Summary
Vi presenterer en automatisert metode for tredimensjonale rekonstruksjon av Caenorhabditis elegans germline. Vår metode bestemmer antall og plasseringen av hver kjernen i germline og analyser germline protein distribusjon og cellen cytoskjelett struktur.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline brukes til å studere flere biologisk viktig prosesser inkludert stamcelleforskningen utvikling, apoptose og kromosom dynamics. Germline er en utmerket modell, er analysen ofte to dimensjonale tid og arbeid kreves for tredimensjonale analyse. Store readouts i slike studier er nummer/plasseringen av kjerner og protein distribusjon innen germline. Her presenterer vi en metode for å utføre automatiserte analyse av germline bruke AC confocal mikroskopi og computational tilnærminger til å bestemme antall og plasseringen av kjerner i hver region av germline. Vår metode analyserer også germline protein distribusjon som gir tredimensjonale undersøkelse av protein uttrykk i forskjellig genetisk bakgrunn. Videre viser vår studie variasjoner i cellen cytoskjelett arkitektur i forskjellige regioner i germline som kan romme romlige utviklingsmessige behov. Endelig, vår metode kan automatisk telling av sædceller i spermatheca av hver germline. Samlet aktiverer våre metoden rask og reproduserbar fenotypiske analyse av C. elegans germline.
Introduction
Bevaring av signalnettverk trasé med pattedyr gjør C. elegans en utmerket modell å studere flere biologiske prosesser1,2. I vår lab bruker vi C. elegans germline å studere stamcelleforskningen utvikling, apoptose og genuttrykk. Germline er en tredimensjonal struktur, er mange studier to dimensjonale grunn tidkrevende og arbeidskrevende av tredimensjonale analyse. Det er svært sannsynlig at todimensjonal analyse kan fremstille in vivo hendelser i germline. C. elegans voksen Hermafroditt har to germline armer, hver huser en somatiske distale celle (DTC) som opprettholder distale bakterie celler i en udifferensierte staten3,4. Disse bakterie celler begynner å skille som de beveger seg fra DTC, unnslippe sin innflytelse, og bli oocytes og sperm som de når den proksimale enden av germline. Under denne prosessen gjennomgå bakterie celle kjerner mitose, før overgangen til meiose5,6. Sperm produksjon er fullført ved larvestadiet 4 (L4) av utviklingen, hvoretter oocytes er produsert av voksen. Sædcellene lagres i spermatheca hvor de befrukte oocytes å generere embryoer.
Det er flere genetiske og miljømessige faktorer som kan påvirke germline utvikling i C. elegans resulterer i endringer i antall kjerner, antall apoptotisk hendelser, kromosom dynamikk, og protein uttrykk og/eller lokalisering7 ,8,9,10,11. Analyse av disse hendelsene krever identifikasjon av hvert trinn av differensiering basert på kjernefysisk morfologi og distribusjon. Nøyaktig analysere disse parameterne manuelt med en stor utvalgsstørrelsen er arbeidskrevende og tidkrevende. Omgå disse ulempene og aktiverer konsistensen av analyse, vi utviklet en automatisert metode for tredimensjonale undersøkelse av C. elegans germline for kjerner teller, kjerner distribusjon, protein uttrykk, cellen cytoskjelett struktur. Ved å kombinere AC confocal mikroskopi med tredimensjonal gjengivelse, generert vi størrelse og form parametere for identifikasjon av hvert trinn av bakterie celledifferensiering. Denne metoden kan videre telling av bakterie celle kjerner og sperm pluss scoring av Kromosom nummer i hver oocyte.
En avgjørende strukturen i germline er cytoskjelett, som gir stabilitet til germline rom, aids cytoplasmatiske streaming og beskyttelse til germline kjerner12. Bruker beregningsorientert gjengivelse, vi utført tredimensjonale rekonstruksjon av germline cytoskeleton og identifisert distinkte cellen cytoskjelett funksjoner innen germline. Her beskriver vi en trinnvis protokoll for å illustrere hvordan beregningsorientert analyse kombinert med AC confocal tenkelig muliggjør omfattende analyse av C. elegans germline.
