av tann kanalen, blandede med nekrotisk masse vev eller suspendert i flytende fase.
Det er aktiv, kontinuerlig kryss-snakk mellom verten cellene og bosatt bakterieflora4. Bakterier kommunisere innenfor og mellom arter, og bare en liten andel av naturlige kolonistene kan følge vev, mens andre bakterier knytte til disse primære kolonisatorer. For eksempel er celle-celle binding mellom mikroorganismer nøkkelen for å integrere sekundære kolonisatorer i muntlig biofilm, og bygge komplekse nettverk av samspill mikrobiell celler4. Rundt er 70% av bakteriell aggregat i en spytt prøve dannet av Porphyromonas sp., Streptococcus sp., Prevotella sp., Veillonella sp. og uidentifisert Bacteroidetes. F. nucleatum er en mellomliggende colonizer i subgingival biofilm og aggregat med sen kolonisatorer P. gingivalis, T. denticola, og Tannerella forsythia, som er innblandet i periodontitt5. I tillegg har Streptococcus mitis både slimhinnene og dental habitater, mens S. sanguinis og S. gordonii foretrekker å kolonisere tenner3. Dermed finnes, S. sanguinis i nedre fortenner og hjørnetenner, mens Actinomyces naeslundii har blitt funnet i øvre anteriors6.
I tillegg spiller til urfolk microbiome en rolle i å opprettholde helse2. Bosatt bakterieflora deltar i immun utdanning og hindre patogene ekspansjon. Denne kolonisering motstanden skyldes innfødte bakterier kan være bedre tilpasset på feste til overflater, og effektiv metabolising tilgjengelig næringsstoffer for vekst. Selv om probiotiske overleve gastrointestinal passering og aktiv, har for autochtonous bakterier svelget en øvre beliggenhet i mage-tarmkanalen ikke blitt fullstendig beskrevet. Derfor utsatt vi et kunstig samfunn, representant i muntlig økosystemet simulert gastrointestinal transitt forhold. Levedyktigheten til bakterielle celler ble vurdert ved hjelp av en multicompartment modell ligner gut epitel. Gjeldende gut simulatorer tilbyr passende reproduserbarhet i analyse av luminal mikrobielle samfunn7. Imidlertid bakteriell vedheft og vert-mikrobe samhandling er separat adressert, som kombinerer linjer med mikrobielle samfunn er utfordrende8. I kontrast, presenterer vi et rammeverk som gir potensielle mekanistisk forklaring av vellykket kolonisering hendelser rapportert om gut grensesnittet. Faktisk kan denne modellen i fellesskap brukes med en statisk gut modell for å evaluere virkningen av mikrobielle samfunn på verten overflaten signalisere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. stammer og kultur forhold
Merk: Syntetisk muntlig samfunnet ble komponert av stammer ofte tilstede i muntlig microbiome3.
- Få de følgende stammene fra amerikanske Type kultur samling (ATCC): Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Streptococcus gordonii (ATCC 49818), Actinomyces viscosus (ATCC 15987) og Streptococcus mitis (ATCC 49456).
- Tilegne seg Veillonella parvula fra Leibniz Institute DSMZ-tysk samling mikroorganismer og cellekulturer (DSM 2007), Streptococcus sanguinis fra samlingen BCCM/LMG bakterier (LMG 14657) og bruker Streptokokker salivarius belastning TOVE-R9og Streptococcus oralis10.
2. utvikling av en Multispecies fellesskap representant for den muntlige Microbiome
Merk: Generere en syntetisk samfunnet for å simulere potensielle vedheft kapasiteten til oral bakterier i vitro gut epitel. Vokse bakterier på blod agar plater supplert med 5 μg/mL hemin, 1 μg/mL menadione og 5% sterilt defibrinated hest blod, som beskrevet i Hernandez-Sanabria et al. (2017) 11. I korte trekk:
- Oppløse 100 mg av hemin i 2 mL 1 M NaOH, legge til 100 mL destillert autoklaveres vann. Lagre i en mørk beholder. Sterilisere gjennom filtere 0.22 µm før du legger til middels.
