Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

doi: 10.3791/57702 Published: April 19, 2018

Summary

We presenteren een geautomatiseerde methode voor driedimensionale wederopbouw van de Caenorhabditis elegans germline. Onze methode bepaalt het aantal en de positie van elke kern binnen de kiemcellen en analyses germline eiwit distributie en cytoskeletal structuur.

Abstract

De germline Caenorhabditis elegans (C. elegans) wordt gebruikt om verschillende biologisch belangrijke processen, met inbegrip van de cel van de stam ontwikkeling, apoptosis en chromosoom dynamiek te bestuderen. Terwijl de germline een uitstekend model is, is de analyse vaak twee dimensionale als gevolg van de tijd en de arbeid die nodig is voor de drie-dimensionale analyse. Grote uitlezingen in dergelijke studies zijn de nummer/positie van kernen en eiwit spreiding in de kiemcellen. Hier presenteren we een methode voor het uitvoeren van de geautomatiseerde analyse van de confocal microscopie en computationele benaderingen gebruiken om te bepalen van het aantal en de positie van de kernen in elke regio van de germline germline. Onze methode analyseert ook germline eiwit distributie waarmee het driedimensionale onderzoek van eiwituitdrukking in verschillende genetische achtergronden. Onze studie toont verder variaties in cytoskeletal architectuur in verschillende regio's van de germline die rekening met specifieke eisen voor ruimtelijke ontwikkeling houden kan. Tot slot, onze methode kunt geautomatiseerde tellen van de zaadcellen in de spermatheca van elke germline. Tezamen, maakt onze methode een snelle en reproduceerbare fenotypische analyse van de C. elegans germline.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De instandhouding van de signalering trajecten met zoogdieren maakt C. elegans een uitstekend model voor het bestuderen van meerdere biologische processen1,2. In ons lab gebruiken we de C. elegans germline te bestuderen van de cel van de stam ontwikkeling, apoptosis en genexpressie. Terwijl de germline een driedimensionale structuur is, zijn veel studies twee dimensionale het tijdrovend en arbeidsintensief karakter van drie-dimensionale analyse. Het is zeer waarschijnlijk dat de twee-dimensionale analyse in vivo gebeurtenissen in de kiemcellen kan verkeerd. De volwassen hermafrodiet van C. elegans heeft twee germline armen, die elk een somatische distale tip-cel (DTC) die distale kiemcellen in een ongedifferentieerde staat3,4 onderhoudthuizen. Deze geslachtscellen beginnen te onderscheiden als ze verder weg van de DTC, ontsnappen aan haar invloed, en worden eicellen en sperma als ze het proximale einde van de germline bereikt. Tijdens dit proces ondergaan kiem celkernen mitose, vóór de overgang naar de meiose5,6. Productie van zaadcellen wordt gecompleteerd door larvale stadium 4 (L4) van de ontwikkeling, waarna eicellen worden geproduceerd tijdens de volwassenheid. De zaadcellen worden opgeslagen in de spermatheca waar ze eicellen bevruchten tot embryo's.

Er zijn meerdere genetische en ecologische factoren die invloed kunnen uitoefenen op germline ontwikkeling in C. elegans wat resulteert in veranderingen in het aantal kernen, aantal apoptotic evenementen, de dynamiek van het chromosoom, en eiwit expressie en/of lokalisatie7 ,8,9,10,11. De analyse van deze gebeurtenissen vereist de identificatie van elke fase van differentiatie op basis van nucleaire morfologie en distributie. Om deze parameters handmatig met de grootte van een grote steekproef nauwkeurig te analyseren is arbeidsintensief en tijdrovend. Om deze nadelen te omzeilen en om de consistentie van analyse, ontwikkelden we een automatische methode voor driedimensionale onderzoek van de C. elegans germline voor kernen tellen, kernen distributie, eiwit expressie, en cytoskeletal structuur. Door het combineren van confocale microscopie met driedimensionale rendering, we genereerden grootte en vorm parameters voor de identificatie van elk stadium van de kiem celdifferentiatie. Deze methode kan verder tellen van geslachtscellen kernen en sperma plus scoring van chromosoom nummer in elke oöcyt.

