Summary
Мы представляем автоматизированный метод для трехмерной реконструкции Caenorhabditis elegans микрофлорой. Наш метод определяет количество и положение каждого ядра в микрофлорой и анализ распределения белка микрофлорой и цитоскелета структуру.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) микрофлорой используется для изучения нескольких биологически важные процессы, включая динамики развития, апоптоз и хромосомы стволовых клеток. В то время как микрофлорой является прекрасной моделью, анализ часто является двух измерениях благодаря времени и труда, необходимых для трехмерного анализа. Основные надписи в такие исследования являются положение/число ядер и белка распределения в рамках микрофлорой. Здесь мы представляем метод для выполнения автоматизированного анализа микрофлорой, используя confocal микроскопии и вычислительных подходов для определения количество и положение ядер в каждом регионе микрофлорой. Наш метод также анализирует распределение белка микрофлорой, который позволяет трехмерной изучение экспрессии белков в различных генетических стола. Кроме того наше исследование показывает вариации в цитоскелета архитектуры в отдельных регионах микрофлорой, который может вместить требованиями пространственного развития. Наконец наш метод позволяет автоматического подсчета спермы в сперматека каждого микрофлорой. Взятые вместе, наш метод позволяет быстрое и воспроизводимые фенотипические анализ C. elegans микрофлорой.
Introduction
Сохранению сигнальные пути с mammals делает C. elegans отличную модель для изучения нескольких биологических процессов1,2. В нашей лаборатории мы используем микрофлорой C. elegans для изучения развития стволовых клеток, апоптоз и экспрессии генов. В то время как микрофлорой трехмерную структуру, многие исследования являются двумя размерные связи с длительным и трудоемким характером трехмерного анализа. Это весьма вероятно, что двумерный анализ может искажать в vivo события в микрофлорой. Взрослый гермафродита C. elegans имеет две руки микрофлорой, каждая из которых дома соматических дистального наконечника клеток (DTC), которая поддерживает дистальной клетки семенозачатка в недифференцированных государства3,4. Эти клетки семенозачатка начинают различать как они движутся от MS DTC, избежать его влияния и стать яйцеклеток и сперматозоидов, как они достигают проксимальный конец микрофлорой. В ходе этого процесса ядра зародышевых клеток проходят митоз, перед переходом к мейоз5,6. Производство спермы дополняется личиночной стадии 4 (L4) разработки, после чего ооциты производятся во взрослом возрасте. Сперматозоиды хранятся в сперматека, где они оплодотворить яйцеклетки для создания эмбрионов.
Существует несколько генетических и экологических факторов, которые могут влиять на развитие микрофлорой в C. elegans повлекло изменения в количество ядер, количество apoptotic события, хромосома динамики и выражение протеина или локализации7 ,8,9,10,11. Анализ этих событий требует идентификации каждого этапа дифференциация, основанная на ядерное Словотолкование и распределения. Чтобы точно анализировать эти параметры вручную с большой выборки является трудоемким и длительным. Чтобы обойти эти недостатки и включить последовательность анализа, мы разработали автоматизированный метод для трехмерных экспертизы микрофлорой C. elegans для подсчета ядер, распределение ядер, выражение протеина и цитоскелета структура. Объединив конфокальная микроскопия с трехмерной визуализации, мы создали параметры размера и формы для идентификации каждой стадии дифференцировки клеток зародыша. Кроме того этот метод позволяет подсчета ядра зародышевых клеток и спермы плюс озвучивание число хромосом в каждой ооцитов.
Один из важнейших структура в микрофлорой является цитоскелета, который обеспечивает стабильность микрофлорой отсека, СПИД цитоплазматических потокового и защиту микрофлорой ядер12. Использование компьютерной визуализации, мы выступали трехмерной реконструкции цитоскелета микрофлорой и выявленных особенностей цитоскелета внутри микрофлорой. Здесь мы опишем пошаговое протокол для иллюстрации как Вычислительный анализ в сочетании с конфокальный изображений включает всесторонний анализ C. elegans микрофлорой.
