Summary
線虫生殖.の三次元再構成のための自動化手法を提案します。本手法は、数と生殖と生殖細胞蛋白質の分布の解析と細胞骨格構造内にある各核の位置を決定します。
Abstract
線虫(C. elegans) 生殖細胞、幹細胞の開発、アポトーシスと染色体のダイナミクスを含むいくつかの重要な生物学的プロセスの研究に使用されます。生殖細胞はエクセレント モデルが、解析は、しばしば 2 つの時間と労力を三次元解析による寸法です。このような研究の主要な読み出しは、核と生殖細胞内のタンパク質分布の位です。生殖細胞数と生殖細胞の各地域で核の位置を決定する共焦点顕微鏡と計算のアプローチを使用しての自動解析を実行する方法を紹介します。本手法は、また異なる遺伝背景の蛋白質の表現を立体的に調べることができる生殖細胞蛋白質の分布を分析します。さらに、我々 の研究は、特定の空間発達要件に対応することができる生殖の異なる領域で細胞骨格のアーキテクチャでバリエーションを示します。最後に、提案手法は、各生殖の交尾で精子の自動カウントできます。一緒に取られて、私たちのメソッドは、線虫の生殖の迅速かつ再現性のある表現型分析できます。
Introduction
シグナル伝達経路の哺乳類の保全は、複数の生物学的プロセス1,2を研究するエクセレント モデル線虫をなります。私たちの研究室では、線虫の生殖を使用して、遺伝子発現、アポトーシス、幹細胞の開発を研究します。生殖細胞は立体構造が、多くの研究は三次元解析の時間のかかり、労働集約的な性質のため二次元です。二次元解析が生殖細胞の生体内でイベントを偽ることがあります可能性が高いです。線虫 c. エレガンス大人の両性具有者がそれぞれの家は遠位生殖細胞未分化状態3,4を維持体の遠位先端細胞 (DTC)、2 つの生殖腕。これらの生殖細胞はその影響をエスケープ、DTC から離れるにつれて分化を開始して生殖細胞の近位端に達する彼らと卵子と精子になります。このプロセス中に胚細胞核は減数分裂5,6に移行する前に有糸分裂を経る。精子の生産はその後卵母細胞は成人で作成される開発の幼虫 4 (L4) によって完了です。精子は、卵子の胚を生成する肥やす交尾に格納されます。
線虫核の数, アポトーシス イベント、染色体ダイナミクスとタンパク質の発現や局在7 の番号変更を伴う生殖細胞の発生に影響を与えることができる複数の遺伝子と環境要因があります。 ,8,9,10,11。これらのイベントの分析には、核の形態と分布に基づく分化の各段階の身分証明書が必要です。大規模なサンプル サイズを手動でこれらのパラメーターを正確に分析するには、手間と時間がかかるです。カウント核、核の分布、蛋白質の表現、線虫の生殖の三次元検査のための自動方法を開発したこれらの欠点を回避するために、解析の整合性を有効にするには、細胞骨格と構造体です。三次元レンダリングと共焦点顕微鏡を用いて生殖細胞分化の各段階の身分証明書のサイズと形状パラメーターを生成されます。さらに、このメソッドは、生殖細胞の核と精子のカウントに加えて各卵母細胞における染色体数の得点できます。
生殖細胞の 1 つ重要な構造が細胞骨格、生殖細胞コンパートメント、エイズ細胞質ストリーミングと生殖核12保護に安定性を提供します。計算のレンダリングを使用すると、生殖細胞骨格の 3次元再構築を実施し、生殖細胞内の異なる細胞骨格機能を識別.ここでは、線虫の生殖の共焦点イメージングにより包括的な分析と組み合わせる方法計算の分析を説明するためにステップバイ ステップのプロトコルについて述べる。
急速な線虫の生殖 (図 1) の三次元解析法を提案します。三次元解析を使用して、セル (図 2) 生殖細胞系列の細胞骨格 (の再構築の自動化 (図 2および図 3) 生殖核の三次元分布カウントを研究することが可能です。図 3)、タンパク質 (図 4) や、交尾で精子と卵母細胞 (図 5) の染色体数を得点の分布。メソッドは、生殖細胞を簡単かつ正確な数量化できるだけでなく、生理学的に関連する表現型を識別します。
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Protocol
1. 準備とワームの飼育
注: すべての製品情報材料の表を参照してください。
- OP50大腸菌文化: 文化ホストゲノム スープ (LB) (1% トリプトン、0.5% 酵母、0.5% の塩化ナトリウム、pH 7.0) 37 ° C 抗生物質なしで一晩で OP50 細菌。
