Summary
Vi presenterar en automatiserad metod för tredimensionell rekonstruktion av den Caenorhabditis elegans könsceller. Vår metod bestämmer antal och placering av varje kärnan inom könsceller och analyser könsceller protein distribution och cytoskeletal struktur.
Abstract
Den Caenorhabditis elegans (C. elegans) könsceller används för att studera flera biologiskt viktiga processer inklusive stamceller utveckling, apoptos och kromosom dynamics. Medan könsceller är en utmärkt modell, är analysen ofta två dimensioner på grund av tid och arbetskraft krävs för tredimensionell analys. Stora värden i sådana studier är nummer/position av kärnor och protein fördelningen inom könsceller. Här presenterar vi en metod för att utföra automatiserad analys av de könsceller med konfokalmikroskopi och beräkningsvetenskapliga metoder för att fastställa antal och placering av atomkärnor i varje region av könsceller. Vår metod analyserar också könsceller protein distribution som gör tredimensionella undersökning av proteinuttryck i olika genetiska bakgrunder. Vår studie visar vidare, variationer i cytoskeletal arkitektur i olika regioner av de könsceller som kan rymma rumsliga utvecklingsmässiga behov. Slutligen, vår metod möjliggör automatiserad inventering av spermier i spermatheca av varje könsceller. Sammantaget möjliggör vår metod snabba och reproducerbara fenotypiska analys av den C. elegans könsceller.
Introduction
Bevarande av signalering vägar med däggdjur gör C. elegans en utmärkt modell att studera flera biologiska processer1,2. I vårt labb använder vi den C. elegans könsceller att studera stamceller utveckling, apoptos och genuttryck. Medan könsceller är en tredimensionell struktur, är många studier två dimensionell på grund av hur tidskrävande och arbetsintensiva tredimensionell analys. Det är mycket troligt att tvådimensionell analys kan förvränga i vivo händelser i könsceller. I C. elegans vuxen hermafrodit har två könsceller armar, som inrymmer en somatisk distala spets cell (DTC) som upprätthåller distala könsceller i en odifferentierad staten3,4. Dessa könsceller börjar skilja när de flyttar bort från DTC, flyr sitt inflytande, och bli äggceller och spermier som de når proximala ände av könsceller. Under denna process genomgå bakteriecellen atomkärnor Mitos, innan de övergår till meios5,6. Spermieproduktionen kompletteras av larvstadium 4 (L4) av utvecklingen, varefter oocyter produceras under vuxenlivet. Sperman lagras i den spermatheca där de gödslar oocyter att generera embryon.
Det finns flera genetiska och miljömässiga faktorer som kan påverka könsceller utveckling i C. elegans som resulterar i förändringar i antalet kärnor, antal apoptotiska händelser, kromosom dynamik, och proteinuttryck eller lokalisering7 ,8,9,10,11. Analysen av dessa evenemang kräver identifiering av varje etapp av differentiering baserad på kärnkraft morfologi och distribution. För att korrekt analysera dessa parametrar manuellt med en stor urvalsstorlek är arbetskrävande och tidsödande. För att kringgå dessa nackdelar och aktivera konsekvens av analys, vi utvecklat en automatiserad metod för tredimensionella undersökning av den C. elegans könsceller för kärnor räkna, kärnor distribution, proteinuttryck, och cytoskeletal struktur. Genom att kombinera konfokalmikroskopi med tredimensionell rendering, genererade vi storlek och form parametrar för identifiering av varje etapp av bakteriecellen differentiering. Denna metod gör dessutom räkna av bakteriecellen kärnor och spermier plus poängsättning av kromosom nummer i varje äggcell.
En avgörande struktur i könsceller är cytoskelettet, som ger stabilitet till könsceller fack, aids cytoplasmiska streaming och skydd till könsceller kärnor12. Använda computational rendering, vi utfört tredimensionell rekonstruktion av könsceller cytoskelettet och identifierade distinkta cytoskeletal funktioner inom könsceller. Här beskriver vi ett stegvisa protokoll för att illustrera hur beräkningsinriktad analys i kombination med confocal imaging möjliggör omfattande analys av de C. elegans könsceller.
