Summary
Apresentamos um método automatizado para reconstrução tridimensional do germline Caenorhabditis elegans . Nosso método determina o número e a posição de cada núcleo dentro da linha germinativa e distribuição de proteína germline análises e estrutura do citoesqueleto.
Abstract
O germline Caenorhabditis elegans (c. elegans) é usada para estudar vários processos biologicamente importantes, incluindo a dinâmica de desenvolvimento, apoptose e cromossomo de células-tronco. Enquanto o germline é um excelente modelo, a análise é frequentemente duas dimensões devido ao tempo e o trabalho necessário para análise tridimensional. Grandes leituras em tais estudos são a posição/número de núcleos e distribuição da proteína dentro da linha germinativa. Aqui, apresentamos um método para executar a análise automatizada do germline usando microscopia confocal e abordagens computacionais para determinar o número e posição dos núcleos em cada região do germline. Nosso método também analisa a distribuição de proteína germline que permite o exame tridimensional da expressão da proteína em diferentes origens genéticas. Além disso, nosso estudo mostra variações na arquitetura do citoesqueleto em distintas regiões do germline que podem acomodar requisitos específicos de desenvolvimento espaciais. Finalmente, nosso método permite que a contagem automatizada do esperma na espermateca de cada linha germinativa. Tomados em conjunto, nosso método permite a análise fenotípica rápida e reprodutível do germline c. elegans .
Introduction
A conservação de sinalização com mamíferos vias faz c. elegans , um excelente modelo para o estudo de vários processos biológicos1,2. Em nosso laboratório, usamos o c. elegans germline para estudar o desenvolvimento de células-tronco, apoptose e expressão gênica. Enquanto o germline é uma estrutura tridimensional, muitos estudos são duas dimensões devido à natureza demorada e trabalhosa de análise tridimensional. É altamente provável que a análise bidimensional pode deturpar na vivo eventos no germline. O hermafrodita de adultos de c. elegans tem dois braços da linha germinal, cada um deles abriga uma célula somática ponta distal (DTC) que mantém distais células germinativas num estado indiferenciado3,4. Estas células germinativas começam a diferenciar como movem-se longe do DTC, escapar de sua influência e tornar-se oócitos e esperma como atingem a extremidade proximal da da linha germinal. Durante este processo, núcleos de células germinativas sofrem mitose, antes de fazer a transição para a meiose5,6. Produção de espermatozoides é completada pelo estágio larval 4 (L4) do desenvolvimento, após o qual os oócitos são produzidos durante a idade adulta. Os espermatozoides são armazenados na espermateca onde eles fertilizam oócitos para gerar embriões.
Existem vários fatores genéticos e ambientais que podem influenciar o desenvolvimento do germline em c. elegans , resultando em mudanças no número de núcleos, o número de eventos de apoptotic, dinâmica do cromossoma e expressão de proteínas e/ou localização7 ,8,9,10,11. A análise desses eventos requer a identificação de cada etapa de diferenciação com base na distribuição e morfologia nuclear. Para analisar com precisão esses parâmetros manualmente com um tamanho de amostra grande é trabalhosa e demorada. Para contornar estes inconvenientes e permitir a consistência da análise, desenvolvemos um método automatizado para análise tridimensional do c. elegans germline para núcleos contando, distribuição de núcleos, expressão de proteínas e do citoesqueleto estrutura. Combinando a microscopia confocal com renderização tridimensional, geramos parâmetros de tamanho e forma, para a identificação de cada estágio da diferenciação de células germinativas. Além disso, esse método permite a contagem de esperma e de núcleos de células germinativas, mais Pontuação do número de cromossomos em cada oócito.
Uma estrutura crucial do germline é o citoesqueleto, que fornece a estabilidade para o compartimento da linha germinal, SIDA a ciclose e proteção germline núcleos12. Usando processamento computacional, realizamos a reconstrução tridimensional do citoesqueleto germline e identificado características distintas do citoesqueleto, dentro da linha germinativa. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para ilustrar a análise computacional como combinado com confocal de imagem permite uma análise abrangente do germline c. elegans .