- OP50 細菌線虫成長メディア (NGM) 板 (1.5 g の塩化ナトリウム、寒天、ペプトン、1 M CaCl2エタノール、1 M MgSO4の 1 mL 中 5 mg/mL のコレステロールの 1 mL の 1 mL の 1.25 g の 8.5 g の 400 μ L をシードします。、と 25 mL の 1 M KPO4バッファー)、空気乾燥 48 時間の細菌。
- シード NGM プレート ワームをピックアップし、15 ° C、20 ° c. で孵化させなさい
- 大人の両性生殖細胞の分析、細菌の芝生に栄養の十分な L4 ワームをピックアップ、20 ° C で一晩インキュベート
- 両性具有で精子数をスコアリングのため、ワームが L4/大人脱皮まで 12 h 20 ° C で L4 ワームを孵化させなさい。L4 段階にワームを同期するには、漂白剤溶液 (1 M NaOH と 1:1 の比率で漂白剤) でたくさんの卵と成虫を選ぶことによって卵を準備します。卵を孵化・ L4 動物実験のための選択を許可します。
- テフロン顕微鏡スライドを準備するには、スライドにポリ L リジン溶液の 25 μ L を配置し、ピペット チップを使用して、ソリューションを拡散します。ペーパー タオルで余分なポリ L リジンを除去した後、自然乾燥し、15 〜 20 分の 65 ° C でスライドをインキュベートするスライドを許可します。
2. 生殖解剖と染色6,13
- 22 × 22 mm coverslip の 0.01 %tetramisole (麻酔) の 10 μ L を発見し、それに 1 日の古い大人のワームをピックアップします。
- (5 mL) 注射器や針 (24"× 1") を使用してそれが鎮静になるように末尾にワームを解剖し、生殖細胞が破損していないことを確認します。
注: 解剖遂行されなければならない前にワームが完全に麻痺するワームとワームの動きに否定的な圧力援助生殖細胞の放出するようです。精子をスコアリングのため注意が必要、交尾を害することのない針で解剖時に。解離ポイント以外の針で、交尾後、生殖を触れないでください。生殖細胞のコンパートメントに分割がある場合、生殖細胞から任意放電が観察される、生殖細胞は分析のため使用しないでください。 - 場所ポリ L リジン コーティング スライドの反転 coverslip スライドに切り裂かれた生殖細胞を維持します。
- 1 分はすぐに針を用いたスライドの germlines coverslip を削除するため、液体窒素で観察して配置、スライドの隅にペーパー タワーを置くことによって、coverslip の下で余分な液体を削除します。
- -20 ° C のメタノール、商工会議所で 30-60 秒のためにスライドを転送し、作りたての定着液 (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 含む 0.08 M HEPES pH 6.9、1.6 mM MgSO4、0.8 mM エチレング リコール bis(beta-aminoethyl × 1 で 30 分間インキュベートエーテル)-N, N, N', N'-四酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸)、および 3.7% パラホルムアルデヒド) 室温で。
- 1x PBS、pH 7.4 を含む商工会議所で配置することによって、スライドを洗う 0.1 %10 分トゥイーン 20 手順を繰り返しますこの一度。
- 解決を妨げるの 30 μ L で germlines をブロック (ヤギ血清の 1700 μ L でヤギ血清の 900 μ L を追加することによって準備の 30% 蒸留 H2O および 10 x PBS の 300 μ L) 30 分間室温でプラスチックの箱で湿らせたペーパー タオルを使用して湿気のある商工会議所で。
- 各サンプルに 1: 300 比で 30% ヤギ血清で REC 8 抗体溶液の 50 μ L を追加します。4 ° C で一晩インキュベートします。
- スライドを洗う 1x PBS で 0.1% を含む商工会議所に配置 10 分トゥイーン 20 手順を一度し、スライドの隅にペーパー タオルを置くことで余分な液体を削除します。
- 緑蛍光 (発光波長 488 nm) 共役二次抗体 (1: 1000)、ファロイジンをアクチン染色 (1:4000)、および DAPI (DNA 染色、1:4000) を 30% ヤギ血清の希釈、二次抗体溶液を準備します。
- 二次抗体溶液 50 μ L をスライドに追加します。
- 室温で 1 時間インキュベートします。
- スライドを洗う 1x PBS で 0.1% を含む商工会議所に置くことによって 2 回 10 分のトゥイーン 20 余分な液体を拭き取る。