Vi föreslår en snabb metod för tredimensionell analys av C. elegans könsceller (figur 1). Med hjälp av tredimensionell analys är det möjligt att studera tredimensionell distribution av könsceller atomkärnor (figur 2 och figur 3), automatiserad rösträkningen celler (figur 2), rekonstruktion av könsceller cellskelettet ( Figur 3), distribution av proteiner (figur 4) och scoring antalet spermier i spermatheca och kromosomer i oocyter (figur 5). Metoden inte bara möjliggör enkel och exakt kvantifiering av könsceller men identifierar fysiologiskt relevanta fenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning och mask djurhållning
Obs: Se Tabell av material för all produktinformation.
- OP50 Escherichia coli kultur: kultur OP50 bakterier i Lysogeny buljong (LB) (1% trypton, 0,5% jäst, 0,5% NaCl, pH 7,0) över natten vid 37 ° C utan antibiotika.
- Utsäde 400 µL av OP50 bakterier att nematoder tillväxtplattor media (NGM) (1,5 g NaCl, 8.5 g agar, 1,25 g pepton, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL av 5 mg/mL kolesterol i etanol, 1 mL 1 M MgSO4 och 25 mL 1 M KPO4 bufferten) och luft torka bakterierna för 48 h.
- Plocka maskar på seedade NGM tallrikar och inkubera vid 15 ° C eller 20 ° C.
- För analysen av de vuxna hermafrodit könsceller, plocka välnärda L4 maskar till bakteriella gräsmattan och inkubera över natten vid 20 ° C.
- För scoring spermier nummer i hermafroditer, inkubera L4 maskar vid 20 ° C i 12 h tills maskarna når den L4/vuxen molt. Om du vill synkronisera maskar till L4 scenen, förbereda ägg genom att plocka vuxna maskar med en massa ägg i blekmedel lösning (1 M NaOH och blekmedel i förhållandet 1:1). Låt äggen att kläckas och plocka L4 djur för experimentet.
- Förbereda Teflon objektglas genom att placera 25 µL poly-L-lysin lösning i bilden och sprida lösningen väl, använder en pipettspetsen. Efter att ta bort överflödig poly-L-Lysin med pappershandduk, låta bilderna ska lufttorka och inkubera bilderna vid 65 ° C i 15-20 min.
2. könsceller dissektion och färgning6,13
- Spot 10 µL 0,01% tetramisole (narkos) på ett 22 mm × 22 mm täckglas och plocka en - dag-gammal vuxna maskar in i den.
- Dissekera masken på svansen som det blir drogad med hjälp av en spruta (5 mL) och en nål (24 ”x 1”), och se till att könsceller inte är skadad.
Obs: Dissektionen måste utföras innan masken blir helt paralyserade så att undertrycket i masken och mask rörelsen stöd utslungning av könsceller. För scoring spermier, måste försiktighetsåtgärder vidtas för att inte skada spermatheca av nålen under dissektion. Undvik att vidröra könsceller med nålen utom dissektion poängen efter spermatheca. Om det finns bryta i könsceller facket eller utsläpp från könsceller observeras, bör könsceller inte användas för analys. - Placera det inverterade täckglaset på en poly-L-lysin belagda bild, hålla den dissekerade könsceller i bilden.
- Ta bort överflödig vätska under täckglaset genom att placera ett papper torn i ett hörn av täckglas och sedan plats bilden i flytande kväve för 1 min. snabbt bort den täckglas med hjälp av en nål med germlines på bilden.
- Överför bilderna till-20 ° C metanol för 30-60 s i en kammare, då Inkubera i 30 min i nylagade fastställande lösning (1 x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) innehållande 0,08 M HEPES pH 6,9, 1,6 mM MgSO4, 0,8 mM etylenglykol-bis(beta-aminoethyl eter)-N, N, N', N'-tetraacetic acid (EGTA) och 3,7% PARAFORMALDEHYD) vid rumstemperatur.