Vi foreslår en rask metode for tre-dimensjonal analyse av C. elegans germline (figur 1). Bruke tredimensjonal analyse, er det mulig å studere tredimensjonale distribusjon av germline kjerner (figur 2 og Figur 3), automatisk telling av celler (figur 2), rekonstruksjon av germline cytoskeleton ( Figur 3), distribusjon av proteiner (Figur 4), og scoret sperm i spermatheca og chromosomes oocytes (figur 5). Metoden ikke bare gir enkel og nøyaktig kvantifisering av germline men identifiserer fysiologisk relevante fenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse og ormen røkting
Merk: Se Tabell for materiale for ytterligere produktinformasjon.
- OP50 Escherichia coli kultur: kultur OP50 bakterier i Lysogeny kjøttkraft (LB) (1% tryptone 0,5% gjær 0,5% NaCl, pH 7.0) overnatting på 37 ° C uten antibiotika.
- Frø 400 µL OP50 bakterier til Rundormer vekst medier (NGM) plater (1,5 g NaCl, 8,5 g agar, 1,25 g pepton 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL av 5 mg/mL kolesterol i etanol, 1 mL 1 M MgSO4 og 25 mL 1 M KPO4 buffer) og lufttørke bakterier 48 h.
- Velg ormer på seeded NGM plater og ruge på 15 ° C eller 20 ° C.
- For analyse av det voksen Hermafroditt germline, plukke velfødde L4 ormer å bakteriell plenen og ruge over natten på 20 ° C.
- For scoring sperm tall i hermafroditter, ruge L4 ormer ved 20 ° C i 12t til ormer kommer L4/voksen molt. Hvis du vil synkronisere ormer til L4 scenen, forberede egg ved å plukke voksen ormer med mange egg i bleike løsning (1 M NaOH og blekemiddel i 1:1 ratio). Tillate egg til å klekkes L4 dyr for eksperimentet.
- Forberede Teflon objektglass ved å plassere 25 µL av poly-L-lysine løsning på lysbildet og spre løsningen Vel, bruker en pipette tips. Etter fjerner overflødig poly-L-lysine med tørkepapir, kan lysbildene for å lufttørke og Inkuber skliene i 65 ° C i 15-20 min.
2. Germline disseksjon og flekker6,13
- Spot 10 µL av 0,01% tetramisole (anestesi) på en 22 mm × 22 mm dekkglassvæske og velge en - dagers gammel voksen ormer i den.
- Dissekere ormen ved halen som det blir bedøvet bruker en sprøyte (5 mL) og en nål (24 "x 1"), og sikre at germline ikke er skadet.
Merk: Dissection må utføres før ormen blir fullstendig lammet slik at den negative trykket i ormen og ormen bevegelse hjelpe utløsing av germline. For scoring sperm, må forholdsregler tas ikke å skade spermatheca av nålen under disseksjon. Unngå å berøre germline med nålen unntatt disseksjon punktet etter spermatheca. Hvis det er brudd i germline rommet eller noen utslipp fra germline er observert, bør germline ikke brukes for analyse. - Plass den omvendte dekkglassvæske på en poly-L-lysine belagt lysbilde, holder den dissekert germline på lysbildet.
- Fjern overflødig væske under dekkglassvæske ved å plassere et papir tårn i et hjørne av dekkglassvæske, og deretter sted lysbildet i flytende nitrogen for 1 min. raskt fjerne dekkglassvæske som bruker en nål, med germlines på lysbildet.
- Overføre lysbildene til 20 ° C metanol for 30-60 s i et kammer, så ruge i 30 min i nylagde fikse løsning (1 x fosfat bufret saltvann (PBS) inneholder 0,08 M HEPES pH 6,9 1,6 mM MgSO4, 0,8 mM etylenglykol-bis(beta-aminoethyl Eter)-N, N, N', N'-tetraacetic syre (EGTA), og 3,7% paraformaldehyde) i romtemperatur.
- Vask lysbilder ved å sette i et kammer som inneholder 1 x PBS, pH 7.4 med 0,1% Tween-20 i 10 min. Gjenta dette trinnet når.