Een cruciale structuur in de kiemcellen is het cytoskelet, waarmee de stabiliteit germline compartiment aids cytoplasmatische streaming en bescherming tot germline kernen12. Met behulp van computationele rendering, we drie-dimensionale reconstructie van het cytoskelet germline uitgevoerd en afzonderlijke cytoskeletal functies binnen de germline geïdentificeerd. Hier beschrijven we een stapsgewijze protocol om te illustreren hoe computationele analyse gecombineerd met confocal imaging maakt uitgebreide analyse van de C. elegans germline.

Wij stellen voor een snelle methode voor de drie-dimensionale analyse van C. elegans germline (Figuur 1). Met behulp van drie-dimensionale analyse, is het mogelijk om te studeren het driedimensionale distributie van germline kernen (Figuur 2 en Figuur 3), geautomatiseerde tellen van cellen (Figuur 2), reconstructie van het cytoskelet germline ( Figuur 3), distributie van eiwitten (Figuur 4), en het aantal zaadcellen in de spermatheca en chromosomen in eicellen (Figuur 5) scoren. De methode kan niet alleen gemakkelijk en nauwkeurig kwantificering van de germline maar identificeert fysiologisch relevante fenotypen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. voorbereiding en Worm veehouderij

Opmerking: Raadpleeg Tabel van materialen voor alle productinformatie.

  1. OP50 Escherichia coli cultuur: cultuur van OP50 bacteriën in lysogenie Bouillon (LB) (1% trypton gist van 0,5%, 0,5% NaCl, pH 7,0) 's nachts bij 37 ° C zonder antibiotica.
  2. Zaad van 400 µL van OP50 bacteriën aan nematode groei media (NGM) platen (1,5 g NaCl, 8,5 g agar, 1,25 g pepton, 1 mL van de 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 mL van de 1 M MgSO4 en 25 mL van de 1 M KPO4 buffer) en lucht drogen de bacteriën voor 48 uur.
  3. Kies wormen op geplaatste NGM platen en Incubeer bij 15 ° C of 20 ° C.
    1. Voor de analyse van de volwassen hermafrodiete germline, kies weldoorvoede L4 wormen aan het bacteriële gazon en na een nacht bebroeden bij 20 ° C.
    2. Voor het scoren van sperma nummer in hermafrodieten, incubeer L4 wormen bij 20 ° C gedurende 12 uur totdat de wormen bij de L4/volwassene molt. Als u wilt synchroniseren de wormen naar het werkgebied L4, bereiden eieren door het plukken van volwassen wormen met een heleboel eieren in bleekwater oplossing (1 M NaOH en bleekmiddel in 1:1 verhouding). Laat de eieren uitkomen en pick L4 dieren ten behoeve van het experiment.
  4. Teflon Microscoop dia's voor te bereiden door het plaatsen van 25 µL van poly-L-lysine oplossing op de dia en verspreiden de oplossing goed, met behulp van een pipet tip. Na het verwijderen van overtollige poly-L-lysine met papieren handdoek, kunt u de dia's te droge lucht en Incubeer de dia's bij 65 ° C gedurende 15-20 min.