Мы предлагаем быстрый метод для трехмерного анализа C. elegans микрофлорой (рис. 1). Использование трехмерного анализа, это возможно для изучения трехмерной распределение ядер микрофлорой (рис. 2 и рис. 3), автоматизированные подсчет клеток (рис. 2), реконструкция микрофлорой цитоскелета ( Рисунок 3), распределение белков (рис. 4) и забил количество спермы в сперматека и хромосом яйцеклетки (рис. 5). Метод не только позволяет легко и точная количественная оценка микрофлорой, но идентифицирует физиологически соответствующих фенотипов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка и червь животноводства
Примечание: Приведена Таблица материалов для сведения о продукте.
- ОР50 Escherichia coli Культура: культура бактерий ОР50 в бульоне (LB) (1% Триптон, 0,5% дрожжей, 0,5% NaCl, рН 7,0) Lysogeny на ночь при 37 ° C без антибиотиков.
- Семя 400 мкл ОР50 бактерий к нематоде роста СМИ (НГМ) пластины (1,5 г NaCl, 8,5 г агара, 1,25 г Пептон, 1 мл 1 М CaCl2, 1 мл 5 мг/мл холестерина в этаноле, 1 мл 1 М MgSO4 и 25 мл 1 М КПО4 буфера) и высушите на воздухе бактерии в течение 48 часов.
- Выберите червей в сеяный NGM пластины и Инкубируйте на 15 ° С или 20 ° C.
- Для анализа взрослых Гермафродит микрофлорой выбрать сытых L4 червей на бактериальных газон и инкубировать на ночь при 20 ° C.
- Для озвучивания число сперматозоидов в гермафродитки, Инкубируйте L4 червей при 20 ° C в течение 12 ч до линьки L4/взрослых червей. Для синхронизации червей на сцену L4, готовить яйца, выбирая взрослых червей с большим количеством яиц в раствор отбеливателя (1 M NaOH и отбеливатель в соотношении 1:1). Разрешить яйца люк и выбрать L4 животных для эксперимента.
- Подготовьте тефлон Микроскоп слайды, поместив 25 мкл раствора поли L-лизин на слайде и распространяя решение, с помощью кончика пипетки. После удаления избыточных поли L-лизин с бумажным полотенцем, позволяют слайды в воздух сухой и инкубировать слайды при температуре 65 ° C для 15-20 мин.
2. микрофлорой диссекции и окрашивание6,13
- Spot 10 мкл 0,01% Тэтрамизол (обезболивающий) на coverslip 22 × 22 мм и выбрать один - день-старый взрослых червей в нее.
- Вскрыть червя на хвост, как он становится седативные, с помощью шприца (5 мл) и иглы (24 "x 1") и убедитесь, что микрофлорой не поврежден.
Примечание: Анатомирование должна осуществляться до того, как червь становится полностью парализована, так что отрицательное давление в червь и червь движение помощи отстрела микрофлорой. Для озвучивания спермы, должны приниматься меры предосторожности чтобы не повредить сперматека иглой во время вскрытия. Не прикасайтесь микрофлорой с иглой, за исключением точки рассечение после сперматека. Если разбить в отсеке микрофлорой или наблюдается каких-либо выделений из микрофлорой, микрофлорой не должны использоваться для анализа. - Перевернутый coverslip место на слайде с покрытием поли L-лизин, сохраняя расчлененных микрофлорой на слайде.
- Удалите лишнюю жидкость под coverslip, поместив бумага башня на углу coverslip, а затем место слайда в жидком азоте, за 1 мин быстро удалить coverslip, с помощью иглы с germlines на слайде.
- Перенести слайды в метанол-20 ° C за 30-60 s в камере, а затем Инкубируйте 30 мин в свежеприготовленные Фиксирующий раствор (1 x фосфатного буфера физиологический (PBS) содержащий 0,08 М HEPES рН 6,9, 1,6 мм MgSO4, этиленгликоля 0,8 мм-bis(beta-aminoethyl эфир)-N, N, N', N'-tetraacetic кислота (EGTA) и 3,7% параформальдегида) при комнатной температуре.