- Blokkere germlines med 30 µL av blokkering løsning (30% av geit serum forberedt ved å legge til 900 µL av geit serum 1700 µL av destillert H2O og 300 µL av 10 x PBS) i en fuktig kammer utarbeidet ved å plassere våtserviett i en plast ved romtemperatur for 30 min.
- Legge til 50 µL REC-8 antistoff løsning i 30% geit serum i et forhold 1:300 til hvert utvalg. Ruge over natten på 4° C.
- Vask lysbilder ved å sette i et kammer som inneholder 1 x PBS med 0,1% Tween-20 i 10 min. Gjenta trinn en gang og fjerne overflødig væske ved å plassere et papirhåndkle hjørne på lysbildet.
- Klargjøre sekundære antistoff løsning fortynne grønne fluorophore (488 nm utslipp bølgelengde) konjugert sekundære antistoff (1:1000), phalloidin (begrepsordbok flekken, 1: 4000) og DAPI (DNA flekken, 1: 4000) i 30% normal geit serum.
- Legge til 50 µL av sekundær antistoff løsning i lysbildet.
- Inkuber 1t ved romtemperatur.
- Vask lysbildene to ganger ved å sette i et kammer som inneholder 1 x PBS med 0,1% Tween-20 i 10 min. tørke av overflødig væske.
- Legge til 30 µL fikse reagensen inn i lysbildet og plassere en 12 mm2 x 1,5 µm dekkglassvæske på toppen og tørr skliene i 4 ° C over natten.
3. AC confocal mikroskopi
- Slå på AC confocal mikroskop, lasere, resonans skanner og AC confocal mikroskop programvare. Plass lysbildene med farget germlines på lysbildeholderen over 63 X målsettingen.
- Finn en germline, fokus på germline og merke den ved å bruke AC confocal mikroskop. Tilsvarende fokus på bunnen av germline og merke det å etablere total germline tykkelse.
- Bilde av hele germline ved å definere tykkelsen på hver skive til 0,5 µm. merke komplett germline og starte oppkjøpet. Skanne hver skive 8 ganger og beregne gjennomsnittet for verdiene for å forbedre bildekvaliteten. Resonans skanneren vil tillate rask skanning for å unngå bleking under bildebehandling. Hvis mikroskopet ikke har en resonant skanner, redusere antall skanninger til fire å unngå bleking.
4. innlegget Imaging analyse av kjerner tall og distribusjon
Merk: Se utfyllende figur 1 for skjermbilder av verktøy og knapper som brukes.
- Import bildet Imaris 8.4.1 eller senere versjoner av programvaren.
- Definere mitotisk regionen, overgang sone, meiotic regionen, oocyte regionen og spermatheca av germline ved å identifisere kjernefysiske morfologi i hver region.
- Bruk overflaten funksjonsknappen (supplerende figur 1A) av programvaren til å velge området rundt.
- Avbryte automatisk overflaten opprettelsesveiviseren og manuelt trekke regionen rundt på den første og siste del av bildet fra tredimensjonale stakken.
- Klikk Opprett overflaten.
Merk: Programvaren vil automatisk utvikle stabler mellom første og siste stakken. - Skjule alle stasjonene bortsett fra DAPI ved å klikke i maskekanalen (Supplerende figur 1B-C).
- Definere kjernefysiske størrelse parametere bruke spot funksjon-knappen (supplerende figur 1A). Mitotisk området, kan du definere en XY diameter på 2 µm samtidig la Z diameter udefinert. For sonen overgang Definer en XY diameter på 2 µm og Z diameter som 1,5 µm. (supplerende figur 1 d).