2. Germline dissectie en kleuring6,13

  1. Ter plaatse 10 µL van 0,01% tetramisole (verdoving) op een 22 mm × 22 mm dekglaasje aan en pluk één - dag oud volwassen wormen erin.
  2. Ontleden van de worm aan de staart, als het wordt verdoofd met behulp van een injectiespuit (5 mL) en een naald (24 "x 1"), en ervoor te zorgen dat de germline niet is beschadigd.
    Opmerking: De dissectie moet worden uitgevoerd voordat de worm wordt volledig verlamd zodat de negatieve druk in de worm en de worm beweging steun het uitwerpen van de kiemcellen. Voor het scoren van sperma, moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen om niet te beschadigen de spermatheca door de naald tijdens dissectie. Raak de germline met de naald met uitzondering van de dissectie-punt na de spermatheca. Als er in het compartiment germline breken of een lozing van de germline wordt waargenomen, moet de germline niet worden gebruikt voor analyse.
  3. De omgekeerde dekglaasje aan op een poly-L-lysine gecoate dia, houden de ontleed germline op de dia te plaatsen.
  4. Verwijder overtollige vocht onder het dekglaasje aan door het plaatsen van een toren van papier op een hoek van het dekglaasje aan en plaats de dia in vloeibare stikstof voor 1 min. snel het dekglaasje aan met behulp van een naald met de germlines op de dia verwijderen.
  5. Breng de dia's in methanol van-20 ° C voor 30-60 s in een kamer en incubeer gedurende 30 min. in vers bereide fixing oplossing (1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,08 M HEPES pH 6,9, 1,6 mM MgSO4, 0.8 mM ethyleen glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-Dinatriumethyleendiaminetetra zuur (EGTA) en 3,7% paraformaldehyde) bij kamertemperatuur.
  6. Wassen van de dia's door in een cupje met 1 x PBS, pH 7.4 te plaatsen met 0,1% Tween-20 voor 10 min. Herhaal deze stap eenmaal.
  7. Blokkeren van de germlines met 30 µL van het blokkeren van de oplossing (30% van de geit serum bereid door toevoeging van 900 µL van geit serum in 1700 µL van gedistilleerd H2O en 300 µL van 10 x PBS) in een vochtige kamer voorbereid door het plaatsen van natte papieren handdoek in een plastic doos bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  8. Voeg 50 µL van REC-8 antilichaam oplossing bereid in 30% geit serum in een verhouding 1:300 aan elk monster. Na een nacht bebroeden bij 4° C.
  9. Wassen van de dia's door te plaatsen in een cupje met 1 x PBS met 0,1% Tween-20 voor 10 min. de stap eenmaal herhaald en verwijderen van de overtollige vloeistof door het plaatsen van een papieren handdoek op de hoek van de dia.
  10. Bereid secundair antilichaam-oplossing door het verdunnen van groene fluorophore (488 nm emissie golflengte) geconjugeerd secundair antilichaam (1:1000), phalloidin (actine vlek, 1:4000) en DAPI (DNA vlek, 1:4000) in 30% normale geit serum.
  11. 50 µL van secundair antilichaam oplossing aan de dia toevoegt.
  12. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  13. Wassen van de dia's tweemaal door te plaatsen in een cupje met 1 x PBS met 0,1% Tween-20 voor 10 min. veeg overtollige vocht.
  14. Voeg 30 µL van de vaststelling van de reagens in de dia verschijnt en plaats een 12 mm2 x 1,5 µm dekglaasje aan op bovenkant en dia's bij 4 ° C's nachts droog.

3. confocale microscopie

  1. Inschakelen van de confocal microscoop, lasers, resonant scanner en confocal microscoop software. De dia's met gekleurde germlines plaats op de dia houder boven de 63 X-doelstelling.
  2. Zoek een germline, focus op de bovenkant van de kiemcellen en markeren met behulp van de confocal microscoop software. Ook richten op de bodem van de kiemcellen en markeren om de totale germline dikte.
  3. Beeld de hele germline door het definiëren van de dikte van elk segment tot 0,5 µm. Mark de volledige germline en verwerving van start. Scan van elk segment 8 keer en de gemiddelden om beeldkwaliteit te verbeteren. De resonerende scanner toestaat snel scannen om te voorkomen dat bleken tijdens imaging. Als de Microscoop beschikt niet over een resonante scanner, verminderen het aantal scans naar vier te vermijden bleken.

4. post Imaging analyse van kernen aantal en de verdeling

Opmerking: Raadpleeg aanvullende figuur 1 voor screenshots van de hulpmiddelen van de software en de knoppen gebruikt.