- Вымойте слайды, поместив в камере, содержащей ПБС, рН 7,4 с 0,1% Tween-20 за 10 мин повторить этот шаг один раз.
- Блок germlines с 30 мкл преграждая разрешение (30% козьего сыворотки, подготовленного добавления 900 мкл козьего сыворотки в 1700 мкл дистиллированной H2O и 300 мкл 10 x PBS) в камере влажный, подготовленный размещения влажной салфеткой в пластиковой коробке при комнатной температуре за 30 мин.
- Добавьте 50 мкл раствор антител REC-8, подготовленный в 30% козьего сыворотки в соотношении 1: 300 для каждого образца. Инкубируйте на ночь при 4° C.
- Вымойте слайды, поместив в камере, содержащей ПБС с 0.1% Tween-20 за 10 минут повторите шаг один раз и Удалите лишнюю жидкость, поместив бумажным полотенцем на углу слайда.
- Готовят раствор вторичные антитела путем разбавления конъюгированных вторичное антитело зеленый Флюорофор (длина волны излучения 488 нм) (1: 1000), Фаллоидин (актина пятно, 1: 4000) и DAPI (ДНК пятно, 1: 4000) в сыворотке нормальный коза 30%.
- Добавьте 50 мкл раствора вторичного антитела к слайду.
- Инкубируйте 1 час при комнатной температуре.
- Вымойте слайды дважды, поместив в камере, содержащей ПБС с 0.1% Tween-20 за 10 мин стереть избыток жидкости.
- 30 мкл фиксации реагента на слайд и место 12 мм2 x 1,5 мкм coverslip на вершине и сухой слайды при температуре 4 ° C на ночь.
3. конфокальная микроскопия
- Включите конфокального микроскопа, лазеры, резонансные сканера и программного обеспечения конфокального микроскопа. Поместите слайды с окрашенных germlines слайд держатель выше 63 X цель.
- Найдите микрофлорой, фокус на вершине микрофлорой и пометить его с помощью программного обеспечения конфокального микроскопа. Аналогичным образом сосредоточить внимание на нижней части микрофлорой и пометить его чтобы установить толщину всего микрофлорой.
- Изображение всей микрофлорой, определив толщину каждого фрагмента до 0,5 мкм. Марк полный микрофлорой и начать приобретение. Проверять каждый ломтик 8 раз и средние значения для улучшения качества изображения. Резонансный сканер позволит быстрого сканирования во избежание обесцвечивания во время визуализации. Если микроскоп имеет резонансный сканер, уменьшить количество сканов до четырех во избежание обесцвечивания.
4. пост изображений анализ ядер количество и распределение
Примечание: Обратитесь дополнительное рисунок 1 скриншоты программных инструментов и кнопок.
- Импорт изображения Imaris 8.4.1 или более поздних версий программного обеспечения.
- Определите митотическая, переходная зона, meiotic региона, регионом ооцитов и сперматека микрофлорой путем выявления Ядерное словотолкование в каждом регионе.
- Используйте кнопку поверхности функции (Дополнительные рис. 1A) программного обеспечения для выбора региона интерес.
- Отмените мастер автоматического создания поверхности и вручную рисовать области интереса в первый и последний фрагмент изображения из трехмерного стека.
- Нажмите кнопку создать поверхность.
Примечание: Программное обеспечение будет автоматически развивать стеки между первым и последним стека. - Все каналы за исключением DAPI маски, нажав кнопку канал маски (Дополнительный Рисунок 1B-C).
- Определите параметры ядерных размер, используя кнопку пятно функции (Дополнительные рис. 1A). Митотическая региона Определите диаметр XY 2 мкм оставляя Z диаметр неопределенные. Для переходной зоне определите XY 2 мкм и Z диаметром 1,5 мкм. (дополнительная цифра 1 d).