- Oppløse 100 mg av menadione i 20 mL av 96% etanol. Sterilisere gjennom filtere 0.22 µm før du legger til middels.
- Forberede 1 L blod agar medium (se Tabell for materiale) i henhold til produsentens instruksjoner og autoclave. La kjøle seg ned før du legger til hest blodet og kosttilskudd. Bland og hell platene.
- Forberede endret hjernen hjertet infusjon (BHI) buljong som tidligere rapportert12. Legge til 5 μg/mL av hemin og 1 μg/mL av menadione etter autoklavering.
- Dispensere 9 mL av mediet i hvor Hungate rør, og tett med en gummipropp og en aluminium cap. Tømme rør med N2/CO2 (90% / 10%).
- Hente 1 mL av anaerob medium med en sprøyte og plasserer den i en 1,5 mL microcentrifuge tube. Velg enkelt kolonier av hver bakterie-art, resuspend i medium, og overføre tilbake til det anaerob endret BHI. Inkuber 48 h ved 37 ° C, bortsett fra S. salivarius, som må være ruges i 24 timer.
-
Hvis nødvendig, bekrefte renhet av kulturer før montering syntetiske samfunnet. I korte trekk:
- Ekstra DNA fra flytende kulturer som Hernandez-Sanabria et al. (2010) 13 og forsterke 16S rRNA genet bruker primerne 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) og 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT), og følgende program: 5 minutter ved 95 ° C, 30 sykluser av 95 ° C for 1 minutt, 55 ° C for 1 min, og 72 ° C i 1,5 min, etterfulgt av en endelig utvidelse trinn 5 min på 72 ° C.
- Rense PCR produktet med en kommersiell kit (se Tabell for materiale), følg produsentens instruksjoner.
- Utføre sekvensering reaksjonen av renset produkter i en 10 μL totale volumet som inneholder 0,5 μL fargestoff (se Tabell for materiale), 3,2 pmol med M13f primer (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC), 2.0 μL 5 x sekvensering buffer og 20 ng av malen, bruker en kommersielle sekvensering system med kit (se Tabell for materiale).
Merk: Vi hadde denne prosedyren utføres kommersielt. - Utføre BLAST søk på alle sekvenser (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) for å finne den nærmeste kjent gruppe (biologi) og sammenligne med en rekke originale belastning bruker RDP klassifiserer online verktøyet (http://rdp.cme.msu.edu/) og SINA Justering-tjenesten (https://www.arb-silva.de/aligner/).
- Måle celle nummeret på slutten av inkubering, flowcytometri og SYBR Green/Propidium Iodide flekker som beskrevet i Hernandez-Sanabria et al. (2017) 11. fortynne kulturer til 105 celler mL-1, bruker endret BHI.
- Legg 1 mL av S. mitis i 75 mL av anaerob BHI og ruge til stasjonære fase (6 h). Etter, samle 0,75 mL av hver utvannet belastning og blanding under anaerob forhold.
- Når alle kulturer har vært blandet, ta 1 mL av mikrokosmos, og legge til 75 mL av BHI. Inkuber syntetiske samfunnet under 10% CO2, 10% H2, 80% N2 for 48 timer på 37 ° C og 200 rpm (se Tabell for materiale).
- Måle celle tetthet som 2.8. før presentere samfunnet til celle modell. Sammensetningen av samfunnet kan vurderes med kvantitative Real-Time PCR, bruker primerne og avspenning temperaturer i tabell 1 i Slomka et al. (2017) 10. I tillegg bruke 16S rRNA genet amplicon sekvensering for å gi informasjon om den opprinnelige medlemmer finnes13,14. For hver identitet-bekrefter protokollen, brukes cDNA som mal for å angi bakterier aktivt transkribere proteiner, og bruke DNA som en mal for å avdekke tilstedeværelse/fravær av stammene.