  1. Importeer het image Imaris 8.4.1 of latere versies van de software.
  2. Mitotische regio, overgangszone, Meiotische regio, oöcyt regio en spermatheca van de germline definiëren door het identificeren van de nucleaire morfologie in elke regio.
  3. Gebruik de oppervlakte functieknop (aanvullende figuur 1A) van de software om te selecteren van de regio van belang.
  4. Automatische oppervlakte creatie wizard annuleert en handmatig tekenen de regio van belang bij het eerste en het laatste segment van de afbeelding van de drie-dimensionale stack.
  5. Klik op maken oppervlak.
    Opmerking: De software zal automatisch de stapels tussen de eerste en laatste stack ontwikkelen.
  6. Alle kanalen, behalve DAPI maskeren door te klikken op de knop van het masker kanaal (Aanvullende figuur 1B-C).
  7. Nucleaire grootte parameters met behulp van de plek functieknop (aanvullende figuur 1A) definiëren. Voor de mitotische regio, definieert u een XY-diameter van 2 µm terwijl Z diameter undefined. Definiëren voor het overgangsgebied, een diameter van 2 µm van XY en Z diameter als 1,5 µm. (aanvullende figuur 1 d).
    Opmerking: Problemen oplossen met de diameters volgens de vergroting en de specificaties van de Microscoop. Voor het huidige protocol, het doel gebruikt was 63 X en voorzien van een extra 1,70 keer vergroting tijdens imaging. Als de doelstelling, bijvoorbeeld 40 X verandert, moeten de diameters dienovereenkomstig worden gewijzigd. Oplossen van problemen moet worden uitgevoerd met wildtype germlines om vast te stellen van de juiste parameters. De mitotische regio voor een wild type germline arm heeft ongeveer 250 kernen. De diameter moet worden gewijzigd om deze waarde. Gebruik ten minste 15 germlines om te bepalen van de optimale waarde voor de diameter. Een soortgelijke benadering moet worden gebruikt voor het kalibreren van de overgangszone (150-170 kernen) en Meiotische regio (600-700 kernen).
  8. Het opsporen van plekken beperken door het definiëren van de minimumdrempel (aanvullende figuur 1E). Gebruik DAPI gekleurd wild type germlines om vast te stellen minimum drempel door verhoging van de drempel van de minimale driedimensionale weergave totdat de eerste plek buiten de germline verschijnt.
  9. Sla de afbeelding en het aantal kernen ophalen uit de tabel automatisch door de software gegenereerd. De beelden als TIF-bestanden exporteren.

5. post Imaging analyse voor het scoren van sperma en aantal chromosomen

  1. Driedimensionaal renderen uitvoeren door het selecteren van de spermatheca als de regio van belang. Wilt detecteren elke sperma, definieert u de plek diameter tussen 0,75 - 1.0 µm voor X en Y-as, terwijl Z diameter ongedefinieerd blijft. Gebruik de functieknoppen van de plekken zoals in aanvullende figuur 1.
  2. Aftrekken van de achtergrond door tikt achtergrond aftrekken vak en het gebruik van correctie achtergrondwaarden berekend door de software (aanvullende figuur 1 d).
    Opmerking: Imaris software picks hoge intensiteit punten eerst, dus het effect van de achtergrond is minimaal, zolang er is significant verschil tussen de regio van belang en de achtergrond. Een tweede methode is om handmatig de achtergrondcorrectie definiëren, in voorkomend geval waarden kan worden gegeven voor de achtergrond. Handmatige achtergrondcorrectie dient als de intensiteit van onafhankelijke steekproeven vergelijking moet.
  3. Aanpassen van de driedimensionale weergave drempel om te sporen alle DAPI gekleurd sperma in de spermatheca (aanvullende figuur 1E).
  4. Voor het tellen van chromosoom, bepalen de plek diameter < 0,75 µm voor X en Y-as voor het ontwikkelen van driedimensionale modellen.
  5. De afbeelding opslaan en exporteren als een TIF-bestand.

6. post Imaging analyse voor Cytoskeletal reconstructie van de kiemcellen

  1. Identificeren van de regio van belang in de kiemcellen en alle kanalen, behalve phalloidin te maskeren door te klikken op de knop masker kanalen .
  2. Definieer een oppervlakte detail van 0,25 µm met behulp van de oppervlakte functieknop (aanvullende figuur 1).
    Opmerking: Dit betekent dat elke 0,25 µm wordt weergegeven in drie-dimensionale modellen. Oppervlakte detail kunnen constant voor elke regio van de germline waar een driedimensionaal oppervlak model wordt gemaakt voor elke 0,25 µm. Echter, voor de regio van de oöcyt, oppervlakte detail kan worden verhoogd tot 0.35 - 0,5 µm vanwege de aanwezigheid van welomschreven actine vezels in deze regio.
  3. Aftrekken van de achtergrond door tikt achtergrond aftrekken vak en het gebruik van correctie achtergrondwaarden berekend door de software (aanvullende figuur 1 d).
  4. Driedimensionaal renderen drempel afhankelijk van de structuur die analyse (aanvullende figuur 1E) aanpassen.
  5. De ontwikkelde drie-dimensionale afbeelding opslaan en exporteren als een TIF-bestand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figuur 1 geeft aan dat de tijd die nodig is voor driedimensionale germline analyse. L4 hermafrodieten bij 20 ° C geïncubeerd waren ontleed om te isoleren van de germlines en gekleurd met DAPI, phalloidin en antilichamen tegen germline proteïnen. Germlines zijn beeld met behulp van de confocal microscopie. Kleuring en confocal microscopie vereist ongeveer 24 h. computationele analyse voor de volledige germline 10-15 min vereist te tellen van het aantal en de positie van de kernen, identificeren van de eiwit-verdeling, analyseren van de structuur van de cytoskeletal en de score de het aantal zaadcellen. Volledige handmatige analyse vereist meer dan 2 uur per germline en is onderhevig aan de invloed van de exploitant, daarom onze methode hoge-doorvoer geautomatiseerde vermindert de tijd voor analyse en verbetert de reproduceerbaarheid.

