Summary
Gut ana bilgisayar-mikrop etkileşimleri sentetik bir sözlü topluluk, vitro gastrointestinal sindirim ve ince bağırsak epitel modeli birleştirerek yeni bir yaklaşım kullanarak değerlendirildi. Biz hücre istilası patojenler ve çoklu türler biyofilmler değerlendirmek veya bile probiyotik formülasyonları Beka sınamak için adapte edilebilir bir yöntem mevcut.
Abstract
Ana bilgisayar ile microbiota arasında Interplay uzun tanınmış ve geniş biçimde anlatılmıştır. Olarak ikamet microbiota oluşur ve eksojen bakteri kolonizasyonu engeller ağız gastrointestinal sistem, diğer bölümlere benzer olduğunu. Nitekim, 600'den fazla bakteri türleri ağız boşluğunda bulunur ve tek bir kişi etrafında 100 herhangi bir zamanda farklı taşıyabilir. Oral bakteri böylece yerleşik mikrobiyal topluluklar ve lehine büyüme ve hayatta kalma içinde entegre olma sözlü ekosistem çeşitli nişler uygun yeteneğine sahip. Ancak, yutma sırasında gut bakteri akışına gut microbiota dengesini rahatsız etmek önerdi. Aslında, P. gingivalis , sözlü yönetimi ileal mikrofloranın bakteriyel kompozisyon kaymıştır. Biz hayatta kalma ve canlılığı oral bakteri simüle gastrointestinal transit koşullara tabi aydınlatmak için doğal sözlü ekosistem basitleştirilmiş bir temsili sentetik bir topluluk kullanılır. On dört tür seçilen vitro tükürük, mide ve bağırsak sindirim işlemlere tabi ve gut mukozal epitel benzetimini yapmak için Caco-2 ve HT29-MTX hücreleri içeren bir multicompartment hücre modeli sundu. Bu model yuttu bakteri hücreleri enterohepatic dolaşımda yer üzerinde etkisini çözmeye devam eder. Sentetik topluluklar kullanarak kontrol edilebilirlik ve tekrarlanabilirlik için sağlar. Böylece, bu yöntemi patojen canlılığı ve sonraki iltihap ilişkili değişiklikler, probiyotik karışımları, kolonizasyon kapasitesini değerlendirmek için adapte edilebilir ve sonuçta, potansiyel bakteriyel presystemic dolaşım üzerinde etkisi.
Introduction
İnsanlar insan hücreleri1olarak aynı numarada bulunan bakteri ile birlikte yaşamak. Bu nedenle, bu çok önemli bir insan microbiome kapsamlı bir anlayış elde etmek önemlidir. Böylece çok çeşitli bakteri ve o farklı konumlardaki biyofilmler içeren birkaç daha küçük yaşam alanları bölünmüş oral kavite benzersiz bir ortam olmamasıdır. Açık bir ekosistem olmak, bazı türler ağız-ebilmek var olmak geçici ziyaretçi. Ancak, yakında Doğum ve form biyofilmler2düzenlenen sonra bazı mikroorganizmalar kolonize. Bunlar diş yüzeyi dişeti yarık, subgingival Aralık bașlığı, dil, mukozal yüzeyler ve diş protez ve dolgular3üzerinde bulunur. Flocs ve diş kanalı'nın lümen planktonik hücrelerde nekrotik hamuru doku ile karışıyor ya da bir sıvı faz askıya gibi bakteriler de mevcut olabilir.
Aktif, sürekli çapraz-hadis konak hücreleri ve ikamet microbiota4arasında vardır. Bakteri içinde ve türler arasında iletişim ve diğer bakteriler için birincil bu sömürgecilerin takmak iken doğal sömürgecilerin sadece küçük bir oranda dokulara, uygun. Örneğin, hücre-hücre bağlama mikroorganizmalar arasında ikincil sömürgecilerin sözlü biyofilmler entegre ve etkileşen mikrobiyal hücreleri4karmaşık ağ oluşturmak için anahtardır. Yaklaşık bir tükürük örneği bakteriyel toplamları % 70'i Porphyromonas sp., Streptococcus sp., Prevotella sp., Veillonella sp. ve tanımlanamayan Bacteroidetestarafından oluşturulur. F. nucleatum bir ara sömürge subgingival biyofilm ve toplamları periodontitis5' te karıştığı P. gingivalis, T. denticola ve Tannerella hor çiçeği, geç sömürgecilerin ile mevcuttur. Buna ek olarak, S. sanguinis ve S. gordonii diş3kolonize etmek tercih ederken Streptococcus mitis mukozal ve diş habitatları, kaplar. Özellikle naeslundii üst anteriors6' bulundu böylece, S. sanguinis alt kesici ve köpek dişi, mevcut ise.