3. generelle cellekultur praksis
Merk: For generelle aspektene med cellekulturer, forfatterne refererer til Master og Stacey (2007)15. Få linjer fra den europeiske samling av godkjent cellekulturer (Caco-2 ECACC 86010202 og HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, folkehelsen England, UK). Reagensene cellekultur kan kjøpes (se Tabell for materiale), med mindre annet er angitt.
-
Vedlikehold og passaging av Caco-2 og HT29-MTX linjer
Merk: Caco-2 og HT29-MTX celler er rutinemessig dyrket i 25 cm2 vev kultur flasker som inneholder supplert DMEM medium (tabell 1). Cellene er trypsinized når 60-70% samløpet er nådd.- Fjerne celle kultur medium fra flasker. Vask to ganger med 5 mL PBS uten Ca++/Mg++.
- Legg 2 mL i en 0,5 mg/L løsning av trypsin og 0.22 finans ethylene diamine tetraacetic syre (EDTA). Distribuere trypsin løsningen ved å forsiktig flytte kolbe. Fjern 1,5 mL av trypsin løsningen og ruge kolbe ved 37 ° C i 10 min.
- Sjekk under mikroskopet hvis cellene er løsrevet fra overflaten kolbe. Inkuber for ytterligere 5 min, hvis nødvendig.
- Legge til 5 mL supplert celle kultur medier kolbe å deaktivere trypsin. Pipetter opp og ned for å få en homogen enkeltcelle suspensjon.
- Umiddelbart, ta en 50 µL aliquot av cellen suspensjon og bland med sterile 0,4% Trypan blå løsning i en 1:1 (v/v) andel for Caco-2 celler eller 1:5 v/v for HT29-MTX. Blandingen av pipettering og laste inn en teller kammer (se Tabell for materiale).
- Telle levedyktig celler (hvitt lys celler) under mikroskopet (se produsentens instruksjoner).
- Frø i en ny bolle på en tetthet på 4 x 105 celler/cm2 og 1 x 104 celler/cm2, Caco-2 og HT29-MTX, henholdsvis.
Merk: (1) Caco-2 cellene skille og danne tett veikryss gang nådde confluency. Det er svært viktig å unngå over-confluency før trypsinization. Overvekst av celler i kolbe kan føre celle avdeling etter trypsinization og/eller cellen klumper. (2) HT29-MTX celler er Slim-produserende celler med høyt metabolsk aktivitet16. Disse funksjonene forårsake en rask forsuring av celle kultur media, særlig hvis cellene er på høy tetthet. HEPES buffer kan legges til celle kultur medium (tabell 1) å opprettholde pH mellom 7 og 7.2. Hvis pH faller, medium kan utveksles når confluency er mindre enn 50%. Men hvis confluency > 50%, i cellekultur må deles.
4. montering av en Multicompartment celle modell simulere Gut vert-mikrobe grensesnittet
Merk: Fullføre co kulturen i doble kammer brønner (diameter 24 mm, pore størrelse 0,4 μm, se Tabellen for materiale).
- Legg til 1,5 mL komplett celle kultur medier apikale rom og 2 mL til de basale. Pre ruge i 20-30 minutter å få jevn fordeling av cellen suspensjon når seeding.
- Trypsinize cellekultur Caco-2 og HT29-MTX som beskrevet i del 3. Trypsinization prosedyren må følges nøyaktig for å oppnå homogene distribusjon av begge linjer, i en enkelt celle suspensjon uten klumper.
- Telle levedyktig celler som beskrevet i 3.1.8.
- Justere celle tettheten til 6.5 x 104 celler/cm2 i en 90/10 andel av Caco-2/HT29-MTX celler.