Geautomatiseerd kernen blijkt dat een arm germline ongeveer 1.000-1.200 kernen (Figuur 2C) herbergt, overeenkomend met eerder gepubliceerde handboek gegevens1scoren goed scoren. Om te bevestigen dat de juistheid van het scoren, meerdere mutanten en verschillende omstandigheden worden gebruikt (Figuur 2D-G). We vergeleken bijvoorbeeld, rnp-8(tm435), cpb-3(bt17)en glp-1(e2141) mutant wormen aan wild type dieren. Geautomatiseerde tellen gereproduceerd de bekende vermindering van het aantal kernen in cpb-3 en glp-1 mutant germlines14,15,16,17. Een ernstige afname van de kernen nummer werd ook waargenomen in de glp-1(e2141) temperatuurgevoelige mutant wanneer bij 25 ° c geïncubeerd. De verdeling van de kernen is afhankelijk van de fase van de differentiatie. De mitotische regio, waarin ongeveer 250 kernen in wild type, is zorgvuldig verpakt met kernen in vergelijking met de rest van de kiemcellen (Figuur 3)1. De afstand tussen de mitotische kernen is minimaal en kernen liggen verspreid over de mitotische regio. Echter, zoals de kernen zijn afgestapt van distale einde, ze lijken meer richting de omtrek van de kiemcellen (Figuur 3). De wijziging in de verdeling begint bij het overgangsgebied en voltooit de kernen invoert meiose/pachytene.

De germline heeft specifieke cytoskeletal structuren in de verschillende stadia van differentiatie. We F-actine gevisualiseerd door kleuring van de germline met phalloidin. De verdeling van de F-actine van de distale proximale daartoe van de germline bedroeg onderscheiden elke regio (Figuur 3 en Figuur 5). In het algemeen zijn er twee aparte structuren die verschijnen als een 'cilinder in cilinder.' Aan de mitotische regio verschijnt innerlijke actine als een vaste massa met een bepaalde shape (Figuur 3). Als de germline de overgangszone bereikt, het innerlijke actine veronderstelt een meer cilindrische structuur en wordt een holle cilinder aangezien het laat pachytene bereikt. De tweede laag van actine dekt de binnenlaag vorm te geven aan de kiemcellen. Deze 'cilinder in cilinder' actine structuur verdwijnt naar de oöcyt regio (Figuur 5). Op het gebied van de oöcyt weergegeven actine als dikke vezels. De eicellen worden gescheiden door een actine-Bloemspil, al lijkt het dynamisch aan het verkeer van oöcyten aan de spermatheca. Actin in de spermatheca vormt ten slotte ook dikke bundels van actine vezels. De vezels lijken echter te worden verpakt dichter dan in de regio van de oöcyt. De cytoskeletal structuur wordt weergegeven als aanvulling op de distributiepatronen van kernen (Figuur 3). Op de mitotische regio lijken de kernen worden geplaatst rond de binnenste actine-structuur. Als ze meiose/pachytene te bereiken, organiseren de kernen tussen de twee actine cilinders verlaten van het midden van de germline meestal verstoken van kernen (Figuur 3). Dit kan waarschijnlijk steun ononderbroken cytoplasmatische streaming in de kiemcellen. Germlines werden gekleurd met een antilichaam tegen het eiwit REC-8 en geanalyseerd door confocale microscopie. REC-8 is wordt homogeen verspreid rond vroege kernen van de kiemcellen en later gekloofd en tijdens de meiose18gedegradeerd. REC-8 verdeling in driedimensionale transversale analyse van de germline toont de verdeling van de eiwitten in de mitotische regio (Figuur 4).