Примечание: Устранение диаметров согласно масштаб и характеристики микроскопа. Для текущего протокола цель используется был 63 X и предоставляет дополнительную 1,70 кратном во время визуализации. Если цель изменения, например 40 X, диаметры следует изменить соответственно. Устранение неполадок следует выполнять с wildtype germlines установить правильные параметры. Митотическая регион руку микрофлорой дикого типа имеет около 250 ядер. Диаметр должен быть изменен для достижения этого значения. Используйте по крайней мере 15 germlines чтобы определить оптимальное значение для диаметра. Аналогичный подход должен использоваться для калибровки переходной зоны (150-170 ядер) и meiotic региона (600-700 ядер). - Ограничьте обнаружения пятен, определив минимальный порог (дополнительная цифра 1E). Использование DAPI витражи дикого типа germlines для установления минимального порога, увеличив минимальный трехмерного рендеринга порог до тех пор, пока первый пятно появляется за пределами микрофлорой.
- Сохраните изображение и получить количество ядер из таблицы автоматически генерируемых программного обеспечения. Экспорт изображения как TIF файлов.
5. размещать изображения анализ для озвучивания спермы и число хромосом
- Выполните трехмерные визуализации, выбрав сперматека как области интереса. Чтобы обнаружить каждый спермы, определить диаметр пятна между 0,75 - 1,0 мкм для X и Y-оси, в то время как Z диаметр остается неопределенным. Используйте кнопку функции пятна, как показано на рисунке 1 дополнительный.
- Вычитание фона путем тикать фон вычесть коробке и с использованием фоновых значений коррекции рассчитывается путем программного обеспечения (дополнительная цифра 1 d).
Примечание: Imaris программного обеспечения сначала выбирает высокой интенсивности точек, поэтому эффект фон минимально, пока существует значительная разница между области интереса и фон. Второй метод — вручную определить коррекция фона, где соответствующие значения могут быть предоставлены для фона. Ручной фоновая поправка будет целесообразно, если интенсивность независимых выборок сравнения. - Отрегулируйте порог трехмерного рендеринга для выявления всех DAPI окрашенных спермы в сперматека (дополнительная цифра 1E).
- Для подсчета хромосомы, определить диаметр пятна < 0,75 мкм для X и Y-оси до разработки трехмерных моделей.
- Сохраните изображение и экспортировать в формате TIF.
6. пост изображений анализ цитоскелета реконструкции микрофлорой
- Определить области интереса в микрофлорой и маскировать все каналы за исключением Фаллоидин, нажав кнопку Скрыть каналы .
- Определите детали поверхности 0,25 мкм, используя кнопку поверхности функции (Дополнительные рис. 1).
Примечание: Это означает, что каждый 0,25 мкм будет оказываться в трехмерных моделей. Детали поверхности может быть постоянными для любого региона микрофлорой, где модель трехмерной поверхности будет создаваться для каждого 0,25 мкм. Однако, для региона ооцитов, детали поверхности может быть увеличена до 0,35 - 0,5 мкм из-за наличия четко определенных актина волокон в этом регионе. - Вычитание фона путем тикать фон вычесть коробке и с использованием фоновых значений коррекции рассчитывается путем программного обеспечения (дополнительная цифра 1 d).
- Настройка порога трехмерной визуализации в зависимости от структуры, требующих анализа (дополнительная цифра 1E).
- Сохранить развитых трехмерное изображение и экспортировать в формате TIF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 показывает время, необходимое для анализа трехмерных микрофлорой. Гермафродитки L4, инкубировали при 20 ° C были расчленены изолировать germlines и витражи с DAPI, Фаллоидин и антитела против белков микрофлорой. Germlines отражаются с помощью конфокальной микроскопии. Окрашивание и конфокальная микроскопия требует около 24 ч. Вычислительный анализ для полного микрофлорой требует 10-15 мин рассчитывать количество и положение ядер, определить распределение белка, анализировать структуру цитоскелета и оценка количество сперматозоидов. Полный ручной анализ требует более 2 ч на микрофлорой и подвержен влиянию оператор, и поэтому наш автоматизированный метод высок объём уменьшит время анализа и увеличивает воспроизводимость.