- Tvätta bilderna genom att placera i en kammare som innehåller 1 x PBS, pH 7,4 med 0,1% Tween-20 för 10 min. Upprepa detta en gång.
- Blockera germlines med 30 µL blockerande lösning (30% av geten serum förberett genom att lägga till 900 µL av geten serum i 1700 µL destillerat H2O och 300 µL 10 x PBS) i en fuktig kammare förberett genom att placera vått hushållspapper i en plastlåda i rumstemperatur i 30 min.
- Tillsätt 50 µL av REC-8 antikropp lösning beredd enligt 30% get serum i en baserat 1:300 till varje prov. Inkubera över natten vid 4° C.
- Tvätta bilderna genom att placera i en kammare som innehåller 1 x PBS med 0,1% Tween-20 för 10 min. Upprepa detta en gång och ta bort överflödig vätska genom att placera en pappershandduk i hörnet av bilden.
- Förbereda sekundär antikropp lösning genom att späda gröna fluorophore (488 nm utsläpp våglängd) konjugerade sekundär antikropp (1: 1000), phalloidin (aktin fläck, 1:4000) och DAPI (DNA fläck, 1:4000) i 30% normala get serum.
- Tillsätt 50 µL av sekundär antikropp lösning till bild.
- Inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta bilderna två gånger genom att placera i en kammare som innehåller 1 x PBS med 0,1% Tween-20 för 10 min. torka bort överflödig vätska.
- Tillsätt 30 µL fastställande reagens in i bilden och placera en 12 mm2 x 1,5 µm täckglas på toppen och torka bilderna vid 4 ° C över natten.
3. konfokalmikroskopi
- Slå på de confocal Mikroskop, lasrar, resonant scanner och confocal Mikroskop mjukvaran. Placera glasen med färgade germlines på bildhållaren ovan 63 X målet.
- Leta upp en könsceller, fokus på toppen av könsceller och markera den med confocal Mikroskop mjukvaran. På samma sätt fokusera på botten av könsceller och markera den för att fastställa totala könsceller tjocklek.
- Bild av hela könsceller genom att definiera tjockleken på varje skiva upp till 0,5 µm. Markera komplett könsceller och börja förvärvet. Skanna varje skiva 8 gånger och genomsnittliga värdena för att förbättra bildkvaliteten. Resonant skannern kommer att möjliggöra snabb skanning för att undvika blekning under imaging. Om Mikroskop inte har en resonant scanner, minska antalet till fyra att undvika blekning.
4. inlägg Imaging analys av kärnor antal och fördelning
Obs: Se kompletterande Figur1 för skärmdumpar av programvaruverktyg och knappar som används.
- Importera bilden till Imaris 8.4.1 eller senare versioner av programvaran.
- Definiera mitotiska regionen, övergångszonen, meiotiska region, äggcell regionen och spermatheca av könsceller genom att identifiera kärn morfologi i varje region.
- Använda knappen yta funktion (kompletterande figur 1A) av programvaran för att markera området av intresse.
- Avbryta guiden automatisk ytan skapa och manuellt rita regionen av intresse på de första och sista bit av bilden från tredimensionella stacken.
- Klicka på skapa ytan.
Obs: Programvaran kommer automatiskt att utveckla stackarna mellan första och sista stack. - Maskera alla kanaler utom DAPI maskkanalen knappen (Kompletterande figur 1B-C).
- Definiera nukleära storlek parametrar använda knappen plats funktion (kompletterande figur 1A). Definiera en XY diameter av 2 µm för mitotiska regionen, medan Z diameter odefinierad. För övergångszonen, definiera en XY diameter av 2 µm och Z diameter som 1,5 µm. (kompletterande figur 1 d).