- Homogenize av cellen suspensjon og legge det tilsvarende volumet av Caco-2 og HT29-MTX celler til en forhåndsutfylt sterile containeren med supplert celle kultur medier. Fjerne pre inkubert media fra den apikale siden av kammeret av aspirasjon.
- Forsiktig blande celle suspensjon av pipettering og overføre 1.5 mL apikale rommet kammer skivene. Seeding prosedyren krever en konstant homogenisering av cellen suspensjon, som cellene pleier å sediment. Avhengig av brukeren og arbeider hastighet, må cellen suspensjon blandes etter dispensing 1 – 3 brønner.
- Flytte plater forsiktig bakover og fremover, og deretter til høyre til venstre (5-10 ganger) å få en enda spredning av celler i brønnen. Overføre til inkubator Gjenta bevegelsen av platene.
- Opprettholde co kultur Caco-2/HT29-MTX celler for 15 dager, forfriskende apikale og basal rom hver 2 dager med supplert DMEM. Etter denne tid, kan celle kultur media endres til supplert DMEM uten antibiotika/antimycotic løsning.
- Opprettholde systemet til 20-21 dager etter såing av forfriskende mediet hver 2 dager.
-
Måle epithelial barriere integritet før analysen, bruker en elektrisk motstand-systemet (se tabellen for materiale), følger du instruksjonene fra produsenten.
- Sikre at TEER utstyr er fulladet (> 24 h) før du starter målinger.
- Koble TEER utstyret fra strømforsyningen og dekk med en plast autoklav bag. Lage et hull i posen til å innføre elektroden og koble til inngang porten på meter. Spray med 70% etanol/vann (v/v) før innføring av TEER utstyret til flyt kabinettet.
- For å desinfisere elektroden, fordype elektrode tipsene i 70% etanol/vann (v/v) løsning for 15 min. Tillat å lufttørke for 15 s. skylling elektroden i forvarmes celle kultur medier.
- Ta cellene ut av inkubatoren og tillate at celler kommer til romtemperatur i flyten kabinett.
- Kontroller at måleren er koblet fra laderen. Still Ohm og slå på strømbryteren On.
- Måle celle motstanden ved immersing elektroden med kortere spissen i sette inn og lengre spissen av brønnen. Holde elektroden i 90° vinkel til sette inn platen.
5. bakteriell overlevelse etter In Vitro Gastrointestinal transitt forhold
Merk: Forberede simulert fordøyelsen væsker følger protokollen av Minekus et al. (2014) 17, med modifikasjoner beskrevet nedenfor. Forberede alle fortynninger med ultrapure vann. Filter-sterilisere alle løsninger gjennom en 0.22 µm og fremgangsmåten fordøyelsen under sterile forhold.
-
Muntlig fordøyelse:
- Sett 3 mL den bakterielle samfunnet i en 50 mL steril tube, bland med 3 mL simulert spytt væske (SSF), som inneholder (i mmol L-1): KCl, 15,1; KH2PO4, 3.7; NaHCO3, 6.8; MgCl2(H2O)6, 0,5 (NH4) CO30,06; HCl, 1.1. CaCl2(H2O)2, 0,75. Legge til 75 U/mL α-amylase fra humant spytt IX-en og 2 finans mucin fra svin magen type II til SSF.
- Inkuber blandingen i 2 minutter, 37 ° C og 100 rpm. Samle en 2 mL prøve for DNA utvinning og flyt cytometri kvantifisering (S1).
-
Mage fordøyelse:
- Legge til 4 mL simulert mage væske (SGF), som inneholder (i mmol L-1): KCl, 6,9; KH2PO4, 0,9; NaHCO3, 25; NaCl, 47,2; MgCl2(H2O)6, 0.1, (NH4) CO3, 0,5; HCl, 15,6; CaCl2(H2O)2, 0.075. I tillegg finnes SGF 2 g/L mucin fra svin magen type II.
- Måle pH og justere pH 3 med 1 M HCl, hvis nødvendig. Ruge på 37 ° C og 100 rpm. Samle en 2 mL prøve (S2).