- スライドに試薬を固定の 30 μ L を追加し、上 1.5 μ m coverslip x 12 mm2の場所 4 ° C でスライドを一晩乾燥します。
3. 共焦点顕微鏡
- 共焦点顕微鏡、レーザー、共振型スキャナーと共焦点顕微鏡のソフトウェアを入れます。63 X 目的上スライド ホルダーにステンド グラス germlines とスライドを配置します。
- 生殖細胞、生殖細胞の上にフォーカスを検索し、共焦点顕微鏡のソフトウェアを使用してそれをマークします。同様に生殖細胞の下部に焦点を当てるし、合計生殖厚さを確立するマークします。
- 0.5 μ m. マーク完全な生殖と開始取得まで各スライスの厚さを定義することによって全体の生殖のイメージ。8 回各スライスをスキャンし、画像の品質を改善するために値を平均します。共振型スキャナーは、画像中に漂白を避けるために高速スキャンが許可されます。顕微鏡に共振型スキャナーがあるない場合は、漂白を避けるために 4 つのスキャンの数を減らします。
4 核の画像解析のポスト数と分布
注: は、ソフトウェア ツールと使用するボタンのスクリーン ショットのための補足図 1を参照してください。
- 8.4.1 Imaris またはそれ以降のバージョンのソフトウェアに画像をインポートします。
- 各地域の核形態を識別することによって分裂地域、移行ゾーン、減数分裂地域、卵母細胞領域、および生殖細胞の交尾を定義します。
- ソフトウェアの表面機能ボタン (補足図 1 a) を使用すると、関心領域を選択します。
- 自動サーフェス作成ウィザードをキャンセルし、三次元のスタックからのイメージの最初と最後のスライスの関心領域を手動で描画します。
- 作成するサーフェスをクリックします。
注: ソフトウェアは自動的に最初と最後のスタックとスタックを開発します。 - DAPI を除くすべてのチャンネルをマスクマスク チャンネルボタン (補足図 1 b ・ C) をクリックします。
- スポット機能ボタン (補足図 1 a) を使用して核の大きさのパラメーターを定義します。分裂の地域未定義 Z 直径はそのまま XY 直径 2 μ m を定義します。移行ゾーンの (補足図 1) は、1.5 μ m として XY 直径 2 μ m と Z の直径を定義します。
注: は、倍率と顕微鏡の仕様によると直径をトラブルシューティングします。現在のプロトコル使用目的だった 63 X、余分なイメージング中に 1.70 倍の倍率です。目的変更、例えば 40 X、直径はそれに応じて変更する必要があります。正しいパラメーターを確立する野生型 germlines で、トラブルシューティングを実行する必要があります。野生型生殖腕の分裂の地域は、約 250 の核を持っています。直径は、この値を達成するために変更する必要があります。直径の最適な値を決定するために少なくとも 15 germlines を使用します。同様のアプローチは遷移帯 (150-170 核) と減数分裂地域 (600-700 核) を調整するために使わなければなりません。 - 最小しきい値 (補足図 1E) を定義することにより、スポットの検出を制限します。使用 DAPI 染色生殖細胞外表示されます最初のスポットまで、立体造形最小しきい値を増やすことにより最小しきい値を確立する野生型 germlines です。
- 画像を保存し、ソフトウェアによって自動的に生成されたテーブルから核の数を取得します。TIF ファイルとしてイメージをエクスポートします。
5. 投稿精子と染色体数をスコアリングのための画像解析
- 三次元レンダリングを実行するには、関心領域として、交尾を選択します。各精子を検出、0.75 - 間のスポット径を定義する x 1.0 μ m、Y 軸、Z 直径は未定義のまま。補足図 1に示すように、スポット機能ボタンを使用します。
- 背景を刻 々 と過ぎで背景を引くボックスやソフトウェア (補足図 1) によって計算されたバック グラウンド補正値を使用して減算を行います。
注: Imaris ソフトウェアおすすめ高強度ポイントまず、関心の領域と背景の間に有意差がある限り、従って背景の影響も最小です。2 番目のメソッドは、バック グラウンドの値を必要に応じてそのバック グラウンド補正を手動で定義するを与えることができます。手動によるバック グラウンド補正は独立した試料の強度の比較が必要な場合は適切ななります。 - 交尾 (補足図 1E) ですべての DAPI 染色精子を検出する三次元レンダリングしきい値を調整します。
- 染色体を数える、スポット径を定義 < x 0.75 μ m と三次元モデルを開発する前に Y 軸。
- 画像を保存し、TIF ファイルとしてエクスポートします。
6 ポスト生殖細胞の細胞骨格の再構成のための画像解析
- 生殖細胞への関心の領域を識別してマスクのチャンネルボタンを押してファロイジンを除くすべてのチャンネルをマスクします。
- 0.25 μ m の表面の詳細を定義するには、表面機能ボタン (補足図 1) を使用します。
注: つまり、三次元モデルにすべての 0.25 μ m になります。表面のディテールをすべての 0.25 μ m の 3次元形状モデルが作成されます生殖細胞の任意の領域の一定にすることができます。ただし、卵母細胞領域の表面のディテールを延長できます 0.35 - この地域で明確に定義されたアクチン繊維の存在により 0.5 μ m。 - 背景を刻 々 と過ぎで背景を引くボックスやソフトウェア (補足図 1) によって計算されたバック グラウンド補正値を使用して減算を行います。
- 立体構造解析 (補足図 1E) を必要に応じてしきい値を調整します。
- 先進の 3次元画像を保存し、TIF ファイルとしてエクスポートします。
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Representative Results
図 1は、生殖細胞の三次元分析に必要な時間を示します。20 ° C で培養した L4 両性具有は、germlines を分離するために解剖、DAPI、ファロイジン、および生殖細胞のタンパク質に対する抗体で染色しました。共焦点顕微鏡を用いた Germlines が作成されます。完全な生殖核の位置と数をカウント、特定蛋白質の分布、細胞骨格構造やスコア分析に 10-15 分を必要とする、染色と共焦点顕微鏡は約 24 時間解析を必要とする、精子の数です。完全な手動解析生殖細胞あたり 2 時間以上を必要とする演算子の影響を受けるは、したがって、私たち自動化されたハイスループット法分析時間を短縮し、再現性を高めます。
得点生殖腕住宅約 1,000-1,200 核 (図 2C) 以前に公開されたマニュアル得点データ1とよく対応することを明らかに核を自動化しました。採点の精度、複数の変異体と異なる条件を確認するには、(図 2D G) を使用しました。例えばrnp-8(tm435)、cpb-3(bt17)、および野生型動物glp-1(e2141)突然変異体ワームを比較しました。消保院 3とglp-1突然変異体 germlines14,15,16,17の核数の知られている削減を再現自動カウントします。25 ° C で培養したときglp-1(e2141)温度感受性変異体の核数の深刻な減少が認められました。核の分布は分化の段階に依存します。野生型の約 250 核を含む細胞分裂の地域は、密集生殖細胞 (図 3)1の残りの部分に比べて核です。分裂核間の間隔は最小限で、核が分裂の地域全体であります。ただし、核は、遠位端から移動、表示されます (図 3) 生殖細胞の外周に向かってより。分布の変化は、遷移領域で開始し、核が減数分裂/pachytene を入力を完了します。
生殖細胞は、分化の各段階で特定の骨格構造を持っています。ファロイジンと生殖の汚損によって F-アクチンを可視化。(図 3および図 5) 各地域では、生殖細胞の近位端に遠位から F-アクチンの分布が目立っています。一般に、'シリンダー内筒' として表示される 2 つの独立した構造体があります。分裂の地域で内側アクチンは、(図 3) 特定の形をした固形の塊として表示されます。生殖細胞では、遷移層に達すると、内部に存在するアクチンより円筒状の構造物を想定しています、後半 pachytene に達すると円筒になります。アクチンの 2 番目の層は、生殖細胞をカタチに内側の層をカバーしています。この 'シリンダー シリンダー内のアクチンの構造体は、卵母細胞領域 (図 5) に向かって消失します。卵母細胞の領域では、アクチンは太い繊維として表示されます。卵母細胞は、それは、交尾して卵母細胞の動きを許可するように動的に表示されますが、アクチン梗で区切られます。最後に、アクチン、交尾はまたアクチン線維の太い束を形作る。ただし、繊維表示パック卵母細胞領域でより近い。細胞骨格の構造は、原子核 (図 3) の分布パターンを補完するために表示されます。分裂の地域核内アクチン構造の周りに表示されます。減数分裂/pachytene に届く、核核 (図 3) をほとんど欠いて生殖の真ん中を残して 2 つのアクチン シリンダー間整理します。これはおそらく生殖細胞細胞質ストリーミング連続支援でした。Germlines は、REC 8 蛋白質に対する抗体で染色され、共焦点顕微鏡による分析します。REC-8 は、生殖細胞の初期の核周辺に分布が均一と、切断し、減数分裂18の間に劣化は後で。生殖細胞の三次元断面解析で REC 8 分布は、分裂の地域 (図 4) で蛋白質の分布を示しています。
生殖細胞の近位端の立体造形、交尾には、交尾の遠位最初の 3 つの卵が含まれます。我々 の分析は各交尾で 151 精子の平均を認識 (n = 18)。これは方法 (図 5F)19の信頼性を示す公開資料に対応しています。細胞骨格と共にこの分析を行うことができるまたは蛋白質の分布の調査。線虫のゲノムは六つの染色体の間で配布されています。野生型の完全に発達した卵母細胞でこれらの染色体は表示され、カウントすることができます。この染色体の分離は、染色体の安定性や卵の開発に関連付けられているその他の欠陥を研究する使用できます。三次元レンダリングによって染色体の数を可視化することができますと染色体が正しくされている場合数正確に取得できます (図 5)。
図 1.自動解析のためのタイムライン。線虫の生殖のマニュアルおよび計算の分析の時間比較。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.生殖細胞の核分布。(A) DAPI 染色生殖細胞分裂を示す、遷移、および pachytene/減数分裂地域。(生殖細胞の三次元モデルを B) 計算。(C) 野生型 germlines の核数の合計の得点。(D-F)核の数のためのスコアリング分裂、遷移、および野生型rnp 8、cpb 3、およびglp 1の突然変異体 germlines の減数分裂の地域。(G) 合計 20 の ° C および 25 ° C でglp 1変異体の核数の比較エラーバーは標準エラーを表します。学生のテスト。n < 0.0001、* * *n < 0.001、* *n < 0.01 *n < 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.生殖細胞の細胞骨格の構造。(B)分裂の地域で生殖細胞の内側アクチン (赤) 骨格の組織。内部に存在するアクチンは、外側アクチン細胞分裂の地域と比較して拡散構造を持ちます。(C ・ D)Pachytene 地域で、骨格は (青) の核の組織間に 2 つのシリンダーを形成することにより円筒状の構造物を想定しています。(E ・ F)生殖核分裂および pachytene の地域の組織。核の分布は分裂地域 (緑) と比較して pachytene 地域で 'germtube' のまわり方と生殖細胞の中に核を欠いてなります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.分裂の地域で REC 8 式。(A) REC 8 ステンド生殖細胞の遠位端を示す顕微鏡像。(B ・ C)REC 8 染色 (青で示されている) と分裂核 (緑) の蛋白質の分布の三次元レンダリングします。少なく豊富、REC 8 染色 (核を表す白のドットでマークされて) 分裂の領域に近位。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.近位端での生殖構造。(A) DAPI は近位端に生殖細胞の染色。(B) 表示 (黄色) の交尾で精子と卵母細胞 (白) の染色体を汚す DAPI の立体。(C ・ E)生殖細胞の近位端に三次元骨格構造です。完全な近位端の赤いマーク、グリーン マーク、交尾します。横断的分析は、細胞骨格が卵母細胞、周りのアクチン フィラメントの構造を形成するだけでなくがも卵母細胞間の分離を示しています。(F) それぞれの交尾と複数交尾から得られた平均精子数を示すグラフ (n = 18)。エラーバーは標準エラーを表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1.ソフトウェア ツールの説明。(A) スポットと核と染色性を検出するためのサーフェス ツール。(B ・ C)サーフェス ツールを使用して興味の三次元領域の選択。(D) 核検出のためスポット ツールを使用して、XY 直径を定義します。関心と染色の地域によって z 軸径とバック グラウンドの補正が使用できます。(E) 最小値と最大輝度しきい値検出。直径を定義する代わりに、表面機能の同様のアプローチを使用できます、表面の詳細を定義できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルの目標は、精度を向上させる・生殖細胞の解析に必要な時間を短縮することです。切り裂かれた germlines の標準的な準備の後、生殖核の三次元モデルは計算のレンダリングによって準備されます。空間における生殖核分布の観測を可能にしながら、三次元レンダリングは生殖細胞の特定の領域での核の数を計算します。本手法の重要な側面は、原子核のサイズと形状パラメーターの正確な定義です。これは染色と使用倍率の明快さに依存をイメージ。手動で分析されたデータの1を公開する比較することによって法の精度を確認しました。さらに提案手法の精度を確認、異なる条件の下で複数の突然変異体を使用し、発表された文献で結果を確認します。それはまた微妙な表現型 - を検出するメソッドの機能を確認したcpb 3とglp 1の変異体は、それぞれ。さらに、このメソッドは、核の大きさや形生殖細胞内もしくは系統間の変化への適応を示しています。このプロパティには、同定と染色体や精子などの生殖細胞でより小さい構造の得点もできます。このメソッドは、サイズと形状パラメーターの他のトラブルシューティング、必要な場合をことができます。我々 の分析は生殖細胞の核の分布を明らかにすることができた、ことを示した原子核分裂、pachytene 地域は、さまざまなパターンに整理されます。三次元レンダリングを適用し、REC 8、DAPI 染色, 我々 はまた分裂地域の核内で REC 8 の分布を示した。
アクチン染色の立体には、生殖細胞骨格構造の詳細な検査が有効になります。生殖細胞は、彼らは物理的な接触を維持、2 つの独立したアクチン構造を持っている表示されます。全体の生殖細胞の細胞骨格の再構築は、単一のエンティティとして可能ですが、最良の結果分裂に関心領域があらかじめ選択されて場合に得ることが, 転移, および減数分裂の領域。遠位生殖細胞骨格、未定義の形をして近位端の糸状の構造に進化。我々 のプロトコル アクチンの分布の違いに対応する特定のパラメーターを定義することによって生殖細胞のアクチン細胞骨格の 3次元再構築を可能。 にします。分析の最も重要な側面は、核のサイズや表面の詳細要件などパラメーターの定義です。実際のサイズの下核サイズを下げる個別のオブジェクトとして核内に明るいスポットを選択するソフトウェアを危険にさらします。同様に、高い表面の詳細の値は、正確な三次元構造の損失に します。提案手法は、解離と生殖細胞の染色の品質の精度に依存します。破損した生殖細胞は生殖、不正確な番号を引き起こしてから核の解放をもたらすかもしれない。染色から高いバック グラウンドは、不正確な核数と不適切な三次元レンダリングにもなります。
私たちのメソッドは、我々 は核数と分布/20の単一のプロトコル領域生殖細胞蛋白質の発現を分析することができるが生殖細胞分析の以前知られている自動化された方法を拡張します。第二に、この手法により, 生殖細胞内の染色体のようなより小さい構造の得点します。染色体は、卵母細胞開発21の重要な側面です。私たちのメソッドを使用して、番号と野生型の卵子に対して調整して距離を定義できます染色体の位置を検出することが可能です。染色体分離に影響を及ぼすすべての突然変異は、このツールを使用して学ぶことができます。また、2 細胞期で胚の染色体を勉強する方法を拡張できます。数値解析は、細胞骨格構造も交尾、卵母細胞と生殖細胞の染色体の数の精子の数を提供します。一緒に取られて、メソッドは、分析時間を大幅に短縮しながら 1 つのプロトコルを使用して線虫の生殖の包括的な分析を提供します。メソッドは、それぞれの分析 (核数、蛋白質の分布と細胞骨格構造) のための複数のツールの必要がある、任意の特定のソフトウェアに必要なコーディングの時間を削除します。最後に、このメソッドは、鎮静のライブ ワームの三次元分析を含む他のワームの研究を効果的に拡張できます。
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Disclosures
著者は利害の衝突を宣言しません。
Acknowledgments
彼らのテクニカル サポートありがとうモナッシュ マイクロ イメージング。いくつかの系統は、線虫の遺伝学センター研究インフラストラクチャ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。この作品は、モナッシュ大学生物医学発見交わり、NHMRC プロジェクト助成金 (GNT1105374)、NHMRC 上級研究員 (GNT1137645) と veski 社革新交わりによって支えられた: ロジャー ・ ポコックに VIF 23。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
References
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