Obs: Felsöka diametrarna enligt förstoring och specifikationer av mikroskopet. För det nuvarande protokollet, syftet används 63 X och statist 1,70 gånger förstoring under imaging. Om målet ändras, till exempel 40 X, bör diametrarna ändras i enlighet därmed. Felsökning bör utföras med vildtyp germlines att upprätta korrekta parametrar. Mitotiska regionen en vildtyp könsceller arm har cirka 250 kärnor. Diameter bör ändras för att uppnå detta värde. Använd minst 15 germlines för att fastställa det optimala värdet för diametern. Ett liknande tillvägagångssätt kan användas för att kalibrera den övergångszonen (150-170 kärnor) och meiotiska region (600-700 kärnor). - Begränsa detektion av ställen genom att definiera den lägsta beloppsgräns (kompletterande figur 1E). Användning DAPI målat vilda typ germlines för att fastställa lägsta tröskel genom att öka tröskeln för minsta tredimensionell rendering tills första plats visas utanför könsceller.
- Spara bilden och få antalet kärnor från tabellen genereras automatiskt av programvaran. Exportera bilderna som TIF-filer.
5. bokföra Imaging analys för Scoring spermier och kromosom nummer
- Utföra tredimensionell rendering genom att välja spermatheca som regionen av intresse. Att upptäcka varje spermier, definiera den plats diametern mellan 0,75 - 1,0 µm för X och Y-axeln, medan Z diameter är odefinierad. Använd knappen ställen funktion som kompletterande figur1.
- Subtrahera bakgrunden genom att kryssa i bakgrunden subtrahera box och använda bakgrunden korrigering värden som beräknas av programmet (kompletterande figur 1 d).
Obs: Imaris programvara plockar högintensiv punkter först, därför effekten av bakgrunden är minimal så länge det finns betydande skillnad mellan regionen av intresse och bakgrunden. En annan metod är att definiera bakgrundskorrektion manuellt tillämpliga värden kan ges för bakgrunden. Manuell bakgrundskorrektion är lämpligt om intensiteten i oberoende prover behöver jämförelse. - Justera tröskeln tredimensionell rendering för att upptäcka alla DAPI målat spermier i spermatheca (kompletterande figur 1E).
- Definiera den plats diametern för kromosom räkna, < 0,75 µm för X och Y-axeln innan utveckla tredimensionella modeller.
- Spara bilden och exportera som TIF-fil.
6. bokför Imaging analys för Cytoskeletal rekonstruktion av könsceller
- Identifiera regionen av intresse i könsceller och maskera alla kanaler utom phalloidin knappen maskera kanaler .
- Definiera en yta detalj 0,25 μm med hjälp av surface funktionsknappen (kompletterande Figur1).
Obs: Detta innebär att varje 0,25 µm kommer att återges i tredimensionella modeller. Yta detalj kan vara konstant för någon region i könsceller där en tredimensionell yta modell kommer att skapas för varje 0,25 µm. Dock för regionen äggcell, surface detalj kan ökas till 0,35 - 0,5 µm på grund av förekomsten av väldefinierade aktin fibrer i denna region. - Subtrahera bakgrunden genom att kryssa i bakgrunden subtrahera box och använda bakgrunden korrigering värden som beräknas av programmet (kompletterande figur 1 d).
- Justera tredimensionell rendering tröskelvärdet beroende på den struktur som kräver analys (kompletterande figur 1E).
- Spara den utvecklade tredimensionell bilden och exportera som en TIF-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar den tid som krävs för tredimensionella könsceller analys. L4 hermafroditer inkuberas vid 20 ° C var dissekeras för att isolera germlines och färgas med DAPI, phalloidin och antikroppar mot könsceller proteiner. Germlines är avbildade med konfokalmikroskopi. Färgning och confocal microscopy kräver cirka 24 h. beräkningsinriktad analys för den komplett könsceller kräver 10-15 min att räkna antal och placering av atomkärnor, identifiera protein fördelningen, analysera cytoskeletal struktur och Poäng den antalet spermier. Fullständig manuell analys kräver över 2 h per könsceller och omfattas av förarens påverkan, därför vår automatiserade hög genomströmning metod minskar tid som analys och förbättrar reproducerbarhet.