Автоматизированная ядер, забив показывает, что рука микрофлорой дома около 1000-1200 ядер (рис. 2C), хорошо соответствует ранее опубликованные руководства, озвучивание данных1. Чтобы подтвердить, что точность скоринга, несколько мутантов и различных условий используется (Рисунок 2-D-G). Например мы сравнили, rnp-8(tm435), cpb-3(bt17)и glp-1(e2141) мутант червей типа диких животных. Автоматизированный подсчет воспроизведены известных сокращение числа ядер в КПБ-3 и glp-1 мутантов germlines14,,1516,17. Резкое сокращение числа ядер наблюдалось также в мутанта чувствительных к температуре glp-1(e2141) когда инкубировали при 25 ° C. Распределение ядер зависит от стадии дифференцировки. Митотическая региона, который содержит приблизительно 250 ядер в дикого типа, плотно упакованные с ядрами, по сравнению с остальной частью микрофлорой (рис. 3)1. Расстояние между митотическая ядер является минимальным и ядра расположены во всем регионе митотическая. Однако как ядра отойти от дистального конца, они появляются в большей окружности микрофлорой (рис. 3). Изменения в распределении начинается в переходной зоне и завершает как ядра введите мейоз/pachytene.
Микрофлорой имеет конкретные цитоскелета структур на различных стадиях дифференцировки. Мы визуализированное пятнать микрофлорой с Фаллоидин F-миозина. Распределения F-актина от дистальной проксимальный конец микрофлорой отличается в каждом регионе (рис. 3 и рис. 5). В общем есть две отдельные структуры, которые появляются как «цилиндр внутри цилиндра». В регионе митотическая внутренняя актина появляется как твердая масса с определенной формы (рис. 3). Как микрофлорой достигает переходной зоны, внутренний актина предполагает более цилиндрические структуры и он становится полый цилиндр, как он достигает конца pachytene. Второй слой актина охватывает внутренний слой, придав форму микрофлорой. Эта структура актина «цилиндр внутри цилиндра» исчезает к регионе ооцитов (рис. 5). В регионе ооцитов актина появляется как толстые волокна. Ооциты разделяются актина позвоночный столб, хотя она, как представляется, быть динамичным, чтобы разрешить движение яйцеклетки к сперматека. Наконец актина в сперматека также формирует толстые пучки волокон актина. Однако, волокна, как представляется, быть упакованы ближе, чем в регионе ооцитов. Цитоскелета структура, как представляется, дополнить моделей распределения ядер (рис. 3). В регионе митотическая ядер, как представляется, быть размещены вокруг внутренней актина структуры. Как они достигают мейоз/pachytene, ядер организовать между двумя цилиндрами актина, оставляя в середине микрофлорой главным образом лишенные ядер (рис. 3). Это вероятно может помочь непрерывный цитоплазматического потоковое в микрофлорой. Germlines были окрашенных с антитела против белков REC-8 и проанализированы confocal микроскопии. REC-8 равномерно распределены вокруг ранних ядер микрофлорой и позднее расщепляется и деградации во время мейоза18. REC-8 распределение в трехмерной межсекторальный анализ микрофлорой показывает распределение белка в регионе митотическая (рис. 4).
Трёхмерный рендеринг проксимального конца микрофлорой включает сперматека и первых трех яйцеклеток дистальнее сперматека. Наш анализ признали в среднем 151 спермы в каждом сперматека (n = 18). Это соответствует опубликованной литературе, указывающее надежность метода (Рисунок 5F)19. Этот анализ может производиться вместе с цитоскелета или исследования белков. Геном C. elegans распределяется среди шести хромосом. В полностью развитых дикого типа ооцитов Эти хромосомы являются видимыми и могут быть подсчитаны. Это разделение хромосома может использоваться для изучения стабильности хромосом или другие дефекты, связанные с развитием яйцеклетки. Трёхмерный рендеринг, количество хромосом могут быть визуализированы, и если хромосомы разделены должным образом, числа можно точно получить (рис. 5).