Propomos um método rápido de análise tridimensional de c. elegans germline (Figura 1). Usando a análise tridimensional, é possível estudar a distribuição tridimensional do germline núcleos (Figura 2 e Figura 3), automatizada contagem de células (Figura 2), reconstrução do germline citoesqueleto ( Figura 3), distribuição de proteínas (Figura 4) e marcar o número de espermatozoides na espermateca e cromossomos em oócitos (Figura 5). O método não só permite a quantificação fácil e precisa do germline mas identifica fenótipos fisiologicamente relevantes.
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Protocol
1. preparação e criação de minhoca
Nota: Consulte a Tabela de materiais para todas as informações do produto.
- Cultura de Escherichia coli OP50: cultura OP50 bactérias em caldo lisogenia (LB) (triptona 1%, 0,5% de fermento, 0,5% de NaCl, pH 7.0) durante a noite a 37 ° C, sem antibióticos.
- Semente 400 µ l de bactérias OP50 para placas de mídia (NGM) de crescimento de nematoides (1,5 g de NaCl, 8,5 g de ágar-ágar, 1,25 g de peptona, 1 mL de 1 M CaCl2, 1ml de colesterol de 5 mg/mL em etanol, 1ml de 1m MgSO4 e 25 mL de tampão de4 de KPO 1 M) e o ar seco as bactérias por 48 h.
- Pegar vermes nas placas NGM semeadas e incubar a 15 ° C ou 20 ° C.
- Para a análise do germline adulto hermafrodita, escolher bem alimentados vermes L4 para o gramado bacteriano e incubar durante uma noite a 20 ° C.
- Para marcar o número de espermatozoides em hermafroditas, incube L4 vermes a 20 ° C, durante 12 h até os vermes atinjam o molt L4/adulto. Para sincronizar os vermes para a fase de L4, prepare ovos escolhendo vermes adultos com um monte de ovos em solução de água sanitária (1 M de NaOH e água sanitária na proporção 1:1). Permitir que os ovos eclodem e escolher animais de L4 para o experimento.
- Prepare lâminas de microscópio de Teflon colocando 25 µ l de solução de poli-L-lisina no slide e espalhar a solução, usando a ponta da pipeta. Depois de retirar o excesso poli-L-lisina com toalha de papel, permitir que os slides secar ao ar e a incubar a 65 ° C por 15-20 min.
2. Germline dissecção e coloração6,13
- Spot 10 µ l de tetramisole 0,01% (anestésico) sobre uma lamela de 22 × 22 mm e escolher um dias de idade vermes adultos dentro dele.
- Dissecar o verme na cauda, como torna-se sedado usando uma seringa (5 mL) e uma agulha (24 "x 1") e certifique-se de que a linha germinativa não está danificada.
Nota: A dissecação deve ser efectuada antes o verme torna-se totalmente paralisado para que a pressão negativa no verme e o movimento de verme ajuda a ejeção da da linha germinal. Para marcar o esperma, devem ser tomadas precauções para não danificar a espermateca pela agulha durante a dissecção. Evite tocar o germline com a agulha, exceto o ponto de dissecação após a espermateca. Se não há quebra no compartimento do germline ou qualquer descarga do germline é observada, o germline não deve ser usado para análise. - Coloca a lamela invertida em um slide revestido de poli-L-lisina, mantendo o germline dissecado no slide.
- Remova o excesso de líquido sob a lamínula colocando uma torre de papel em um canto da lamela, então lugar o slide em nitrogênio líquido para 1 min. remover rapidamente a lamela usando uma agulha com a germlines no slide.
- Transferir os slides em metanol de-20 ° C por 30-60 s numa câmara e, em seguida, incube durante 30 min em solução recentemente preparada de fixação (1x tamponado fosfato salino (PBS) contendo 0,08 M HEPES pH 6,9, 1,6 mM de MgSO4, 0,8 mM. o glicol de etileno-bis(beta-aminoethyl éter)-N, N, N', N'-tetraacetic ácido (EGTA) e 3,7% paraformaldeído) à temperatura ambiente.
- Lave as lâminas, colocando em uma câmara contendo 1X PBS, pH 7,4 com 0.1% Tween-20 por 10 min. Repita este passo uma vez.
- Bloquear o germlines com 30 µ l de solução de bloqueio (30% de soro de cabra preparado pela adição de 900 µ l de soro de cabra em 1700 µ l de água destilada H2O e 300 µ l de PBS de x 10) em uma câmara húmida preparada colocando toalha de papel molhada em uma caixa de plástico em temperatura ambiente por 30 min.
- Adicione 50 µ l de solução-anticorpo REC-8 em 30% de soro de cabra em uma proporção 1: 300 para cada amostra. Incubar durante uma noite a 4° C.
- Lave as lâminas, colocando em uma câmara contendo 1X PBS com 0.1% Tween-20 por 10 min. Repita a etapa uma vez e retire o excesso de líquido, colocando uma toalha de papel no canto do slide.
- Prepare a solução de anticorpo secundário diluindo fluoróforo verde (488 nm de emissão de onda) anticorpo secundário conjugado (1: 1000), faloidina (mancha de actina, 1:4000) e DAPI (DNA mancha, 1:4000) em 30% de soro de cabra normal.
- Adicione 50 µ l de solução anticorpo secundário para o slide.
- Encube por 1h à temperatura ambiente.
- Lavar as lâminas duas vezes, colocando em uma câmara contendo 1X PBS com 0.1% Tween-20 por 10 min. Limpe o excesso de líquido.
- Adicionar 30 µ l de reagente para o slide de fixação e coloque um de 12 mm2 x 1,5 µm lamela em cima e secar as lâminas a 4 ° C durante a noite.
3. Confocal da microscopia
- Ligue o microscópio confocal, laser, scanner de ressonância e software microscópio confocal. Coloque os slides com germlines manchado no suporte do slide acima o objetivo X 63.
- Localize uma linha germinativa, foco na parte superior da linha germinativa e marcá-lo usando o software do microscópio confocal. Da mesma forma, concentrar-se na parte inferior do germline e marcá-lo para estabelecer a espessura total da linha germinal.
- O germline inteira definindo a espessura de cada fatia até 0,5 µm. Mark o germline completa e iniciar a aquisição de imagem. Digitalizar cada fatia 8 vezes e a média de valores para melhorar a qualidade de imagem. O scanner de ressonância permitirá a verificação rápida para evitar o branqueamento durante a imagem latente. Se o microscópio não tem um scanner de ressonância, reduzir o número de exames a quatro para evitar descoramento.
4. post análise de núcleos de imagem número e distribuição
Nota: Referem-se a complementar a Figura 1 para screenshots do software ferramentas e botões usados.
- Importe a imagem para hottie 8.4.1 ou versões posteriores do software.
- Defina região mitótica, zona de transição, região meiótica, região do oócito e espermateca do germline, identificando a morfologia nuclear em cada região.
- Use o botão de função de superfície (Figura complementar 1A) do software para selecionar a região de interesse.
- Cancelar o assistente de criação de superfície automática e manualmente, desenhar a região de interesse, o primeiro e o último pedaço da imagem da pilha tridimensional.
- Clique em criar superfície.
Nota: O software automaticamente irá desenvolver as pilhas entre a primeira e a última pilha. - Máscara de todos os canais exceto DAPI clicando o botão de canal de máscara (Complementar a figura 1B-C).
- Defina parâmetros de tamanho nuclear usando o botão de ponto de função (complementar figura 1A). Para a região mitótica, defina um diâmetro XY de 2 µm, deixando o diâmetro Z indefinido. Para a zona de transição, defina o diâmetro XY de 2 µm de diâmetro de Z como 1,5 µm. (complementar a Figura 1).
Nota: Solucione os diâmetros de acordo com a ampliação e especificações do microscópio. Para o protocolo atual, o objetivo utilizado foi 63 X e forneceu um extra de ampliação de 1,70 vezes durante a imagem latente. Se o objetivo for alterado, por exemplo 40 X, os diâmetros devem ser alterados em conformidade. Solução de problemas deve ser realizada com sua germlines para estabelecer os parâmetros corretos. A região mitótica de um braço do germline de tipo selvagem tem aproximadamente 250 núcleos. O diâmetro deve ser modificado para alcançar esse valor. Use pelo menos 15 germlines para determinar o valor ideal para o diâmetro. Uma abordagem semelhante deve ser usada para calibrar a zona de transição (núcleos de 150-170) e a região meiótica (núcleos de 600-700). - Limite a detecção de manchas, definindo o limite mínimo (complementar figura 1E). Uso DAPI manchados tipo selvagem germlines para estabelecer o limite mínimo, aumentando o limiar mínimo de renderização tridimensional até que a mancha aparece fora da linha germinativa.
- Salve a imagem e obter o número de núcleos da tabela gerada automaticamente pelo software. Exporte as imagens como arquivos TIF.
5. publicar a análise de imagem para marcar o esperma e o número de cromossomos
- Execute a renderização tridimensional, selecionando a espermateca como a região de interesse. Para detectar cada espermatozoide, definir o diâmetro do ponto entre 0,75 - 1,0 µm para X e Y-eixo, enquanto o diâmetro Z permanece indefinido. Use o botão de função de pontos, como mostrado na Figura complementar 1.
- Subtrair o fundo marcando fundo subtraia caixa e usando valores de correção de fundo calculados pelo software (complementar a Figura 1).
Nota: O software de hottie escolhe pontos de alta intensidade primeiro, portanto, o efeito de fundo é mínimo, enquanto não há diferença significativa entre a região de interesse e o fundo. Um segundo método é definir a correção de fundo manualmente, se for caso disso, valores pode ser dado para o plano de fundo. Correção de fundo manual será adequada se a intensidade de amostras independentes precisa de comparação. - Ajuste o limite de renderização tridimensional para detectar todos os DAPI manchado de esperma na espermateca (complementar figura 1E).
- Para a contagem de cromossomas, definir o diâmetro do ponto < 0,75 µm para X e Y-eixo antes de desenvolver modelos tridimensionais.
- Salve a imagem e exportar como arquivo TIF.
6. análise de imagem para a reconstrução do citoesqueleto do Germline de postar
- Identificar a região de interesse no germline e mascarar todos os canais exceto faloidina clicando botão máscara canais .
- Defina um detalhes da superfície de 0,25 µm usando o botão de função de superfície (complementar a Figura 1).
Nota: Isto significa que cada 0,25 µm será processado em modelos tridimensionais. Detalhes da superfície podem ser constante para qualquer região do germline onde um modelo de superfície tridimensional será criado para cada 0,25 µm. No entanto, para a região do oócito, detalhes da superfície podem ser aumentada para 0,35 - 0,5 µm, devido à presença de fibras de actina bem definidas nesta região. - Subtrair o fundo marcando fundo subtraia caixa e usando valores de correção de fundo calculados pelo software (complementar a Figura 1).
- Ajuste o limite de renderização tridimensional dependendo da estrutura que exigem análise (complementar figura 1E).
- Salve a imagem tridimensional desenvolvida e exportar como um arquivo TIF.
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Representative Results
Figura 1 indica o tempo necessário para análise tridimensional da linha germinal. Hermafroditas L4 incubadas a 20 ° C foram dissecadas para isolar germlines e coradas com DAPI, faloidina e anticorpos contra as proteínas da linha germinal. Germlines são fotografadas usando microscopia confocal. Microscopia confocal e coloração requer aproximadamente 24 h. análise computacional para o germline completa exige 10-15 min para contar o número e a posição dos núcleos, identificar a distribuição de proteína, analisar a estrutura do citoesqueleto e Pontuação do número de espermatozoides. Análise completa manual requer mais de 2h por germline e está sujeito à influência do operador, portanto, nosso método automatizado do elevado-throughput reduz o tempo de análise e aumenta a reprodutibilidade.
Automatizado de núcleos marcando revela que um braço do germline abriga aproximadamente 1.000-1.200 núcleos (Figura 2C), correspondendo bem anteriormente publicado manual marcando dados1. Para confirmar que a exatidão de marcar um gol, vários mutantes e condições diferentes são utilizados (Figura 2D-G). Por exemplo, comparamos, rnp-8(tm435), cpb-3(bt17)e glp-1(e2141) vermes mutantes para animais do tipo selvagem. Contagem automatizada reproduzida a conhecida redução do número de núcleos em cpb-3 e glp-1 mutante germlines14,15,16,17. Uma severa redução no número de núcleos observou-se também nos mutantes sensíveis à temperatura de glp-1(e2141) quando incubados a 25 ° C. A distribuição dos núcleos é dependente do estágio de diferenciação. A região mitótica, que contém aproximadamente 250 núcleos no tipo selvagem, é hermeticamente embalados com núcleos em comparação com o resto do germline (Figura 3)1. O espaçamento entre os núcleos mitóticos é mínimo e núcleos estão localizados em toda a região mitótica. No entanto, como os núcleos se move longe da extremidade distal, eles aparecem mais no sentido da circunferência do germline (Figura 3). A mudança na distribuição começa na zona de transição e completa como os núcleos entram meiose/paquíteno.
O germline tem estruturas cytoskeletal específicas em diferentes estágios de diferenciação. Nós visualizado F-Actina manchando o germline com faloidina. A distribuição de F-Actina do distal à extremidade proximal do germline foi distinta em cada região (Figura 3 e Figura 5). Em geral, existem duas estruturas separadas que aparecem como um cilindro dentro do cilindro. Na região mitótica, actina interna aparece como uma massa sólida com uma forma específica (Figura 3). Como o germline atinge a zona de transição, a actina interna pressupõe uma estrutura mais cilíndrica e torna-se um cilindro oco como chegar tarde paquíteno. A segunda camada de actina cobre a camada interna, dando forma à linha germinativa. Essa estrutura de actina 'cilindro dentro do cilindro' desaparece em relação à região do oócito (Figura 5). Na região do oócito, actina aparece como fibras grossas. Os oócitos são separados por um ráquis de actina, embora parece ser dinâmico para permitir a circulação de oócitos para a espermateca. Finalmente, actina na espermateca também forma grossos feixes de fibras de actina. No entanto, as fibras parecem ser embalado mais perto do que na região do oócito. A estrutura do citoesqueleto aparece complementar os padrões de distribuição dos núcleos (Figura 3). Na região mitótica, os núcleos aparecem colocados ao redor da estrutura interna de actina. Como eles chegam a meiose/paquíteno, os núcleos organizam entre os dois cilindros de actina, deixando o meio do germline principalmente desprovido de núcleos (Figura 3). Isto provavelmente poderia ajuda ininterrupta a ciclose no germline. Germlines foram corados com um anticorpo contra a proteína REC-8 e analisadas por microscopia confocal. REC-8 é distribuído homogeneamente em torno de núcleos iniciais do germline e mais tarde é clivada e degradado durante a meiose18. Distribuição de REC-8 em análise transversal tridimensional do germline mostra a distribuição de proteína na região mitótica (Figura 4).
Renderização tridimensional da extremidade proximal do germline inclui a espermateca e três primeiros oócitos distais para a espermateca. Nossa análise reconhecido uma média de 151 esperma em cada espermateca (n = 18). Isso corresponde a literatura publicada, indicando a confiabilidade do método (Figura 5F)19. Esta análise pode ser realizada juntamente com o do citoesqueleto ou estudos de distribuição de proteína. O genoma de c. elegans é distribuído entre seis cromossomos. Em oócitos totalmente desenvolvido tipo selvagem, esses cromossomos são visíveis em podem ser contados. Esta separação do cromossomo pode ser usada para estudar a estabilidade do cromossoma ou outros defeitos associados com o desenvolvimento do oócito. Por renderização tridimensional, pode ser visualizado o número de cromossomos, e se os cromossomos são separados corretamente, o número pode ser obtido (Figura 5) com precisão.
Figura 1 . Cronograma para análise automatizada. Comparação de tempo entre a análise manual e computacional do germline c. elegans . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Distribuição de núcleos no germline. (A) DAPI manchado germline mostrando mitótica, transição e regiões paquíteno/meiótica. (B) computacional modelo tridimensional do germline. (C) a pontuação para o número total de núcleos em germlines do tipo selvagem. (D-F) Marcando para o número de núcleos no mitótica, transição e meióticas regiões de tipo selvagem, rnp-8, 3-cpbe glp-1 germlines mutante. (G) a comparação do número total de núcleos no mutante de glp-1 a 20 ° C e 25 ° C. Barra de erro representa o erro padrão. Teste de Student. n < 0,0001, * * *n < 0,001, * *n < 0,01, *n < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Estrutura do citoesqueleto do germline. (A-B) Organização do citoesqueleto interno actina (vermelho) do germline na região mitótica. A actina interna tem uma estrutura difusa em relação ao exterior actina na região mitótica. (C-D) Na região de paquíteno, o citoesqueleto assume uma estrutura cilíndrica, formando dois cilindros, entre os quais são organizados os núcleos (azuis). (E-F) Organização dos núcleos do germline em regiões mitóticas e paquíteno. A distribuição dos núcleos é mais no sentido da circunferência do 'germtube' na região de paquíteno comparada a região mitótica (verde) e meio do germline a tornar-se desprovida de núcleos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Expressão REC-8 na região mitótica. (A) Micrografia mostrando a extremidade distal de uma REC-8-manchado da linha germinal. (B-C) Renderização tridimensional de REC-8 coloração (mostrado em azul) e a distribuição de proteína entre os núcleos mitóticos (em verde). REC-8 coloração é menos abundante proximal à região mitótica (marcada por pontos brancos que representam núcleos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Estrutura do germline na extremidade proximal. (A) DAPI coloração do germline na extremidade proximal. (B) tridimensional renderização de DAPI coloração apresentando esperma na espermateca (amarela) e cromossomos em oócitos (branco). (C-E) Estrutura tridimensional do citoesqueleto na extremidade proximal da linha germinativa. Marcas vermelhas na extremidade proximal completa e verde marca a espermateca. Análise de secional transversal mostra que o citoesqueleto constitui não só uma estrutura filamentosa de actina em torno de oócitos, mas também separa entre oócitos. (F) gráfico mostrando o número de espermatozoides em cada espermateca e média obtidos de vários espermateca (n = 18). Barra de erro representa o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1 . Descrição de ferramentas de software de. (A) as manchas e ferramentas de superfície para a detecção de núcleos e coloração de proteínas. (B-C) A seleção da região tridimensional de interesse usando a ferramenta de superfície. (D) definir o XY-diâmetro, usando a ferramenta de pontos, para a deteção de núcleos. Dependendo da região de interesse e coloração, correção de diâmetro e fundo o eixo z pode ser usada. (E) mínimo e deteção de limiar de intensidade máxima. Uma abordagem semelhante pode ser usada para a função superfície onde em vez de definir o diâmetro, e os detalhes de superfície podem ser definidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O objetivo do presente protocolo é melhorar a precisão e reduzir o tempo necessário para a análise da linha germinal. Após preparação padrão de germlines dissecado, um modelo tridimensional do germline núcleos é preparado por processamento computacional. Permitindo a observação da distribuição de núcleos germline no espaço, renderização tridimensional calcula o número de núcleos em regiões específicas da da linha germinal. O aspecto crítico do nosso método é uma definição precisa dos parâmetros de tamanho e forma dos núcleos. Isso depende da clareza de coloração e ampliação usado a imagem. Nós confirmamos a precisão do método, comparando a publicado dados analisados manualmente1. Para confirmar ainda mais a precisão do nosso método, usamos vários mutantes em diferentes condições e confirmou os resultados com a literatura publicada. Também confirmou a capacidade do método para detectar fenótipos sutis e fortes - mutantes cpb-3 e glp-1 , respectivamente. Além disso, este método mostra capacidade de adaptação às mudanças em núcleos de tamanho e forma dentro do germline ou mesmo entre cepas. Esta propriedade também permite a identificação e a Pontuação das estruturas menores do germline como cromossomos e esperma. O método também permite resolução de problemas futuros para os parâmetros de tamanho e forma, se necessário. Nossa análise foi capaz de elucidar a distribuição dos núcleos no germline e mostrou que núcleos em mitótica e regiões paquíteno organizam-se em diferentes padrões. Aplicando a renderização tridimensional para REC-8 e DAPI coloração, mostramos também a distribuição de REC-8 em núcleos da região mitótica.
Renderização tridimensional de actina coloração habilitado exame pormenorizado do germline estruturas do citoesqueleto. O germline parece ter duas estruturas separadas de actina, embora eles mantém contato físico. Enquanto a reconstrução do citoesqueleto para o germline inteira é possível como uma entidade única, os melhores resultados podem ser obtidos se as regiões de interesse são pré-selecionados em mitótica, transição e regiões meióticas. O citoesqueleto germline distal tem uma forma indefinida e evolui para uma estrutura filamentosa na extremidade proximal. Nosso protocolo, portanto, permite a reconstrução tridimensional do citoesqueleto de actina germline definindo parâmetros específicos para acomodar as diferenças na distribuição de actina. O aspecto mais importante da análise é a definição de parâmetros como tamanho de núcleos e exigência de detalhes da superfície. Reduzir o tamanho de núcleos abaixo o tamanho real correrá o risco do software para pegar pontos brilhantes dentro dos núcleos como objetos separados. Da mesma forma, valores altos detalhes superficiais levará à perda de estruturas tridimensionais precisas. O método proposto baseia-se na precisão de dissecção e a qualidade de coloração da linha germinativa. Um germline danificado pode levar à liberação de núcleos do germline, causando a numeração imprecisa. Fundo elevado da coloração também fará com que a contagem de núcleos impreciso e inadequada renderização tridimensional.
Nosso método se estende anteriormente conhecidos métodos automatizados de análise germline onde somos capazes de analisar o número de núcleos e distribuição/expressão das proteínas do germline no espaço com um único protocolo20. Em segundo lugar, nosso método permite marcar de estruturas menores como cromossomos dentro da linha germinativa. Segregação do cromossomo é um aspecto importante do desenvolvimento de oócito21. Usando nosso método, é possível detectar o número e posição dos cromossomos, onde a distância pode ser definida por calibrando contra oócitos de tipo selvagem. Qualquer mutação afetando a separação do cromossomo pode ser estudada usando esta ferramenta. Além disso, o método pode ser estendido para estudar os cromossomos em embriões no estágio de 2 células. A análise computacional também fornece o número de espermatozoides na espermateca, número de cromossomos em um oócito e germline estruturas do citoesqueleto. Tomados em conjunto, o método fornece uma análise abrangente do c. elegans germline usando um único protocolo, reduzindo consideravelmente o tempo de análise. O método elimina a necessidade de várias ferramentas para cada análise (número de núcleos, distribuição da proteína e estrutura do citoesqueleto) e remove o tempo de codificação necessário em qualquer software específico. Finalmente, esse método pode ser efetivamente estendido para outros estudos de worm, incluindo a análise tridimensional de vermes vivos sedados.
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Disclosures
Os autores declaram não há conflito de interesses.
Acknowledgments
Agradecemos seu apoio técnico Monash Microimaging. Algumas cepas foram fornecidas pelo centro de genética Caenorhabditis , que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). Este trabalho foi apoiado por Monash University biomedicina descoberta Fellowship, NHMRC Project Grant (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) e bolsa de inovação veski: 23-VIF Roger Pocock.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
References
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