Automatiserad atomkärnor scoring avslöjar som en könsceller arm rymmer ca 1 000-1 200 kärnor (figur 2C), motsvarande väl med tidigare publicerade manuell poängsättning data1. Används (figur 2D-G) att bekräfta riktigheten av scoring, flera mutanter och olika villkor. Vi jämförde exempelvis rnp-8(tm435), cpb-3(bt17)och glp-1(e2141) mutant maskar till vildtyp djur. Automatiserad räknar reproduceras kända minskningen av antalet kärnor i cpb-3 och glp-1 mutant germlines14,15,16,17. En allvarlig minskning av atomkärnor nummer observerades också i glp-1(e2141) temperaturkänsliga mutant när inkuberas vid 25 ° C. Fördelningen av atomkärnor beror på scenen av differentiering. Mitotiska regionen, som innehåller cirka 250 kärnor i vildtyp, är tätt packad med kärnor jämfört med resten av könsceller (figur 3)1. Avståndet mellan mitotiska kärnor är minimal och kärnor finns över hela regionen mitotiska. När atomkärnor flyttar bort från distala änden, visas de dock mer mot omkretsen av könsceller (figur 3). Förändringen i distributionen börjar övergångszonen och Slutför när atomkärnor in meios/pachytene.
Könsceller har specifika cytoskeletal strukturer i olika skeden av differentiering. Vi visualiseras F-aktin genom färgning av könsceller med phalloidin. Distribution av F-aktin från den distala till proximala ände könsceller var tydlig på varje region (figur 3 och figur 5). I allmänhet finns det två separata strukturer som visas som en 'cylinder inom cylinder.' På den mitotiska regionen visas inre aktin som en fast massa med en specifik form (figur 3). Som könsceller når övergångszonen, inre actin förutsätter en mer cylindrisk struktur och det blir en ihålig cylinder som den når slutet pachytene. Det andra lagret av aktin täcker det inre lagret ger form till könsceller. Här 'cylinder inom cylinder' aktin strukturen försvinner mot regionen äggcellen (figur 5). På regionen äggcell visas aktin som tjocka fibrer. Oocyterna skiljs åt av en aktin rachis, även om det verkar vara dynamiska att tillåta förflyttning av oocyter till spermatheca. Slutligen, aktin i spermatheca också bildar tjocka buntar av aktin fibrer. Fibrerna tycks dock vara förpackade närmare än i regionen äggcellen. Den cytoskeletal strukturen tycks komplettera distribution mönster av atomkärnor (figur 3). På den mitotiska regionen verkar kärnorna placeras runt inre aktin strukturen. Som de når meios/pachytene, organisera kärnorna mellan två aktin cylindrarna lämnar mitten av könsceller mestadels saknar kärnor (figur 3). Detta kunde förmodligen hjälpa oavbruten cytoplasmiska streaming i könsceller. Germlines var målat med en antikropp mot proteinet REC-8 och analyseras av konfokalmikroskopi. REC-8 är är homogent fördelade runt tidigt kärnor av könsceller och senare klyvs och förstörd under meios18. REC-8 distribution i tredimensionella tvärsnittsdata analys av könsceller visar fördelningen av protein i regionen mitotiska (figur 4).
Tredimensionell rendering av den proximala änden av könsceller innehåller spermatheca och tre första oocyter distalt på spermatheca. Vår analys redovisas genomsnitt 151 spermier i varje spermatheca (n = 18). Detta motsvarar den publicerade litteraturen, som anger tillförlitligheten av metod (figur 5F)19. Denna analys kan utföras tillsammans med cytoskeletal eller protein distributionsstudier. C. elegans genomet är fördelat på sex kromosomer. I fullt utvecklad vildtyp oocyter, dessa kromosomer är synliga och kan räknas. Denna kromosom separation kan användas för att studera kromosom stabilitet eller andra defekter som är associerad med äggcellen utveckling. Antalet kromosomer kan visualiseras genom tredimensionell rendering, och om kromosomerna delas upp korrekt, antalet korrekt kan erhållas (figur 5).