Рисунок 1 . Временная шкала для автоматизированного анализа. Сравнение времени между ручной и Вычислительный анализ C. elegans микрофлорой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Распределение ядер в микрофлорой. (A) DAPI витражи микрофлорой, показаны митотическая, переход и pachytene/meiotic регионов. (B) вычислительные трехмерную модель микрофлорой. (C) очков за общее количество ядер в дикого типа germlines. (D-F) Забив за количество ядер в митотическая, переход и meiotic регионах дикого типа, rnp-8, КПБ-3и glp-1 мутантов germlines. (G) сравнение в общее количество ядер в мутанта glp-1 при 20 ° C и 25 ° C. Ошибка бар представляет собой стандартную ошибку. Критерия Стьюдента. n < 0,0001, ***n < 0,001, **n < 0.01, *n < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Цитоскелета структура микрофлорой. (A-B) Организация внутренней актина (красный) цитоскелета микрофлорой в регионе митотическая. Внутренний актина имеет диффузный структуру по сравнению с внешней актина в регионе митотическая. (C-D) В регионе pachytene цитоскелета предполагает цилиндрические структуры, образуя два цилиндра, между которыми организуются ядер (синий). (E-F) Организация микрофлорой ядер в регионах митотическая и pachytene. Распределение ядер большей окружности «germtube» в регионе pachytene, по сравнению с митотическая региона (зеленый) и среднего микрофлорой стал лишенные ядер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . REC-8 выражение в регионе митотическая. (A) Микрофотография показаны дистального конца REC-8-окрашенных микрофлорой. (B-C) Трёхмерный рендеринг REC-8 окрашивание (показаны синим цветом) и распределение белка между митотическая ядер (зеленый). REC-8 пятнать менее обильные проксимальнее митотическая региона (отмечен белых точек, представляющих ядер). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Микрофлорой структура в проксимальном конце. (A) DAPI окрашивание микрофлорой в проксимальном конце. (B) трехмерной визуализации DAPI окрашивание показаны спермы в сперматека (желтый) и хромосом в ооцитов (белый). (C-E) Трехмерная структура цитоскелета в проксимальном конце микрофлорой. Красный знаменует собой полный проксимальный конец и зеленые знаки сперматека. Крест секционные анализ показывает, что цитоскелета не только формирует нитевидные структуры актина вокруг яйцеклеток, но также отделяет между ооцитов. (F) график, показывающий количество спермы в каждом сперматека и среднем, полученные из нескольких сперматека (n = 18). Ошибка бар представляет собой стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные рисунок 1 . Программное обеспечение инструменты Описание. (A) пятна и поверхности инструменты для обнаружения ядер и пятнать протеина. (B-C) Выбор трехмерной области интереса, используя средство поверхности. (D) определение XY-диаметр, с помощью инструмента пятна, для обнаружения ядер. В зависимости от региона интерес и окрашивания диаметр и фон коррекция оси z может быть использован. (E) минимальная и максимальная интенсивность порог обнаружения. Аналогичный подход может использоваться для поверхности функции где вместо определения диаметра, и поверхности детали могут быть определены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цель настоящего Протокола заключается в улучшить точность и сократить время, необходимое для анализа микрофлорой. После стандартной подготовки расчлененных germlines трехмерную модель микрофлорой ядер подготовленный компьютерной визуализации. Позволяя наблюдения пространственного распределения ядер микрофлорой, трехмерного рендеринга вычисляет количество ядер в конкретных регионах микрофлорой. Важнейшим аспектом нашего метода является точное определение размера и формы параметров ядра. Это зависит от ясности окрашивание и увеличение используется для изображения. Мы подтвердили точность метода, сравнивая опубликован вручную проанализированных данных1. Для дальнейшего подтверждения правильности нашего метода, мы использовали несколько мутантов в различных условиях и подтвердили результаты с опубликованной литературы. Она также подтвердила метода способность обнаруживать тонкие и сильные фенотипов - КПБ-3 и glp-1 мутантов, соответственно. Кроме того этот метод показывает адаптируемость к изменениям в ядрах размер и форму в пределах микрофлорой, или даже между штаммами. Это свойство также позволяет выявлять и озвучивание небольших структур в микрофлорой таких хромосом и спермы. Метод также позволяет дальнейшее устранение неполадок для размера и формы параметров, если требуется. Наш анализ был в состоянии пролить свет распределение ядер в микрофлорой и показали, что ядер в митотическая и pachytene регионах организуются в различных моделей. Применив трехмерные визуализации REC-8 и DAPI окрашивание, мы также показали распределения REC-8 в ядрах митотическая региона.