Buna ek olarak, yerli microbiome insan sağlığı2korumada bir rol oynar. İkamet microbiota bağışıklık eğitim ve patojen genişleme engelleyen katılmaktadır. Çünkü yerli bakteri daha iyi adapte yüzeylere ekleme ve büyüme için kullanılabilir besin metabolising, daha verimli olabilir bu kolonizasyonu direnç oluşur. Probiyotik suşları gastrointestinal geçit hayatta kalmak ve etkin olarak kalır, ancak otokton bakteriler gastrointestinal sistem bir üst konumdan yuttu ve tam olarak tarif edilmiştir değil. Böylece, yapay bir topluluk, sözlü ekosistem temsilcisi simüle gastrointestinal transit koşullara tabi. Bakteriyel hücre canlılığı Bağırsak epitel benzeyen bir multicompartment modeli kullanılarak değerlendirildi. Geçerli gut simülatörleri luminal mikrobiyal topluluk7analizi açısından uygun tekrarlanabilirlik sunuyoruz. Hücre hatları mikrobiyal topluluklar ile birleştirerek8meydan okuyor gibi ancak, bakteriyel yapışma ve ana bilgisayar-mikrop etkileşim ayrı olarak, ele alınmaktadır. Buna ek olarak, biz başarılı kolonizasyon olaylar gut arabirimde bildirilen olası mekanik açıklama sağlar bir çerçeve mevcut. Gerçekten de, bu model ortaklaşa bir statik gut modeli ile yüzey sinyal (izleme) ana bilgisayar üzerinde mikrobiyal topluluklar etkisini değerlendirmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. suşları ve kültür koşulları
Not: Sentetik sözlü topluluk suşları oral microbiome3' te yaygın olarak mevcut tarafından bestelendi.
- Aşağıdaki suşları Amerikan tipi kültür koleksiyonu (ATCC) dan elde etmek: Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus mutans çoğunlukla (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), özellikle naeslundii (ATCC 51655), Streptokok gordonii (ATCC 49818), özellikle viscosus (ATCC 15987) ve Streptococcus mitis (ATCC 49456).
- Veillonella parvula Leibniz Enstitüsü Bacterial-Alman mikroorganizmaların koleksiyonu ve hücre kültürleri (DSM 2007), Streptococcus sanguinis BCCM/LMG bakteri Collection (LMG 14657) elde etmek ve kullanmak Streptokok salivarius zorlanma TOVE-R9ve streptokok oralis10.
2. Kalkınma ve Oral Microbiome Multispecies toplum temsilcisi
Not: oral bakteri vitro Bağırsak epitel için potansiyel yapışma kapasitesini simüle etmek için sentetik bir topluluk oluşturur. 5 μg/mL kanülü, 1 μg/mL Menadion ve %5 steril defibrinated at kan, Hernandez-Sanabria vd içinde açıklandığı gibi takıma kan ağar kaplamalar bakteri büyümesi (2017) 11. kısaca:
- 100 mg 2 ml 1 M NaOH hemin geçiyoruz, 100 mL distile autoclaved su ekleyin. Karanlık bir kapta saklayın. 0,22 µm filtreden orta olarak eklemeden önce sterilize.
- Menadion % 96 etanol 20 ml 100 mg geçiyoruz. 0,22 µm filtreden orta olarak eklemeden önce sterilize.
- 1 L kan agar orta hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) göre üreticinin yönergeleri ve basınçlı kap. At kan ve takviyeleri eklemeden önce soğumaya bırakın. Mix ve tabakları dökün.
- Değiştirilmiş beyin kalp infüzyon (BHI) et suyu daha önce bildirilen12olarak hazırlayın. Hemin 5 μg/mL ve 1 μg/mL Menadion ısıyla sonra ekleyin.
- 9 mL Hungate tüpler ortamda dağıtmak ve kauçuk tıpa ve bir alüminyum kap ile kapatın. N2Co2 (% %90/10) tüplerini boşalt.
- Anaerobik orta 1 mL şırınga ile almak ve bir 1.5 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin. Her bakteri türlerinin tek kolonileri alın, orta resuspend ve geri anaerobik değiştirilmiş BHI aktarın. Dışında hangi 24 saat inkübe gerekir S. salivarius, 37 ° C'de 48 h için kuluçkaya.
-
Gerekirse, saflık kültürlerin sentetik topluluk montaj önce onaylayın. Kısaca:
- Hernandez-Sanabria vd gibi sıvı kültürleri DNA ayıklamak (2010) 13 ve primerler kullanılarak 16S rRNA gen yükseltmek 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) ve 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT) ve aşağıdaki programı: 95 ° C'de 5 dakika 30 döngüleri 95 ° c için 1 dakika, 55 ° C için 1 dk ve 1,5 dk 72 ° C takip son uzantısı adım 72 ° C'de 5 dakika
- Bir ticari PCR ürünüyle arındırmak ( Tablo malzemelerigörmek) kit, üreticinin yönergeleri izleyin.