-
Tynntarmen fordøyelse:
- Legge til 4 mL simulert intestinal væske (SIF) som inneholder (i mmol L-1): KCl, 6.8; KH2PO4, 0,8; NaHCO3, 85; NaCl, 38.4; MgCl2(H2O)6, 0,33; HCl, 8.4; CaCl2(H2O)20,3; til fordøyelsen røret.
- Justere pH 7 med 1 M NaOH, hvis nødvendig. Ruge på 37 ° C og 100 rpm. Samle en 2 mL prøve (S3).
6. bakteriell kolonisering evne etter In Vitro Gastrointestinal transitt forhold
- Sentrifuge 2 mL tynntarmen fordøyelsen, for 10 min 2,650 x g.
- Fjerne nedbryting og bland det bakterielle pellet med 5 mL supplert DMEM uten antibiotika og antimycotic.
- Flekker og kvantifisere intakt/skadet celler ved hjelp av en flyt cytometer (se Tabell for materiale), som beskrevet av Hernandez-Sanabria et al. (2017) 11.
- Justere celle tettheten til 105 levedyktig celler/mL fortynne i supplert DMEM uten antibiotika og antimycotic.
- Fjern apikale mediet av transwell og legge 1,5 mL av bakteriell suspensjon. Co kultur systemet for 2t under generelle celle kultur forhold (37 ° C, 95% fuktighet, 5% CO2).
Merk: Denne gangen kan utvides opptil 48 timer, avhengig av eksperimentelle protokollen kreves. Co kultur kan opprettholdes i en annen inkubator enn den som brukes rutinemessig celle vedlikehold, unngå forurensing. - Måle TEER verdiene etter inkubasjon å vurdere integriteten til epithelial barrieren som beskrevet i 4.11.
- Ved fullført inkubasjonstiden, fjerne apikale media, og samle 0,5 mL for videre analyser (S4). En subsample medier kan brukes for vurdering av cellen levedyktighet av laktat Dehydrogenase (LDH) analysen (se Tabell for materiale), følger du instruksjonene fra produsenten.
- Legge til 0,5 mL 10 mM N-acetylcysteine i HBSS (NAC-buffer) som solubilize Slim produsert av HT29-MTX og gjenopprette overholdt bakterier. Inkuber platene på 37 ° C 1t, under omrøring (135 rpm, se Tabellen for materiale).
- Gjenopprette NAC-HBSS i et microcentrifuge rør (S5) og vask dobbelt cellene med 1 mL DPBS.
- Legge til 0,5 mL på 0,5% Triton X-100 (w/v) på monolayers, forstyrre cellene av pipettering, gjenopprette flytende og vortex for 1 min. hastigheten er avgjørende for å unngå å skade bakterieceller med vaskemiddel.
- Sentrifuge celler for 5 min 2,650 x g, og skille nedbryting (S6) og pellets (S7).
7. eksempel analyse
Merk: Analysere innsamlede eksemplene (S1-S7) å vurdere bakteriell levedyktighet og vedheft potensielle på intestinal cellene, etter en simulert gastrointestinal fordøyelsen.
- Bakteriell levedyktighet: passere prøver S1-S5 to ganger gjennom en 0,45 µm og kvantifisere bakterielle celler ved hjelp av live/dead celle flekker og flow cytometri, som angitt i trinn 2.811.
-
Vedheft potensielle: klargjør fortsettelsene fortynninger (-1 å-8) for S1-S6 strek 10 µL i blod agar og endret BHI plater. Ruge på 37 ° C anaerobe forholdene for 24 48 h. Plate samme volum av ufortynnet S7.
- Taxonomical identifikasjon av overholdt bakterier:
- Velg personlige kolonier med en kultur løkke og resuspend hver på 10 µL nuclease uten vann. Samle 4 µL av denne suspensjon og bruke den som en mal for PCR forsterkning av 16S rRNA genet primere og betingelsene beskrevet i 2.7.1.
- Utføre sekvensering følger protokollen i 2.7.3, og valideringen av den ved hjelp av fremgangsmåten i 2.7.4.
- Taxonomical identifikasjon av overholdt bakterier:
- Gjøre ytterligere nedstrøms analyse som totalt DNA utvinning, qPCR kvantifisering og/eller 16S rRNA amplicon sekvensering, RNA utvinning og transcriptomic profilering som ønsket.
Merk: Flyt cytometri kvantifisering ble utført umiddelbart etter prøvetaking. Som en kontroll for membran-permeabilized celler, ble et utvalg utsatt til 70 ° C til 3 min brukt. Bakgrunnsstøy ble vurdert av måling med flowcytometri fordøyelsen væsker eller prøver innhentet fra celle kultur modellen uten bakterier. Hver eksempel ble målt i tre eksemplarer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen fører til generering av en modell som er egnet for Klargjørende overlevelse og gjennomførbarheten av oral bakterier utsatt for simulert gastrointestinal transitt forhold. Grevene av intakt celler fra individuelle stammer er ca 108 celler mL-1 før etableringen av syntetiske samfunnet, mens multispecies mikrokosmos inneholdt over 90% av levedyktige cellers under etableringen av fellesskapet ( Figur 1A og 1B). Basert på Live/Dead kvantifiseringen, synker bakteriell levedyktighet etter hvert fordøyelsen trinn (figur 2). Dette kan være et resultat av syre pH under mage passering og galle salter i tynntarmen fordøyelsen væsker, som oppstår under fysiologiske forhold. Levedyktighet under transporten gjennom både i vitro og i vivo gastrointestinal fordøyelsen kan avhenge av variasjoner i miljøet (f.eks matet vs fastet forhold), eller bakterier beskyttelse prosesser (spore formasjon eller enteric belegg).
Flow cytometric teller må sammenlignes med egnede kontroller, for eksempel varme-drepte bakterier eller bakgrunnen prøver, utføre nøyaktig levedyktig celle kvantifisering18. De tøffe forholdene med den mage og tynntarm fordøyelsen kan bytte bakterier til levedyktig, men ikke-culturable celler, som bor bakterier som ikke enten vokser eller dele. Derfor avvike plate teller fra levedyktig celletall med flowcytometri. For eksempel i Figur 3er levedyktige cellers utvinnes fra mucosal grensesnittet farget i blått i flyt cytometri plottet. Men ble ingen vekst observert når prøvene Slim var belagt (resultater vises ikke).
Brøk som bakterier Vis høyere levedyktighet priser er mobilnettet rusk (S7), som åpenbart av platen teller (Figur 4). Antall kolonier kan være variabel, men tilstedeværelsen av metabolsk aktive bakterier finnes i mindre fortynnede prøvene.
Figur 1: Celle levedyktighet av bakterier komponere multispecies mikrobiell samfunnet i begynnelsen av i vitro gastrointestinal fordøyelsen. (A) levedyktig celletall (Logg enheter) kvantifisert ved live/death flekker og flyt cytometri (gjennomsnittlig ± standardavvik, n = 3). (B) representant flyt cytometri plott av multispecies mikrobiell samfunnet etter 48 h co kultur. Prikker i grønn, rød og svart representerer levedyktig, skadet og bakgrunn eller ikke-klassifisert bakterier, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: celle levedyktighet av bakterier etter simulert gastrointestinal fordøyelsen. Stolper representerer antall levedyktige cellers (Logg enheter) etter muntlig, mage og små tarm fordøyelsen trinnene (gjennomsnittlig ± standardavvik, n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant tomt levedyktig bakterieceller i slimhinnene interphase. Røde prikkene representerer bakgrunn og blå prikker levedyktig cellene. Cytometri strømningsforhold ble opprettet basert på rekvisitter et al. (2016) 19. mucosal var fortynnes 1: 100 (v/v) og farget med Sybr Green/Propidium Iodide i 15 min, og 100 µL av prøven ble målt på FL1: 533/30 nm, FL2: 585/40 nm, FL3: > 670 nm lang pass, og FL4: 675/25 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: kolonien danner enheter (CFU) vokst fra mobilnettet rusk i endret BHI plater. Tre biologiske gjentak ble brukt for bakteriell vedheft analysen og tre tekniske gjentak ble utført for CFU kvantifisering. To Repliker plater som inneholder -1 til-6 fortynninger av celle rusk (S7) vises i figuren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Cellekultur | Tilhenger / suspensjon | Dyrking Medium | De generelle kosttilskudd | Spesifikke kosttilskudd | Dobling tid | Inkubasjon forhold |
| Caco-2 (ECACC 86010202) | Tilhenger | Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) med 4,5 finans glukose | Inaktivert fosterets bovin serum (10% v/v) Penicillin (100 U/mL) * Streptomycin (0,1 mg/mL) * Amfotericin (0.0025 mg/mL) * |
Glutamax (4 mM) Selve aminoacids (1% v/v) Pyruvate (1 mM) |
65-72 h | 95% fuktighet og 10% CO2 CO2 inkubator (se Tabell for materiale) |
| HT29-MTX (ECACC 12040401) | Tilhenger | HEPES (1 mM) | 20-24 h | |||
| * Antibiotika og antifungals ble fjernet fra cellen kultur media 2 dager før analyser. | ||||||
Tabell 1: Beskrivelse av cellen linjer og medier sammensetningen celle kultur vedlikehold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den muntlige microbiome er et nøkkelelement i helse som nylig rapportert av flere forfattere20,21. Tidligere funn tyder på at inntak av spytt inneholder store mengder av bakterier kan påvirke mikrobiell økosystemet i tynntarmen, som er en av de viktigste stedene for immun grunning. Kombinasjonen av en statisk øvre gastrointestinal fordøyelsen modell med vertsgrensesnitt representert av intestinal epitel og Slim-sekresjon celler, servert å avdekke konsekvensene av mikrobielle komponenten på verten.
In vitro modeller er grunnleggende verktøy for forskning, tillater gjennomføring mekanistisk studier og oppnå bakgrunnskunnskap ment å redusere, gjør mer effektiv og bedre mål i vivo studier. Derfor er det avgjørende å sikre renhet, levedyktighet og optimal vekst av axenic kulturer før etablering syntetiske mikrobiell samfunnet. Vi anbefaler evaluering levedyktighet og sammensetningen av bakteriell samfunn før eksponering for cellekulturer, unngå skjevhet i analysen. Høyt antall skadede bakterier kan hindre vedheft og videre påvirke integriteten til celle modell. I tillegg vil bruk av en trustable kilde til cellelinjer minimere cellen linje forveksling, forurensning og dårlig merknaden, styrke eksperimentelle reproduserbarhet22.
Inkludert Slim-produserende celler kan likhet med tynntarm, som mucus og mucins gi første forsvarslinjen fordøyelsessystemet23. I tillegg er til slimhinnene lag egnet for bakteriell kolonisering, slik at karakteristisk bilaterale transport av bakteriell metabolitter. Videre øke simulert gastrointestinal forhold vedheft evnen av Lactobacillus paracasei stammer til Caco-2 og mucin24, støtter relevansen av omfatter fordøyelsen prosessene i modellen.
Ytterligere forbedringer i modellen kan innføres for å innlemme komponenten immun vert som tidligere vurdert25. Imidlertid har gjeldende co kultur systemer av epitel og immunsystemet cellene ikke blitt brukt for vert-mikrobe samhandling programmer (f.eks evalueringen av mat bioaktive forbindelser eller probiotika), noe som kan indikere at disse systemene kan mangle reproduserbarhet25.
Tidligere forskning med Caco-2, HT29-MTX eller co kulturer vurdert vedheft av probiotiske eller sykdomsfremkallende stammer til pattedyrceller26,27. Bruke enkelt flekker eller sammenslutninger av noen mikroorganismer kan gi en begrenset oversikt på verten-mikrobe interaksjoner, og det er ikke representative for kompleksiteten i den menneskelige mage-tarmkanalen. Selv om bruken av naturlige mikrobielle samfunn kan være mer representativt for scenariet i vivo , er de vanskelig å karakterisere og studere. I kontrast, tilbyr vår metode muligheten til å vurdere flere vert-mikrobe interaksjoner, ved hjelp av en kompleks og representative mikrokosmos. Bruk av et definert syntetiske mikrobielle samfunn tillater generering av et system med redusert kompleksitet28. Endringer i samfunnet kan være et resultat av microenvironmental forhold i forbindelse med personlige eksperimenter. Dermed kan mikrobiell komponenten av denne modellen enkelt skaleres opp eller ned for nedbygging virkningen av miljøet som en selektiv kraft. Til slutt, prøvetaking tilgjengelighet garanterer videre karakterisering av funksjonelle aktiviteter både menneskelige celler og tilknyttede mikrobiell fellesskapet.
I de siste årene, er nye i vitro modeller basert på organoid-teknologi utviklet. Organoids er 3D cellekulturer som innlemme noen av de viktigste funksjonene i representert primære vevet. Selv om intestinal organoids er en nær-fysiologiske systemet for å studere voksen stilk celler og vev, har slik modellen også noen begrensninger. Intestinal organoids begrenset bruk i ligner inflammatorisk Svar å infeksjon eller narkotika, som de mangler immunceller. I tillegg er organoids heterogene om levedyktighet, størrelse og form, hindrer fenotypen screening og gjengivelse standardisering komplekse. Til tross for begrensning av udødeliggjort linjer for i vitro modellering av sunt vev, tilbyr bruk av godt karakterisert og stabil cellelinjer også fordeler som repeterbarhet, reproduserbarhet og lave kostnader. Disse fordelene tillate samtidig screening av flere forhold, men translasjonsforskning bruk av dataene er kontroversielt. Primær celler kan være mer representativt for i vivo fysiologi; men de har høye Inter-individuelle variasjon, er ikke fullt preget, er heterogene og har et begrenset tidsrom. Disse faktorene er en ulempe for inkludert flere betingelser eller replikeres i en analysen.
Som kombinerer linjer med komplekse mikrobielle samfunn kan representere en utfordring, fokusert vi på å utvikle en reproduserbar og repeterbare modell med høy fleksibilitet og anvendbarhet i laboratorier med grunnleggende celle utstyr, til mer representativt modeller ble tilgjengelig og godt kjennetegnes. Vi har evaluert funksjonaliteten til ulike bakteriell samfunn bruke disse multicompartment modeller, for eksempel for å vurdere probiotiske atferd i øvre gastrointestinal skrift og karakteristisk xenobiotic oval innvirkning på gut grensesnittet. Derfor foreslår vi denne modellen som en base for videre analyser med en rekke probiotika, narkotika eller mat forbindelser, innenfor en relevant og definert i vitro økosystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner takknemlig støtte fra Flandern Research Foundation til Marta Calatayud Arroyo (CVE postdoctoral fellowship-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria er postdoktor støttes av Flandern innovasjon og entreprenørskap (Agentschap voor Innovatie døren Wetenschap no Technologie, IWT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | - | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | - | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533 (2016).
- Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
- Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
- Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
- Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
- Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133 (2014).
- Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
- Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235 (2017).
- Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
- Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340 (2018).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
- Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
- Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
- Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
- Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
- Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
- Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307 (2015).
- Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
- Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
- Kleiveland, C. R., et al. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Springer International Publishing. 197-205 (2015).
- Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
- Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
- Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).