Трехмерного рендеринга актина окрашивания включен подробный анализ микрофлорой цитоскелета структур. Микрофлорой, как представляется, имеют два отдельных актина структуры, хотя они поддерживают физический контакт. В то время как реконструкция цитоскелета для всей микрофлорой возможен как единое целое, наилучшие результаты могут быть получены, если регионы интереса окажутся выбранными в митотическая, переход и meiotic регионов. Цитоскелет дистальной микрофлорой неопределенной формы и развивается в нитевидные структуры в проксимальном конце. Поэтому наши протокол позволяет трехмерной реконструкции Цитоскелет актина микрофлорой путем определения конкретных параметров для размещения различия в распределении актина. Наиболее важным аспектом анализа является определение параметров, таких как размер ядер и детали поверхности требование. Снижение размера ядра ниже фактического размера будет рисковать программное обеспечение, чтобы выбрать яркие пятна в пределах ядер как отдельные объекты. Аналогичным образом высокие поверхности детали значения приведет к потере точных трехмерных структур. Предложенный метод зависит от точности диссекции и качество окрашивания микрофлорой. Поврежденных микрофлорой может привести к версии ядра от микрофлорой, вызывая неточной нумерации. Высокий фон от окрашивания также вызовет неточной ядер игр и ненадлежащее трехмерного рендеринга.
Наш метод расширяет ранее известных автоматизированных методов анализа микрофлорой, где мы имеем возможность проанализировать количество ядер и распределения/выражение микрофлорой белков в пространстве с одного протокола20. Во-вторых наш метод позволяет, озвучивание небольших структур, таких как хромосом в пределах микрофлорой. Хромосома сегрегация является важным аспектом развития яйцеклетки21. С помощью нашего метода, можно определить количество и положение хромосом, где расстояние может определяться калибровочных против дикого типа ооцитов. Любое мутаций, затрагивающих разделения хромосомы могут быть изучены с помощью этого инструмента. Кроме того метод может распространяться для изучения хромосом в эмбрионы на стадии 2-клеток. Вычислительный анализ также предоставляет количество спермы в сперматека, количество хромосом яйцеклетки и микрофлорой цитоскелета структур. Взятые вместе, этот метод обеспечивает всесторонний анализ C. elegans микрофлорой, используя единый протокол значительно сокращая время анализа. Этот метод устраняет требование несколько инструментов для каждого анализа (число ядер, распределение белка и цитоскелета структура) и удаляет кодирования время, необходимое в любого конкретного программного обеспечения. Наконец этот метод может эффективно распространяться на другие червь исследования, включая трехмерные анализ седативных живут черви.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Monash Microimaging за их техническую поддержку. Некоторые штаммы были предоставлены центром генетики Caenorhabditis , который финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440). Эта работа была поддержана Монаш Университета биомедицины Discovery Стипендия, Грант проекта NHMRC (GNT1105374), NHMRC старший стипендий (GNT1137645) и Вески инноваций стипендий: 23 ВИФ-Роджер Покок.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
References
- Hubbard, E. J. Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology. Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).
- Kershner, A., et al. Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).
- Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (2), 88372 (2014).
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).
- Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crittenden, S. L., et al. A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans. Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).
- Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).
- Schumacher, B., et al. Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis. Cell. 120 (3), 357-368 (2005).
- McMullen, P. D., et al. Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress. PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).
- Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. Physiological control of germline development. Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).
- Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).
- Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development. Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).
- Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development. Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).
- Austin, J., Kimble, J. glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell. 51 (4), 589-599 (1987).
- Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors. Development. 124 (4), 925-936 (1997).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).
- Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
- Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).
- Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells. Development. 139 (5), 859-870 (2012).
- Laband, K., et al. Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes. Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).