Driedimensionale weergave van het proximale einde van de germline omvat de spermatheca en eerste drie eicellen distale aan de spermatheca. Onze analyse erkend gemiddeld 151 sperma in elke spermatheca (n = 18). Dit komt overeen met de gepubliceerde literatuur, met vermelding van de betrouwbaarheid van de methode (Figuur 5F)19. Deze analyse kan worden uitgevoerd samen met cytoskeletal of eiwit verdeling studies. Het genoom van C. elegans is verdeeld over zes chromosomen. In volledig ontwikkelde wild type eicellen, deze chromosomen zijn zichtbaar en kunnen worden geteld. Deze scheiding van chromosoom kan worden gebruikt om te studeren chromosoom stabiliteit of andere gebreken die zijn gekoppeld aan de ontwikkeling van de oöcyt. Het aantal chromosomen kan worden gevisualiseerd door driedimensionale weergave, en als de chromosomen correct gescheiden worden, het nummer worden nauwkeurig bekomen (Figuur 5).

Figure 1
Figuur 1 . Tijdlijn voor geautomatiseerde analyse. Tijdvergelijking tussen handmatige en computationele analyse van de C. elegans germline. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Kernen distributie in de kiemcellen. (A) de DAPI gekleurd germline tonen mitotische, overgang en pachytene/Meiotische regio's. (B) de computationele driedimensionaal model van de kiemcellen. (C) Scoring voor het totale aantal kernen in wild type germlines. (D-F) Scoren voor het aantal kernen op mitotische, overgang en Meiotische regio's wild type rnp-8, cpb-3en glp-1 mutant germlines. (G) de vergelijking van het totale aantal kernen in de glp-1 mutant bij 20 ° C en 25 ° C. Foutbalk vertegenwoordigt standaardfout. Student van de test. n < 0,0001, ***n < 0.001, **n < 0,01, *n < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . Cytoskeletal structuur van de germline. (A-B) Organisatie van het cytoskelet van de innerlijke actine (rood) van de germline op de mitotische regio. De innerlijke actine heeft een diffuse structuur ten opzichte van buitenste actine op de mitotische regio. (C-D) Op de pachytene-regio, het cytoskelet wordt ervan uitgegaan dat een cilindrische structuur door de vorming van twee cilinders waartussen de kernen (blauw) worden georganiseerd. (E-F) Organisatie van germline kernen in de mitotische en pachytene regio's. De verdeling van de kernen is meer richting de omtrek van de 'germtube' op de pachytene-regio in vergelijking met de mitotische regio (groen) en midden van de germline geworden verstoken van kernen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . REC-8 expressie in de mitotische regio. (A) tonen van het distale einde van een REC 8-gebeitste germline opname. (B-C) Driedimensionale weergave van REC-8 kleuring (afgebeeld in het blauw) en de distributie van eiwit tussen de mitotische kernen (groen). REC-8 kleuring is minder overvloedig proximale aan de mitotische regio (gekenmerkt door witte stippen vertegenwoordigen kernen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 . Germline structuur aan het proximale einde. (A) de DAPI kleuring van de germline proximale eind. (B) driedimensionale weergave van DAPI kleuring weergegeven: sperma in de spermatheca (geel) en de chromosomen in de eicellen (wit). (C-E) Driedimensionale cytoskeletal structuur aan het proximale einde van de kiemcellen. Rood markeert de volledige beëindiging van de proximale en groene markeert de spermatheca. Cross-sectionele analyse blijkt dat het cytoskelet niet alleen een draadvormige structuur van actine rond eicellen vormt, maar ook tussen eicellen scheidt. (F) de grafiek met het aantal zaadcellen in elke spermatheca en gemiddelde verkregen uit meerdere spermatheca (n = 18). Foutbalk vertegenwoordigt standaardfout. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Supplementary Figure 1
Aanvullende figuur 1 . Software tools beschrijving. (A) de vlekken en oppervlakte hulpmiddelen voor het opsporen van kernen en eiwit kleuring. (B-C) De selectie van drie-dimensionale regio van belang met het hulpprogramma voor oppervlakte. (D) het vaststellen van de XY-diameter, met vlekken gereedschap, voor de detectie van de kernen. Afhankelijk van de regio van belang en vlekken, kan de z-as diameter en achtergrond correctie worden gebruikt. (E) de minimale en maximale intensiteit drempel detectie. Een soortgelijke aanpak kan worden gebruikt voor oppervlakte functie waar in plaats van het definiëren van de diameter en de oppervlakte details kunnen worden gedefinieerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het doel van dit protocol is minder tijd nodig voor germline analyse te verbeteren van de nauwkeurigheid. Na standaard voorbereiding van ontleed germlines, wordt een driedimensionaal model van germline kernen bereid door computationele renderen. Terwijl het toestaan van de waarneming van germline kernen distributie in de ruimte, berekent driedimensionaal renderen het aantal kernen op specifieke regio's van de kiemcellen. De kritische aspect van onze methode is nauwkeurige definitie van grootte en vorm parameters van kernen. Dit hangt af van duidelijkheid van kleuring en vergroting gebruikt naar afbeelding. We hebben bevestigd de nauwkeurigheid van de methode door het vergelijken van gegevens handmatig geanalyseerd1gepubliceerd. Verder bevestigen de juistheid van onze methode, wij gebruikt meerdere mutanten onder verschillende omstandigheden en de resultaten met de gepubliceerde literatuur bevestigd. Zij bevestigden voorts de mogelijkheid van de methode om te detecteren subtiele en sterke fenotypen - cpb-3 en glp-1 mutanten, respectievelijk. Daarnaast toont deze methode aanpassingsvermogen aan veranderingen in de kernen grootte en vorm binnen de kiemcellen of zelfs tussen stammen. Deze eigenschap maakt het ook mogelijk de identificatie en het scoren van kleinere structuren in de kiemcellen zoals chromosomen en sperma. De methode ook verdere probleemoplossing voor grootte en vorm parameters, staat indien nodig toe. Onze analyse was in staat om het verhelderen van de verdeling van de kernen in de kiemcellen en bleek dat kernen in mitotische en pachytene regio's zijn ingedeeld in verschillende patronen. Door toepassing van driedimensionale weergave op REC-8 en DAPI kleuring, toonden we ook de verdeling van de REC-8 binnen kernen van de mitotische regio.