Figur 1 . Tidslinje för automatiserad analys. Tid jämförelse mellan manuell och computational analys av den C. elegans könsceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Atomkärnor distribution i könsceller. (A) DAPI målat könsceller visar mitotiska, övergång och pachytene/meiotiska regioner. (B) computational tredimensionell modell av könsceller. (C) Scoring för det totala antalet kärnor i vildtyp germlines. (D-F) Scoring för antalet kärnor på mitotiska, övergång och meiotiska regioner av vildtyp, rnp-8, cpb-3och glp-1 mutant germlines. (G) jämförelse av totala antalet kärnor i glp-1 mutant vid 20 ° C och 25 ° C. Felstapel representerar medelfelet. Students test. n < 0,0001, ***n < 0,001, **n < 0,01, *n < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Cytoskeletal struktur i könsceller. (A-B) Organisationen av inre aktin (röd) cytoskelettet av könsceller på den mitotiska regionen. Inre actin har en diffus struktur jämfört med yttre aktin på den mitotiska regionen. (C-D) På den pachytene regionen förutsätter cytoskelettet en cylindrisk struktur genom att bilda två cylindrar mellan vilka atomkärnor (blå) är organiserade. (E-F) Organisation av könsceller atomkärnor i regionerna mitotiska och pachytene. Fördelningen av atomkärnor är mer mot omkretsen av den 'germtube' på regionen pachytene jämfört med mitotiska regionen (grön) och mitten av könsceller blivit saknar kärnor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . REC-8 uttryck i regionen mitotiska. (A) Mikrograf visar den distala änden av en REC-8-färgade könsceller. (B-C) Tredimensionell rendering av REC-8 färgning (visas i blått) och distribution av protein mellan den mitotiska kärnan (grön). REC-8 färgning är mindre riklig proximalt regionen mitotiska (markerad med vita prickar som representerar kärnor). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Könsceller struktur på den proximala änden. (A) DAPI färgning av könsceller på den proximala änden. (B) tredimensionell rendering av DAPI färgning visar spermier i spermatheca (gul) och kromosomer i oocyterna (vit). (C-E) Tredimensionella cytoskeletal struktur på den proximala änden av könsceller. Röda märken komplett proximala ände och grönt markerar spermatheca. Cross sectional analys visar att cytoskelettet inte bara bildar en trådformiga struktur av aktin runt oocyter, men också skiljer mellan oocyter. (F) diagram som visar antalet spermier i varje spermatheca och genomsnittet erhålls från flera spermatheca (n = 18). Felstapel representerar medelfelet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande bild 1 . Programvara verktyg Beskrivning. (A) ställen, en yta verktyg för att upptäcka kärnor och protein färgning. (B-C) Urvalet av tredimensionella regionen av intresse med hjälp av verktyget yta. (D) fastställa XY-diameter, verktyget ställen, för identifiering av atomkärnor. Beroende på regionen av intresse och färgning, kan z-axel diameter och bakgrunden korrigeringen användas. (E) minsta och högsta stödnivå tröskel upptäckt. Ett liknande tillvägagångssätt kan användas för surface funktion där istället för att definiera diameter och ytbehandla detaljerna kan definieras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med detta protokoll är att förbättra noggrannheten och minska tiden som krävs för könsceller analys. Efter standardpreparatet av dissekerade germlines, är en tredimensionell modell av könsceller atomkärnor utarbetats av computational rendering. Samtidigt som observationen av könsceller atomkärnor fördelning i rymden, beräknar tredimensionell rendering antalet kärnor på specifika regioner i könsceller. Den kritiska faktorn i vår metod är exakt definition av storlek och form parametrar av atomkärnor. Detta beror på tydlighet av färgning och förstoring används till bild. Vi bekräftade riktigheten av metoden genom att jämföra publiceras manuellt analyseras data1. För att ytterligare bekräfta riktigheten i vår metod, vi använde flera mutanter under olika förhållanden och bekräftade resultaten med publicerad litteratur. Det bekräftade också att metoden att upptäcka subtila och stark fenotyper - cpb-3 och glp-1 mutanter, respektive. Denna metod visar dessutom anpassningsförmåga till förändringar i atomkärnor storlek och form inom könsceller eller ens mellan stammar. Denna egenskap kan även identifiering och poängsättning av mindre strukturer i könsceller som kromosomer och spermier. Metoden kan också ytterligare felsökning för parametrar som storlek och form, om det behövs. Vår analys kunde klarlägga fördelningen av atomkärnor i könsceller och visade att atomkärnor i mitotiska och pachytene regioner är organiserade i olika mönster. Genom att tillämpa tredimensionell rendering till REC-8 och DAPI färgning, visade vi också fördelningen av REC-8 inom kärnor av mitotiska regionen.