- Saflaştırılmış ürünler sıralama tepkisi, 0.5 μL içeren bir 10 μL toplam hacmindeki gerçekleştirmek (bkz. Tablo malzemeler), boya M13f astar (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC), 5 x sıralama arabellek ve 20 2.0 μL 3.2 pmol ng şablonunun, kullanarak bir ticari sıralama sistemi kiti ile (bkz. Tablo malzeme).
Not: Ticari olarak gerçekleştirilen bu yordamı var. - En yakın bilinen takson belirlemek ve RDP Sınıflandırıcısı çevrimiçi aracını (http://rdp.cme.msu.edu/) ve SINA kullanarak orijinal türe sıra ile karşılaştırmak için tüm serilerinde (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) üzerinde bir patlama arama yapın Hizalama hizmet (https://www.arb-silva.de/aligner/).
- Akış Sitometresi ve SYBR yeşil/Propidium iyodür leke Hernandez-Sanabria vd içinde açıklandığı gibi kullanarak cep numarasını inkübasyon sonunda ölçmek (2017) 11. 105 hücreleri mL-1için kültürler sulandırmak, kullanarak BHI değiştirildi.
- S. mitis 1 mL 75 mL anaerobik BHI içine ekleyin ve durağan faz (6 h) kadar kuluçkaya. Ardından, her seyreltilmiş zorlanma ve mix anaerobik koşullarda 0.75 mL toplamak.
- Bir kez tüm kültürler karışık, evren 1 mL alıp BHI için 75 mL ekleyin. Sentetik topluluk % 10 'un altında kuluçkaya CO2, % 10 H2, 48 h 37 ° C'de ve 200 rpm (bkz. Tablo reçetesi) için % 80'i N2 .
- Ölçü birimi hücre yoğunluğu 2.8 olduğu gibi. hücre modeli topluma sunma önce. Kompozisyon topluluk nicel gerçek zamanlı PCR, primerler kullanılarak ve sıcaklıklar Slomka vd. , Tablo 1'deki tavlama ile tespit edilebilir (2017) 10. Buna ek olarak, ilk Üyeler mevcut13,14bilgi sağlamak için 16S rRNA gen amplicon sıralama kullanın. İki kimlik doğrulayan protokolü için cDNA aktif protein transkripsiyonu bakteri belirtmek için şablon olarak kullanabileceğiniz ve DNA varlığı / suşları yokluğunda ortaya çıkarmak için bir şablon olarak kullanın.
3. genel hücre kültürü uygulamaları
Not: hücre kültürü genel özellikleri için yazarlar ana ve Stacey (2007)15bakın. Avrupa koleksiyon kimliği doğrulanmış hücre kültürleri (Caco-2 ECACC 86010202 ve HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, halk sağlığı İngiltere, Birleşik Krallık) kullanılan hücre çizgiler edinin. Hücre kültürü kimyasalları satın alınabilir (bkz. Tablo malzemeler), aksi belirtilmediği sürece.
-
Bakım ve Caco-2 ve HT29-MTX hücre satırları passaging
Not: Caco-2 ve HT29-MTX hücreleri ilave DMEM Orta (Tablo 1) içeren 25 cm2 doku kültürü şişeler içinde düzenli olarak yetiştirilmektedir. 60-%70 izdiham ulaşıldığında hücreleri trypsinized.- Hücre kültür orta şişeler kaldırın. PBS 5 mL Ca++/Mg++olmadan iki kez yıkayın.
- 2 mL 0.5 mg/L çözeltisi tripsin ve 0,22 g/L etilen diamin tetraacetic asit (EDTA) ekleyin. Tripsin çözüm şişeye yavaşça hareket ettirerek dağıtın. 1.5 mL tripsin çözeltisi kaldırmak ve şişeye 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
- Mikroskop altında hücreleri şişesi yüzeyden müstakil Eğer kontrol edin. Ek 5 min için gerekirse kuluçkaya.
- 5 mL ilave hücre kültür ortamının tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için balonun ekleyin. Damlalıklı yukarı ve aşağı bir homojen tek hücre süspansiyon elde etmek için.
- Hemen, bir 50 µL hücre süspansiyon aliquot alın ve steril % 0,4 Trypan mavi çözüm 1:1 (v/v) oran Caco-2 hücreler için veya HT29-MTX için 1:5 v/v ile karıştırın. Pipetting ve yük karışımı içine bir sayım odası ( Tablo malzemelerigörmek).
- (Beyaz parlak hücreleri) hücrelerin mikroskop altında saymak (üretici yönergelerine bakın).
- 4 x 105 hücreleri/cm2 ve 1 x 104 hücreleri/cm2, yoğunluğu, yeni bir şişe içinde Caco-2 ve HT29-MTX, sırasıyla tohum.