Merk: Feilsøke diameter ifølge forstørrelsen og spesifikasjoner av mikroskopet. For gjeldende protokollen, målet brukt var 63 X og gitt ekstra 1,70 timene forstørrelsen under bildebehandling. Hvis målet endres, for eksempel 40 X, bør diameter endres tilsvarende. Feilsøking bør utføres med wildtype germlines å etablere riktige parametere. En vill type germline arm mitotisk regionen har ca 250 kjerner. Diameteren bør endres for å oppnå denne verdien. Bruke minst 15 germlines for å bestemme den optimale verdien for diameter. En lignende tilnærming bør brukes for å kalibrere den overgangen sonen (150-170 kjerner) og meiotic-regionen (600-700 kjerner). - Begrense påvisning av flekker ved å definere det laveste terskelen (supplerende figur 1E). Bruk DAPI farget wild type germlines å etablere laveste terskelen ved å øke minimum tredimensjonal gjengivelse terskelen til første stedet vises utenfor germline.
- Lagre bildet og få antall kjerner fra tabellen genereres automatisk av programmet. Eksportere bilder som TIF-filer.
5. legge Imaging analyse for Scoring sæd og Kromosom nummer
- Utføre tredimensjonal gjengivelse ved å velge spermatheca regionen rundt. Å oppdage hver sæd, definere flekk diameter mellom 0,75 - 1.0 µm for X og Y-aksen, mens Z diameter er udefinert. Bruke funksjonsknappen flekker som vist i supplerende figur 1.
- Trekke fra bakgrunnen ved å krysse bakgrunnen trekker boksen og bruke bakgrunnen verdiene beregnes av programvaren (supplerende figur 1 d).
Merk: Imaris programvare plukker høy intensitet poeng først, derfor effekten av bakgrunnen er minimal så lenge det er betydelig forskjell i regionen rundt og bakgrunnen. En annen metode er å definere bakgrunn rettelsen manuelt, eventuelt verdier kan gis for bakgrunnen. Manuell bakgrunn korreksjon blir riktig hvis intensiteten av uavhengige utvalg trenger sammenligning. - Justere tredimensjonal gjengivelse terskelen for å oppdage alle DAPI farget sædceller i spermatheca (supplerende figur 1E).
- Kromosom teller, definere flekk diameter < 0,75 µm for X og Y-aksen før utvikling tredimensjonale modeller.
- Lagre bildet og eksporterer som TIF-fil.
6. legge Imaging analyse for cellen cytoskjelett rekonstruksjon av Germline
- Identifisere interesse i germline regionen og maskere alle stasjonene bortsett fra phalloidin ved å klikke skjule kanaler .
- Definere en overflate detalj på 0,25 µm ved hjelp av funksjonsknappen overflaten (supplerende figur 1).
Merk: Dette betyr at hver 0,25 µm vil bli gjengitt i tredimensjonale modeller. Overflaten detalj kan være konstant for en del av germline der en tredimensjonal overflate modell opprettes for hver 0,25 µm. Imidlertid oocyte området, overflate detaljer kan økes til 0,35 - 0,5 µm skyldes tilstedeværelse av veldefinerte begrepsordbok fiber i denne regionen. - Trekke fra bakgrunnen ved å krysse bakgrunnen trekker boksen og bruke bakgrunnen verdiene beregnes av programvaren (supplerende figur 1 d).
- Justere tredimensjonal gjengivelse terskelen avhengig struktur som krever analyse (supplerende figur 1E).
- Lagre utviklet tredimensjonale bildet og eksportere som en TIF-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser tiden som kreves for tredimensjonale germline analyse. L4 hermafroditter ruges ved 20 ° C ble dissekert for å isolere germlines og farget med DAPI, phalloidin og antistoffer mot germline proteiner. Germlines er avbildet med AC confocal mikroskopi. Flekker og AC confocal mikroskopi krever omtrent 24 h. beregningsorientert analyse for den komplette germline krever 10-15 minutter å telle antall og plassering av kjerner, identifisere protein fordelingen, analysere cellen cytoskjelett struktur og score på antall sperm. Fullstendig manuell analyse krever over 2 t per germline og kan operatøren innflytelse, derfor våre automatiserte høy gjennomstrømming metoden reduserer analyse og forbedrer reproduserbarhet.