Tredimensionell rendering av aktin färgning aktiverat detaljerad granskning av könsceller cytoskeletal strukturer. Könsceller verkar ha två separata aktin strukturer, även om de hävdar fysisk kontakt. Återuppbyggnaden av cytoskelettet för den hela könsceller är möjligt som en enda enhet, bästa resultat kan erhållas om regionerna av intresse är vidare till mitotiska, övergång, och meiotiska regioner. Distala könsceller cytoskelettet har en odefinierad form och utvecklas till en trådformiga struktur på den proximala änden. Våra protokoll kan därför tredimensionell rekonstruktion av könsceller aktin cytoskelettet genom att definiera särskilda parametrar för att rymma skillnader i aktin distribution. Den mest kritiska aspekten av analysen är definitionen av parametrarna som kärnor storlek och yta detalj krav. Programvaran för att plocka ljuspunkter inom atomkärnor som separata objekt riskerar att sänka storleken kärnor nedanför den faktiska storleken. Likaså kommer att höga yta detaljer värden leda till förlust av exakta tredimensionella strukturer. Den föreslagna metoden är beroende av precisionen för dissektion och kvaliteten på könsceller färgningen. En skadad könsceller kan leda till frigöraren av kärnor från de könsceller, orsakar felaktig numrering. Hög bakgrund från färgningen kommer också orsaka felaktig atomkärnor greven och felaktig tredimensionell rendering.
Vår metod utökar tidigare kända automatiserade analysmetoder könsceller där vi har möjlighet att analysera kärnor antal och fördelning/uttryck av könsceller proteiner i utrymme med en enda protokoll20. För det andra, vår metod möjliggör poängsättning av mindre strukturer såsom kromosomer inom könsceller. Kromosomsegregering är en viktig aspekt av äggcell utveckling21. Med vår metod, är det möjligt att upptäcka antal och placering av kromosomer där avståndet kan definieras genom att kalibrera mot vildtyp oocyter. Någon mutation som påverkar kromosom separation kan studeras med hjälp av detta verktyg. Metoden kan också utvidgas till att studera kromosomer i embryon i 2-cellstadie. Computational analys ger också antalet spermier i spermatheca, antal kromosomer i en äggcell och könsceller cytoskeletal strukturer. Sammantaget ger metoden omfattande analys av de C. elegans könsceller med ett enda protokoll samtidigt minska analys tid avsevärt. Metoden eliminerar behovet av flera verktyg för varje analys (kärnor protein fördelning, och cytoskeletal struktur) och tar bort kodning tidsåtgången i någon särskild programvara. Slutligen, denna metod effektivt utökas till andra mask studier inklusive tredimensionella analysen av sederad levande maskar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar Monash Microimaging för deras tekniska support. Vissa stammar tillhandahölls av stadens Caenorhabditis genetik, som är finansierad av NIH Office infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440). Detta arbete stöddes av en Monash University biomedicin Discovery gemenskap, NHMRC projektbidrag (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) och veski innovation fellowship: VIF 23 till Roger Pocock.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
References
- Hubbard, E. J. Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology. Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).
- Kershner, A., et al. Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).
- Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (2), 88372 (2014).
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).
- Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crittenden, S. L., et al. A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans. Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).
- Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).
- Schumacher, B., et al. Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis. Cell. 120 (3), 357-368 (2005).
- McMullen, P. D., et al. Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress. PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).
- Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. Physiological control of germline development. Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).
- Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).
- Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development. Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).
- Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development. Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).
- Austin, J., Kimble, J. glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell. 51 (4), 589-599 (1987).
- Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors. Development. 124 (4), 925-936 (1997).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).
- Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
- Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).
- Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells. Development. 139 (5), 859-870 (2012).
- Laband, K., et al. Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes. Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).