Not: (1) Caco-2 hücreleri ayırt etmek ve bir kez confluency ulaşan sıkı kavşak oluşturur. Bitti-confluency trypsinization önce önlemek son derece önemlidir. Şişesi hücrelerde büyüme hatası trypsinization ve/veya hücre kümeleri sonra hücre dekolmanı neden olabilir. (2) HT29-MTX hücreler mukus üreten hücreleri ile yüksek metabolik aktivite16. Özellikle hücreleri yüksek yoğunluklu iseniz bu özellikleri hızlı bir asitleştirme hücre kültür ortamının neden olabilir. HEPES tampon hücre kültür orta (pH 7 ve 7.2 arasında korumak için,Tablo 1) eklenebilir. PH düşerse, orta olabilir ne zaman confluency değiş tokuş az % 50'dir. Ancak, Eğer confluency > % 50, hücre kültürü bölmek gerekir.
4. Gut ana bilgisayar-mikrop arabirimi taklit bir Multicompartment hücre modeli Meclisi
Not: çift odası Wells (çapı 24 mm, gözenek boyutu 0.4 mikron; bkz: Malzemeler tablo) ortak kültür tamamlayın.
- Apikal bölme ve bazal 2 mL tam hücre kültür ortamının 1,5 mL ekleyin. 20-30 dk'ya hücre süspansiyon eşit dağılımı ne zaman tohum elde etmek önceden kuluçkaya.
- Hücre kültürü Caco-2 ve HT29-MTX madde 3 te açıklandığı gibi trypsinize. Trypsinization yordamı doğru bir şekilde her iki hücre satır kümeleri olmadan bir tek hücre süspansiyon homojen dağılımı elde etmek için takip gerekir.
- Hücrelerin içinde 3.1.8 açıklandığı gibi say.
- 6.5 x 104 hücreleri/cm2 90/10 orantılı Caco-2/HT29-MTX hücre hücre yoğunluğu ayarlayın.
- Hücre süspansiyonlar homojenize ve önceden doldurulmuş bir Steril konteyner desteklenmiştir hücre kültür medya ile ilgili birimin Caco-2 ve HT29-MTX hücre eklemek. Önceden inkübe medya odası apikal taraftan aspirasyon tarafından kaldırın.
- Yavaşça hücre süspansiyon pipetting tarafından mix ve 1,5 mL odası ekler apikal bölüme transfer. Hücreleri tortu için eğilimi gibi tohumlama yordam hücre süspansiyon sürekli bir homojenizasyon gerektirir. Çalışma hızı ve Kullanıcı deneyimi bağlı olarak 1-3 kuyu dağıtımı sonra hücre süspansiyon karışık gerekir.
- Tabak hafifçe geriye ve ileriye taşımak ve sonra sağa soldan sağa için (5-10 kez) daha elde etmek için hücreleri iyi yayılmasını. Kuluçka için transfer ve plakaların hareketi tekrarlayın.
- Ortak kültür Caco-2/HT29-MTX hücre apikal ve bazal bölmeleri 2 günde ilave DMEM ile yenileme 15 gün, korumak. Bu saatten sonra hücre kültürü medya ilave DMEM antibiyotik/antimycotic çözüm olmadan değiştirilebilir.
- 20 – 21 gün 2 günde Orta yenileyerek sonrası tohum kadar sistem korumak.
-
Elektrik direnç sistemi kullanarak tahlil, başlamadan önce epitel bariyer bütünlüğünü ölçmek (bkz. tablo reçetesi) üretici talimatları.
- AYLARININ ekipman dolu olduğundan emin olun (> 24 h) ölçümleri başlamadan önce.
- AYLARININ ekipman güç kaynağı ve kapak plastik basınçlı kap bir çanta bağlantısını kesin. Çantada ölçerde giriş portuna takın ve elektrot tanıtmak için bir delik açın. % 70 etanol/su (v/v) akış kabin içine aylarının ekipman tanıtımı önce sprey.
- Elektrot dezenfekte için 15 s. durulama önceden ısıtılmış hücre kültür medya elektrot için elektrot ipuçları % 70 etanol/su (v/v) çözüm 15 dk. izin ver hava kuru bırakın.
- Kuluçka makinesi hücreleri al ve hücreleri kabine akışını iç oda sıcaklığı gelmek izin verir.
- Taksimetre fiyat istemek--dan kesildiğinden emin olun. Ohm ve güç anahtarı çevirmek için mod anahtarı ayarlayın.
- Hücre direnç eklemek içinde daha kısa uç ve kuyu dışına uzun uç elektrot çeker tarafından ölçmek. Elektrot plaka Ekle'nin üzerine bir 90 ° açıyla tut.
5. bakteriyel hayatta kalma vitro Gastrointestinal Transit koşulları takip
Not: simüle sindirim hazırlamak Minekus vd. protokol sonrası sıvı (2014) 17, aşağıda açıklanan değişiklikleri ile. Ultrasaf Su ile bütün dilutions hazırlayın. Filtre sterilize-tüm çözümler 0,22 µm filtreden ve steril koşullarda sindirim yordamı gerçekleştirin.
-
Ağız sindirim:
- Bakteriyel topluluk 3 mL 50 mL steril tüp içinde yer, mix (mmol L-1içinde) içeren simüle tükürük sıvısı (SSF), 3 mL ile: KCl, 15,1; KH2PO4, 3.7; NaHCO3, 6.8; MgCl2(H2O)6, 0.5, (NH4) CO3, 0,06; HCl, 1.1; CaCl2(H2O)2, 0,75. İnsan tükürük IX-A tipi 75 U/mL α-amilaz domuz mide türü II 2 g/L müsin SSF için ekleyin.
- 37 ° C ve 100 rpm 2 min için karışım kuluçkaya. DNA ekstraksiyon ve akış sitometresi miktar (S1) için 2 mL örnek toplamak.
-
Mide sindirim:
- (Mmol L-1içinde) içeren simüle mide sıvısı (SGF), 4 mL ekleyin: KCl, 6,9; KH2PO4, 0,9; NaHCO3, 25; NaCl, 47.2; MgCl2(H2O)6, 0.1, (NH4) CO3, 0,5; HCl, 15,6; CaCl2(H2O)2, 0.075. Buna ek olarak, 2 g/L II domuz mide türünden müsin SGF içeriyordu.
- PH ölçmek ve pH 3 1 M HCl ile için gerekirse ayarlayın. 37 ° C ve 100 rpm kuluçkaya. 2 mL örnek (S2) toplamak.
-
İnce bağırsak sindirim:
- (Mmol L-1içinde) içeren simüle bağırsak sıvı (SIF) 4 mL ekleyin: KCl, 6.8; KH2PO4, 0,8; NaHCO3, 85; NaCl, 38.4; MgCl2(H2O)6, 0,33; HCl, 8.4; CaCl2(H2O)2, 0.3; sindirim tüp.
- PH 7 1 M NaOH ile için gerekirse ayarlayın. 37 ° C ve 100 rpm kuluçkaya. 2 mL örnek (S3) toplamak.
6. bakteriyel kolonizasyon yetenek vitro Gastrointestinal Transit koşulları takip
- 2 mL ince bağırsak sindirime 2,650 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak ve bakteriyel Pelet olmadan antibiyotik ve antimycotic ilave DMEM 5 mL ile karıştırın.
- Leke ve sağlam/hasarlı hücrelerin bir akış sitometresi kullanarak ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek), Hernandez-Sanabria vd tarafından açıklandığı gibi (2017) 11.
- Hücre yoğunluğu 105 canlı hücre/ml ilave DMEM antibiyotik ve antimycotic olmadan sulandrarak ayarlayın.
- Transwell sisteminin apikal orta kaldırın ve bakteriyel süspansiyon 1,5 mL ekleyin. Sistemin genel hücre kültür koşullar (37 ° C, % 95 nem oranı, % 5 CO2) altında 2 h için ortak kültür.
Not: En fazla 48 saat, gerekli Deneysel protokol bağlı olarak bu süre uzatılabilir. Ortak kültür contaminations önlemek için rutin hücre bakım için kullanılan daha farklı bir kuluçka muhafaza edilebilir. - Kuluçka 4.11 içinde açıklandığı gibi epitel bariyer bütünlüğünü değerlendirmek için sonra aylarının değerleri ölçmek.
- Kuluçka süresi, takımlar üzerine apikal medyayı çıkarın ve daha fazla analizleri (S4) 0.5 mL toplamak. Bir subsample medya hücre canlılık değerlendirilmesi için laktat dehidrogenaz (karaciğer) tahlil tarafından kullanılabilir (bkz. Tablo reçetesi) üretici talimatları.
- 10 mM N-acetylcysteine 0.5 mL HBSS içinde (NAC-tampon) HT29-MTX tarafından üretilen mukus solubilize ve yapıştırılan bakteri kurtarmak için ekleyin. Plakalar için 1 h, ajitasyon altında 37 ° C'de kuluçkaya (135 rpm, bkz: Malzemeler tablo).
- NAC-HBSS bir microcentrifuge tüp (S5) yeniden elde etmek ve iki kez 1 mL DPBS hücrelerle yıkayın.
- % 0,5 0,5 mL ekleyin Triton X-100 (w/v) üstünde tepe-in monolayers, pipetting tarafından hücreleri bozabilir, 1 dk. hız deterjan ile bakteri hücreleri zarar görmesini önlemek çok önemlidir için sıvı ve girdap kurtaramaz.
- Hücreler için 2,650 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant (S6) ve Pelet (S7) ayırın.
7. örnek Analizi
Not: toplanan örnekleri (S1-S7) bakteriyel viability değerlendirmek için ve yapışma simüle gastrointestinal sindirim takip bağırsak hücreleri için potansiyel inceliyorlar.
- Bakteriyel canlılık: Pass örnekleri S1-S5 0,45 µm ile iki kez ve bakteri hücreleri canlı/ölü hücre boyama kullanarak ölçmek ve akış sitometresi, adım 2.811' de gösterildiği gibi.
-
Yapışma potansiyel: seri dilutions (-1 -8) S1-S6 için hazırlamak ve 10 µL kan agar çizgi ve BHI plakaları değiştirilmiş. 24-48 h plaka su katılmamış S7 aynı hacmi için anaerobik koşullarda 37 ° C'de kuluçkaya.
- Yapıştırılan bakteri taxonomical tanımlaması:
- Bir kültür döngü ile bireysel kolonileri alın ve her 10 µL nükleaz ücretsiz su üzerinde resuspend. Bu süspansiyon, 4 µL toplamak ve PCR güçlendirme astar ve 2.7.1 içinde tanımlanan koşullara kullanarak 16S rRNA gen için şablon olarak kullanabilirsiniz.
- 2.7.3 protokolünde aşağıdaki sıralama gerçekleştirmek ve doğrulama yordamı kullanarak sırası 2.7.4 içinde dahil.
- Yapıştırılan bakteri taxonomical tanımlaması:
- Yapmak daha da aşağı akım Analizi toplam DNA ekstraksiyon, qPCR miktar ve/veya 16S rRNA amplicon sıralama, RNA ayıklama ve profil oluşturma istediğiniz gibi transcriptomic gibi.
Not: Akış sitometresi miktar hemen örnekleme sonra gerçekleştirildi. Hücre membran permeabilized için bir denetim olarak 70 ° c 3 dakika maruz bir örnek kullanıldı. Arka plan gürültü sindirim sıvıları veya hücre kültür model bakteri olmadan elde edilen örnekler akış sitometresi ile ölçerek değerlendirildi. Her örnek nüsha ölçüldü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı hayatta kalma ve canlılığı oral bakteri simüle gastrointestinal transit koşullara tabi elucidating için uygun bir model nesil yol açar. Bireysel suşları sağlam hücre sayımları olduğunu yaklaşık 108 hücreleri mL-1 önceden sentetik toplumla, hücrelerin % 90'ı yer alan topluluk (kurulması sırasında multispecies evren oluşturulması Şekil 1A ve 1B). Canlı/ölü miktar üzerinde bağlı olarak, bakteriyel canlılığı her sindirim adım (Şekil 2) sonra azalır. Bu mide geçiş sırasında asit pH ve safra tuzları fizyolojik koşullar altında meydana gelen olarak ince bağırsak sindirim sıvıları, içerdiği bir sonuç olabilir. Çevre farklılığı canlılığı içinde in vitro ve in vivo gastrointestinal sindirim yoluyla transit sırasında bağlıdır (Örneğin, beslenen vs oruç koşulları), hatta üzerinde bakteri koruma işlemleri (spor oluşumu veya enterik kaplama).
Akış sitometrik sayar gibi ısı öldürdü bakteri veya arka plan örnekleri, doğru uygun hücre miktar18gerçekleştirmek için uygun denetimler ile karşılaştırıldığında gerekir. Mide ve ince bağırsak sindirim sert koşullarına bakteri ya büyüyen bölmek veya değil canlı bakteri olan uygun ama culturable olmayan hücreleri için geçiş yapabilirsiniz. Bu nedenle, geçerli hücre sayımları akış sitometresi ile elde edilen plaka sayıları farklıdır. Örneğin, Şekil 3' te, mukozal arabiriminden kurtarılan hücrelerin akış sitometresi Arsa mavi renkli. Ancak, hiçbir büyüme ne zaman bu balgam örneklerinin (kaplama sonuçları gösterilmez) olduğu görülmüştür.
Bakteri yüksek canlılık oranları show kesir hücresel enkaz (S7), (Şekil 4) sayma plaka tarafından ortaya gibidir. Koloni sayısı değişken olabilir ama metabolik olarak aktif bakteri varlığı daha az seyreltilmiş örneklerinde bulunur.
Resim 1: canlılık in vitro sindirim sindirim başında multispecies mikrobiyal topluluk birçok parçalardan oluşan bakteri hücre. (A) geçerli hücre sayısı (günlük adet) tarafından canlı/ölüm boyama ve akış sitometresi sayılabilir (ortalama ± standart sapma, n = 3). (B) temsilcisi akış sitometresi Arsa multispecies mikrobiyal toplumun ortak kültür 48 saat sonra. Yeşil, kırmızı ve siyah temsil uygun, zarar görmüş ve arka plan veya gizli olmayan bakteriler, sırasıyla nokta. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: hücre canlılığı bakteri simüle gastrointestinal sindirim sonra. Çubuklar ağız, mide ve küçük bağırsak sindirim adımlardan sonra hücrelerin (günlük adet) sayısını gösterir (ortalama ± standart sapma, n = 3). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: mukozal Interphase canlı bakteri hücreleri temsil eden arsa. Kırmızı noktalar hücrelerin arka plan ve mavi noktalar temsil eder. Akış Sitometresi koşulları üzerinde sahne ve ark. dayalı kurulmuştur (2016) 19. mukozal örnekleri seyreltilmiş (v/v) 1: 100 vardı ve Sybr yeşil/Propidium iyodür ile 15 dakikadır lekeli ve örnek 100 µL FL1 ölçülen: 533/30 nm, FL2: 585/40 nm, FL3: > 670 nm uzun pas ve FL4: 675/25 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: hücresel enkaz üzerinden yetiştirilen birimleri (CFU) oluşturan Colony BHI plakaları değiştirilmiş. Üç biyolojik çoğaltır bakteriyel yapışma tahlil için kullanıldı ve üç teknik çoğaltır CFU miktar için gerçekleştirilmiştir. -1-6 dilutions, hücre artıkları (S7) olarak içeren iki Çoğalt tabak şekilde gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Hücre kültürü | Yapışık / süspansiyon | Orta kültür | Genel takviyeleri | Özel takviyeleri | Zaman iki katına | Kuluçka koşulları |
| Caco-2 (ECACC 86010202) | Yapışık | Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) ile 4,5 g/M glikoz | Inaktif fetal Sığır serum (% 10 v/v) Penisilin (100 U/mL) * Streptomisin (0.1 mg/mL) * Amfoterisin (0.0025 mg/mL) * |
Glutamax (4 mM) Gerekli olmayan amino asitli (% 1 v/v) Pyruvate (1 mM) |
65-72 h | % 95 nem oranı ve % 10 CO2 CO2 kuluçka ( Tablo malzemelerigörmek) |
| HT29-MTX (ECACC 12040401) | Yapışık | HEPES (1 mM) | 20-24 h | |||
| * Antibiyotik ve antifungaller hücre kültür ortamından deneyleri başlamadan önce 2 gün çıkarıldı. | ||||||
Tablo 1: Hücre kültürü bakım hücre satırları ve medya kompozisyon açıklaması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oral microbiome bir insan sağlığı gibi son birkaç yazarlar20,21tarafından bildirilen unsurdur. Önceki bulgular tükürük bakteri büyük yükler içeren sindirim bir bağışıklık astar için ana sitelerin ince bağırsak mikrobiyal ekosistem üzerinde etkili olabileceği öneririz. Bir statik üst gastrointestinal sindirim modeli mikrobiyal bileşen ana bilgisayarda etkisini çözülmeye hizmet Bağırsak epitel ve mukus salgılayan hücreler tarafından temsil edilen ev sahibi arayüzey ile kombinasyonu.
Araştırma, mekanik çalışmalar yürütülmesi ve azaltmak amacıyla arka plan bilgisi elde etmek için izin daha verimli ve daha iyi hedef in vivo çalışmalar yapmak için vitro modelleri temel araçlardır. Bu nedenle, saflık, canlılık ve sentetik mikrobiyal topluluk oluşturma önce axenic kültürlerin en uygun büyüme sağlamak için önemlidir. Canlılık ve kompozisyon toplulukların analiz önyargı önlemek için bakteriyel hücre kültürleri, maruz önce değerlendirilmesi tavsiye ediyoruz. Hasarlı bakteri sayısının yüksek yapışma engel ve daha fazla hücre modeli bütünlüğünü etkileyebilir. Buna ek olarak, hücre satır güvenilir bir kaynak kullanımını hücre satırı engellendiğini düşündüğünüz yönündeki beyanınız, kirlenme ve zavallı ek açıklama, deneysel tekrarlanabilirlik22arttırmak en aza indirmek olacaktır.
Mukus ve mucins gastrointestinal sistem23ilk savunma hattını oluşturur gibi mukus üreten hücreleri de dahil olmak üzere ince bağırsak, benzerlik sağlar. Buna ek olarak, mukozal tabaka bakteri kolonizasyonu, bakteriyel metabolitleri karakterize ikili taşıma için izin için uygundur. Ayrıca, benzetimli gastrointestinal şartları modelimiz sindirim süreçlerinde birleşmeyle alaka destekleyen Caco-2 ve müsin24, Lactobacillus paracasei suşlarının yapışma yeteneği artırın.
Daha fazla iyileştirmeler modelindeki bağışıklık ana bileşeni, daha önce geçirilmiş25olarak dahil etmek için tanıttı olabilir. Ancak, mevcut ortak kültür sistemleri epitel ve bağışıklık hücrelerinin bu sistemlerin eksikliği gösteriyor olabilir ev sahibi-mikrop etkileşim uygulamalar için (Örneğin, değerlendirme gıda biyoaktif bileşikler veya probiyotikler), kullanılmayan tekrarlanabilirlik25.
Caco-2, HT29-MTX veya ortak kültürler ile önceki araştırma probiyotik veya patojenik suşları memeli hücreleri26,27yapışma değerlendirildi. Tek kullanarak lekeleri veya dernekler kaç mikroorganizmaların sınırlı genel bakış etkileşimleri üzerinde ana bilgisayar mikrop sağlayabilir ve insan gastrointestinal sistem karmaşıklığı temsilcisi değildir. Doğal mikrobiyal topluluklar kullanımı vivo içinde senaryo daha fazla temsilcisi olmasına rağmen onlar zor karakterize ve çalışma vardır. Buna ek olarak, metodolojimiz bir karmaşık ve temsilcisi evren kullanarak birden çok ana bilgisayar-mikrop etkileşimleri değerlendirme fırsatı sunmaktadır. Azaltılan karmaşıklık28sistemiyle nesil için tanımlanmış bir sentetik mikrobiyal topluluk kullanımı sağlar. Değişiklikleri toplumda bireysel deneyler microenvironmental şartları bağlamında bir sonucu olabilir. Böylece, bu modelin mikrobiyal bileşeni kolayca yukarı veya aşağı seçici bir güç olarak çevre etkisini deconstructing için ölçeklenebilir. Son olarak, örnekleme erişilebilirlik daha fazla insan hücreleri ve ilişkili mikrobiyal toplumun işlevsel faaliyetlerinin karakterizasyonu garanti eder.
Geçmiş yıllarda organoid teknolojisine dayalı yeni vitro modeller geliştirilmiştir. Organoids bazı temel özellikleri temsil birincil doku dahil 3D hücre kültürleri vardır. Bağırsak organoids yetişkin kök hücre ve dokulara çalışmak için yakın-fizyolojik bir sistem olmakla birlikte, böyle model ayrıca bazı sınırlamalar vardır. Bağırsak organoids sınırlı kullanımı bağışıklık hücreleri bulunmadığından enfeksiyon ya da uyuşturucu, inflamatuar yanıt benzeyen içinde. Ayrıca, canlılığı, boyutu ve şekli, fenotip tarama ve standardizasyon karmaşık işleme engelleyen ile ilgili türdeş olmayan organoids. Vitro sağlıklı dokuların modelleme ölümsüzleştirdi hücre hatları sınırlama rağmen iyi karakterize ve istikrarlı hücre hatları kullanımı da tekrarlanabilirlik, tekrarlanabilirlik ve düşük maliyet avantajı vardır. Bu faydaları bazı koşulların eşzamanlı tarama için izin, ancak veri translasyonel kullanımı tartışmalıdır. Primer Hücre içinde vivo fizyolojisi daha fazla temsilcisi olabilir; Ancak, onlar yüksek arası bireysel farklılıklarına sahip, değil tamamen karakterizedir, heterojen ve sınırlı bir zaman dilimi. Bu faktörler de dahil olmak üzere birden çok koşul için bir dezavantaj ya da bir tahlil çoğaltır.
Hücre satırları karmaşık mikrobiyal topluluklar ile birleştiren bir meydan okuma temsil edebilir gibi biz bir tekrarlanabilir ve tekrarlanabilir model yüksek esneklik ve temel hücre ekipmanlı, laboratuarlarında uygulanabilirliği ile daha fazla temsilcisi kadar geliştirilmesi üzerinde duruldu modelleri kullanılabilir ve de karakterize oldu. Örneğin, üst gastrointestinal sistem probiyotik davranışları değerlendirmek ve gut arabirimde karakterize xenobiotic etkisi multicompartment bu modelleri kullanarak çeşitli bakteri toplulukları işlevselliğini değerlendirilir varsa. Böylece, çok çeşitli probiyotikler, uyuşturucu veya gıda bileşenleri, alakalı ve tanımlanmış vitro ekosistem içinde ile daha fazla deneyleri için bir üs olarak bu model önerdiğimiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa yoktur
Acknowledgments
Yazarlar minnetle Flanders Araştırma Vakfı mali desteği Marta Calatayud Arroyo (iki doktora sonrası bursu-12N2815N) için kabul. Emma Hernandez-Sanabria Flanders yenilik ve Girişimcilik (Agentschap voor Innovatie kapı Wetenschap tr Technologie, IWT) tarafından desteklenen bir doktora sonrası adam var.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | - | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | - | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533 (2016).
- Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
- Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
- Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
- Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
- Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133 (2014).
- Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
- Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235 (2017).
- Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
- Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340 (2018).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
- Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
- Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
- Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
- Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
- Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
- Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307 (2015).
- Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
- Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
- Kleiveland, C. R., et al. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Springer International Publishing. 197-205 (2015).
- Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
- Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
- Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).