Driedimensionale weergave van actine kleuring ingeschakeld gedetailleerd onderzoek van germline cytoskeletal structuren. De germline lijkt te hebben twee aparte actine structuren, hoewel ze fysiek contact onderhouden. Terwijl de wederopbouw van het cytoskelet voor de gehele germline is mogelijk als een enkele entiteit, de beste resultaten kan worden verkregen als de regio's van belang zijn dan geselecteerd in mitotische, overgang, en Meiotische regio's. De distale germline cytoskelet is een ongedefinieerde vorm en evolueert naar een draadvormige structuur aan het proximale einde. Daarom kunnen onze protocol drie-dimensionale reconstructie van het cytoskelet van de actine germline door specifieke parameters om de verschillen in actine distributie te definiëren. De meest kritische aspect van de analyse is de definitie van de parameters zoals de grootte van de kernen en oppervlakte detail eis. Verlaging van de kernen grootte onder de werkelijke grootte zal het risico van de software te halen van de lichtpuntjes in de kernen als afzonderlijke objecten. Ook zal hoge oppervlakte details waarden leiden tot het verlies van nauwkeurige driedimensionale structuren. De voorgestelde methode is afhankelijk van de precisie van de dissectie en de kwaliteit van de germline kleuring. Een beschadigde germline kan leiden tot de vrijlating van de kernen uit de kiemcellen, waardoor onjuiste nummering. Hoge achtergrond van de kleuring zal ook leiden tot de onjuiste kernen graaf en onjuiste driedimensionale weergave.