Automatisert kjerner scoring avslører at en germline arm huser omtrent 1000-1200 kjerner (figur 2C), svarer godt med tidligere Publisert håndbok scoring data1. Å bekrefte nøyaktigheten av scoring, flere mutanter og ulike forhold er brukt (figur 2D-G). Vi sammenlignet eksempelvis rnp-8(tm435), cpb-3(bt17)og glp-1(e2141) mutant ormer vill type dyr. Automatiserte teller gjengitt kjent reduksjon av antall kjerner i cpb-3 og glp-1 mutant germlines14,15,16,17. En alvorlig reduksjon i kjerner tall ble også observert i glp-1(e2141) temperatur-sensitive mutant når ruges på 25 ° C. Fordelingen av kjerner er avhengig av scenen av differensiering. Mitotisk regionen, som inneholder ca 250 kjerner i naturen, er tett-pakket med kjerner i forhold til resten av germline (Figur 3)1. Avstanden mellom mitotisk kjerner er minimal og kjerner finnes i hele regionen mitotisk. Men når kjerner flytter fra klubbeformede enden, vises de mer mot omkretsen av germline (Figur 3). Endringen i distribusjon starter på sonen overgang og fullfører som kjerner inn meiose/pachytene.
Germline har spesifikke cellen cytoskjelett strukturer på ulike stadier av differensiering. Vi visualisert F-utgangen av flekker germline med phalloidin. Fordelingen av F-utgangen fra den distale proksimale enden av germline var tydelig på hver region (Figur 3 og figur 5). Generelt finnes det to separate strukturer som vises som en 'sylinder i sylinderen." På mitotisk regionen vises indre begrepsordbok som en fast masse etter en bestemt figur (Figur 3). Som germline når sonen overgang, den indre begrepsordbok forutsetter en mer sylindrisk struktur og blir en hul sylinder som den når slutten pachytene. Andre lag av utgangen dekker det indre laget gir form til germline. Denne 'sylinder i sylinder' utgangen struktur forsvinner overfor oocyte regionen (figur 5). På regionen oocyte vises begrepsordbok som tykk fiber. Oocytes er atskilt med en begrepsordbok rachis, selv om det synes å være dynamisk å tillate bevegelse av oocytes til spermatheca. Til slutt, begrepsordbok i spermatheca også danner tykke bunter av utgangen fiber. Fibrene vises imidlertid pakkes nærmere enn i regionen oocyte. Cellen cytoskjelett strukturen synes å utfylle distribusjon mønstre av kjerner (Figur 3). Regionen mitotisk vises kjerner rundt den indre begrepsordbok strukturen. Som de nå meiose/pachytene, organisere kjerner mellom to begrepsordbok sylindere slik at midten av germline meste uten kjerner (Figur 3). Dette kunne sannsynligvis hjelpe uavbrutt cytoplasmatiske streaming i germline. Germlines var farget med et antistoff mot REC-8 protein og analyseres av AC confocal mikroskopi. REC-8 er distribueres homogent rundt tidlig kjerner i germline og senere kløyvde og degradert under meiose18. REC-8 distribusjon i tredimensjonale cross-sectional analyse av germline viser fordelingen av protein i regionen mitotisk (Figur 4).
Tredimensjonal gjengivelse av den proksimale enden av germline inkluderer spermatheca og tre første oocytes distale til spermatheca. Vår analyse anerkjent gjennomsnittlig 151 sperm i hver spermatheca (n = 18). Dette tilsvarer publiserte litteratur, indikerer påliteligheten av metoden (figur 5F)19. Denne analysen kan utføres sammen med cellen cytoskjelett eller protein størrelsesDistribusjon studerer. C. elegans genomet fordeles seks kromosomer. I fullt utviklet vill-type oocytes, disse kromosomene er synlige og kan telles. Dette kromosomet separasjon kan brukes å studere kromosom stabilitet eller andre feil knyttet til oocyte utvikling. Hvor mange kromosomer kan visualiseres tredimensjonal gjengivelse, og hvis kromosomene skilles riktig, hvor fås nøyaktig (figur 5).
Figur 1 . Tidslinje for automatisk analyse. Tid sammenligning mellom manuell og beregningsorientert analyse av C. elegans germline. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Kjerner distribusjon i germline. (A) DAPI farget germline viser mitotisk, overgang og pachytene/meiotic områder. (B) beregningsorientert tredimensjonal modell av germline. (C) Scoring for antall atomkjerner i wild type germlines. (D-F) Scoring av kjerner på mitotisk, overgang og meiotic områder av wild type rnp-8, cpb-3og glp-1 muterte germlines. (G) sammenligning i antall atomkjerner i glp-1 mutant på 20 ° C og 25 ° C. Feilfelt representerer standardfeil. Student test. n < 0,0001, ***n < 0,001, **n < 0,01, *n < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Cellen cytoskjelett strukturen i germline. (AB) Organisering av indre utgangen (rød) cytoskeleton av germline på mitotisk regionen. Den indre begrepsordbok har en diffus struktur sammenlignet med ytre utgangen på mitotisk regionen. (C-D) I regionen pachytene forutsetter cytoskeleton en sylindrisk struktur ved å danne to sylindre mellom kjerner (blå) er organisert. (E-F) Organisering av germline kjerner i regionene mitotisk og pachytene. Fordelingen av kjerner er mer mot omkretsen av 'germtube' på pachytene regionen sammenlignet mitotisk regionen (grønn) og midt i germline blitt blottet for kjerner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . REC-8 uttrykk i regionen mitotisk. (A) mikroskop-bilde viser distale en REC-8-farget germline. (ABC) Tredimensjonal gjengivelse av REC-8 flekker (vist i blått) og distribusjon av protein mellom mitotisk kjerner (grønn). REC-8 flekker er mindre rikelig proksimale til mitotisk regionen (merket med hvite prikker som representerer kjerner). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Germline strukturen ved den proksimale enden. (A) DAPI farging av germline ved den proksimale enden. (B) tredimensjonal gjengivelse av DAPI flekker viser sperm i spermatheca (gul) og chromosomes oocytes (hvit). (C-E) Tredimensjonale cellen cytoskjelett struktur ved den proksimale enden av germline. Røde merker den komplette proksimale enden og grønne merker i spermatheca. Kryss seksjon analyse viser at cytoskeleton ikke skjemaer trådformede strukturen til utgangen rundt oocytes, men også skiller mellom oocytes. (F) graf som viser antall sædceller i hver spermatheca og gjennomsnittlig fra flere spermatheca (n = 18). Feilfelt representerer standardfeil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1 . Programvare verktøy beskrivelse. (A) den flekker og overflate verktøy for å oppdage kjerner og protein flekker. (ABC) Valg av tredimensjonale områder av interesse ved hjelp av verktøyet overflate. (D) definere XY-diameter, benytter flekker verktøyet, for kjerner gjenkjenning. Avhengig av regionen interesse og flekker, kan z diameter og bakgrunnen korreksjon brukes. (E) minimum og maksimum styrke terskelen gjenkjenning. En lignende tilnærming kan brukes for overflate funksjon der i stedet for definere diameter, og overflaten detaljene kan defineres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne protokollen er å forbedre nøyaktigheten og redusere tiden som kreves for germline analyse. Etter standard forberedelse av dissekert germlines, er en tredimensjonal modell av germline kjerner utarbeidet av beregningsorientert gjengivelse. Samtidig som observasjon av germline kjerner distribusjon i rommet, beregner tredimensjonal gjengivelse antall kjerner på bestemte områder av germline. Det viktige aspektet av vår metode er nøyaktig definisjon av størrelse og form av kjerner. Dette avhenger av klarhet flekker og forstørrelse brukes til bilde. Vi bekrefter nøyaktigheten av metoden sammenligne publisert manuelt analysert data1. For å ytterligere for å bekrefte nøyaktigheten av vår metode, vi brukte flere mutanter under ulike forhold og bekreftet resultatene med publisert litteratur. Den bekreftet også evne til metoden å oppdage subtile og sterk fenotyper - cpb-3 og glp-1 mutanter, henholdsvis. I tillegg viser denne metoden tilpasning til endringer i kjerner størrelse og form i germline eller selv mellom stammer. Denne egenskapen kan også identifikasjon og scoring av mindre strukturer i germline som kromosomene og sperm. Metoden kan også ytterligere feilsøking for størrelse og form parametere, hvis nødvendig. Vår analyse kunne belyse fordelingen av kjerner i germline og viste at atomkjerner i mitotisk og pachytene områder er organisert på ulike mønstre. Bruker tredimensjonal gjengivelse REC-8 og DAPI flekker, viste vi også distribusjon av REC-8 i kjerner av regionen mitotisk.
Tredimensjonal gjengivelse av utgangen flekker aktivert detaljert undersøkelse av germline cellen cytoskjelett strukturer. Germline synes å ha to separate begrepsordbok strukturer, selv om de har fysisk kontakt. Gjenoppbygging av cytoskeleton for hele germline er mulig som en enkelt enhet, best resultater kan oppnås hvis regionene rundt er merket i mitotisk, overgang, og meiotic områder. Distale germline cytoskeleton har en udefinert figur og utvikler seg til en trådformede struktur ved den proksimale enden. Våre Protokoll kan derfor tredimensjonale rekonstruksjon av germline utgangen cytoskeleton ved å definere bestemte parametere til forskjeller i utgangen distribusjon. Den mest kritiske aspekten av analysen er definisjonen av parameterne som kjerner størrelse og normalkart overflatedetaljene krav. Senke kjerner størrelsen under den faktiske størrelsen ville risk programvaren å plukke lyspunkter i kjerner som separate objekter. Tilsvarende vil høy detaljer fra overflaten verdier føre til tap av nøyaktig tredimensjonale strukturer. Den foreslåtte metoden er avhengig av presisjon av disseksjon og kvaliteten på den germline flekker. En skadet germline kan føre til utgivelsen av kjerner fra germline, forårsaker unøyaktig nummerering. Høy bakgrunn fra den flekker vil også forårsake unøyaktig kjerner teller og upassende tredimensjonal gjengivelse.
Vår metode utvider tidligere kjent automatiserte metoder for germline analyse der vi er i stand analysere kjerner antall og distribusjon/uttrykk germline proteiner i rommet med en enkel protokoll20. Dernest kan vår metode scoring av mindre strukturer som kromosomer i germline. Kromosom raseskille er en viktig del av oocyte utvikling21. Bruke vår metode, er det mulig å oppdage nummeret og plasseringen av kromosomer der avstanden kan defineres av kalibrere mot wild type oocytes. Noen mutasjon påvirker kromosom separasjon kan studeres ved hjelp av dette verktøyet. Også, kan metoden utvides for å studere kromosomer i embryo på 2-celle scenen. Beregningsorientert analysen gir også antall sperm i spermatheca, antall kromosomer i oocyte og germline cellen cytoskjelett strukturer. Samlet gir metoden omfattende analyse av C. elegans germline bruker en enkel protokoll samtidig redusere analyse tid betraktelig. Metoden fjerner behovet for flere verktøy for hver analyse (kjerner tall, protein distribusjon og cellen cytoskjelett struktur) og fjerner koding tidsbruken i noen spesiell programvare. Til slutt kan denne metoden effektivt utvides til andre ormen studier inkludert tredimensjonale analyse av bedøvet live ormer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Monash Microimaging for deres teknisk støtte. Noen stammer ble levert av Caenorhabditis genetikk sentrum, som er finansiert av NIH Office forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Dette arbeidet ble støttet av en Monash University biomedisin Discovery fellesskap, NHMRC prosjekt stipend (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) og veski innovasjon fellesskap: VIF 23 Roger Pocock.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
References
- Hubbard, E. J. Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology. Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).
- Kershner, A., et al. Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).
- Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (2), 88372 (2014).
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).
- Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crittenden, S. L., et al. A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans. Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).
- Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).
- Schumacher, B., et al. Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis. Cell. 120 (3), 357-368 (2005).
- McMullen, P. D., et al. Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress. PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).
- Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. Physiological control of germline development. Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).
- Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).
- Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development. Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).
- Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development. Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).
- Austin, J., Kimble, J. glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell. 51 (4), 589-599 (1987).
- Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors. Development. 124 (4), 925-936 (1997).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).
- Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
- Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).
- Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells. Development. 139 (5), 859-870 (2012).
- Laband, K., et al. Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes. Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).