Onze methode breidt eerder bekende geautomatiseerde analysemethoden germline waar zijn wij in staat om de kernen nummer en distributie/expressie van germline eiwitten in de ruimte met een enkel protocol20te analyseren. Ten tweede, onze methode kunt scoren van kleinere structuren zoals chromosomen in de kiemcellen. Chromosoom segregatie is een belangrijk aspect van de oöcyt ontwikkeling21. Met onze methode, is het mogelijk om op te sporen het aantal en de positie van de chromosomen waar de afstand kan worden gedefinieerd door het kalibreren tegen wild type eicellen. Elke mutatie betrekking tot de scheiding van chromosoom kan worden bestudeerd met behulp van deze tool. De methode kan ook worden uitgebreid bestuderen chromosomen in embryo's stadium 2-cel. De computationele analyse biedt ook het aantal zaadcellen in de spermatheca, aantal chromosomen in een oöcyt en germline cytoskeletal structuren. Samen genomen, biedt de methode uitgebreide analyse van de C. elegans germline met behulp van een afzonderlijk protocol terwijl het verminderen van analyse tijd aanzienlijk. De methode elimineert de eis voor meerdere tools voor elke analyse (kernen nummer, eiwit distributie en cytoskeletal structuur) en verwijdert de codering termijnen in enige specifieke software. Ten slotte, deze methode effectief kan worden uitgebreid tot andere worm studies, met inbegrip van de drie-dimensionale analyse van ingetogen levende wormen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Acknowledgments

Wij danken Monash Microimaging voor hun technische ondersteuning. Sommige stammen werden verstrekt door de Caenorhabditis genetica Center, dat wordt gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440). Dit werk werd ondersteund door een Monash University biogeneeskunde Discovery Fellowship NHMRC projectsubsidie (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) en veski innovatie fellowship: VIF 23 tot en met Roger Pocock.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III  Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
OP50 Escherichia coli bacteria Homemade
Nematode Growth Media (NGM) plates Homemade
polyclonal rabbit anti-REC-8  SDIX 29470002
Alexa 488 conjugated antibody raised in goat Thermofisher Scientific A-21236
Cytoskeletal dye phalloidin  Thermofisher Scientific A-12380
DAPI  Thermofisher Scientific  62248
Poly-L-lysine  Sigma Aldrich P5899
Tetramisol  Sigma Aldrich P5899
MgSO4 Sigma Aldrich M7506
1M HEPES buffer, pH 7.4  Sigma Aldrich G0887
10X PBS pH 7.4  Thermofisher Scientific AM9625
Tween-20  Sigma Aldrich P1389
EGTA Sigma Aldrich E3889
37% Paraformaldehyde solution Merck Millipore 1040031000
Normal goat serum Sigma Aldrich G9023
Fluoroshield fixing reagent  Sigma Aldrich F6182
Ethanol  Millipore  1009832511
Methanol Sigma Aldrich 34860
20°C & 25°CIncubator  Any brand
Light microscope Any brand
Confocal microscope   Any brand (Leica, Zeiss)
Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. Bitplane
Phospho buffered saline, pH 7.4 Homemade
Teflon microscope slides  Tekdon   941-322-8288

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hubbard, E. J. Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology. Dev Dyn. 236, (12), 3343-3357 (2007).
  2. Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239, (5), 1539-1554 (2010).
  3. Kershner, A., et al. Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).
  4. Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9, (2), 88372 (2014).
  5. Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).
  6. Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Dev Biol. 268, (2), 342-357 (2004).
  7. Crittenden, S. L., et al. A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans. Nature. 417, (6889), 660-663 (2002).
  8. Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans. Genetics. 168, (1), 147-160 (2004).
  9. Schumacher, B., et al. Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis. Cell. 120, (3), 357-368 (2005).
  10. McMullen, P. D., et al. Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress. PLoS Comput Biol. 8, (1), 1002338 (2012).
  11. Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. Physiological control of germline development. Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).
  12. Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134, (12), 2227-2236 (2007).
  13. Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development. Dev Biol. 180, (1), 165-183 (1996).
  14. Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development. Dev Biol. 295, (2), 689-699 (2006).
  15. Austin, J., Kimble, J. glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell. 51, (4), 589-599 (1987).
  16. Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors. Development. 124, (4), 925-936 (1997).
  17. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201, (1), 167-184 (2015).
  18. Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes and Development. 15, (11), 1349-1360 (2001).
  19. Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 52, (1), 1-18 (1976).
  20. Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells. Development. 139, (5), 859-870 (2012).
  21. Laband, K., et al. Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes. Nat Commun. 8, (1), 1499 (2017).
Computationele analyse van de <em>Caenorhabditis elegans</em> Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gopal, S., Pocock, R. Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton. J. Vis. Exp. (134), e57702, doi:10.3791/57702 (2018).More

Gopal, S., Pocock, R. Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton. J. Vis. Exp. (134), e57702, doi:10.3791/57702 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter