Summary
Wir präsentieren Ihnen eine automatisierte Methode zur dreidimensionalen Rekonstruktion der Keimbahn Caenorhabditis Elegans . Unsere Methode bestimmt die Anzahl und Position der jeder Kern in die Keimbahn und Analysen Keimbahn PROTEINVERTEILUNG und Zytoskeletts Struktur.
Abstract
Die Keimbahn Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) wird verwendet, um mehrere biologisch wichtigen Prozesse einschließlich Stammzell-Entwicklung, Apoptose und Chromosom Dynamik zu studieren. Während die Keimbahn ein ausgezeichnetes Modell ist, ist die Analyse oft zweidimensional aufgrund der Zeit- und Arbeitsaufwand für die dreidimensionale Analyse. Wichtige Messwerte in solchen Studien werden die Anzahl/Position der Kerne und PROTEINVERTEILUNG in die Keimbahn. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur automatisierten Analyse der Keimbahn mit konfokalen Mikroskopie und rechnerische Ansätze um zu bestimmen, die Anzahl und Position der Kerne in den einzelnen Regionen der Keimbahn durchführen. Unsere Methode analysiert auch die Keimbahn PROTEINVERTEILUNG, die es die dreidimensionale Untersuchung von Protein-Expression in verschiedene genetische Hintergründe ermöglicht. Unsere Studie zeigt weiter, Variationen im Zellskelett Architektur in unterschiedlichen Regionen der Keimbahn, die räumliche Entwicklung Anforderungen aufnehmen kann. Unsere Methode ermöglicht schließlich automatisierte Zählung der Spermien in die samentasche des einzelnen Keimbahn. Zusammen genommen, ermöglicht unsere Methode schnelle und reproduzierbare phänotypische Analyse von C. Elegans Keimbahn.
Introduction
Die Erhaltung der Signalwege bei Säugetieren macht C. Elegans ein hervorragendes Modell mehrere biologische Prozesse1,2zu studieren. In unserem Labor verwenden wir die Keimbahn C. Elegans Stammzellen Entwicklung, Apoptose und Genexpression zu studieren. Während die Keimbahn eine dreidimensionale Struktur ist, sind viele Studien zweidimensional aufgrund der Zeit- und arbeitsintensiven dreidimensionale Analyse. Es ist sehr wahrscheinlich, dass zweidimensionale Analyse in Vivo -Events in die Keimbahn verfälschen kann. Das C. Elegans adult Zwitter hat zwei Keimbahn Arme, von die jeder eine somatische distale Spitze Zelle (DTC) beherbergt, die distale Keimzellen in einem undifferenzierten Zustand3,4unterhält. Diese Keimzellen beginnen zu unterscheiden, wie sie bewegen sich weg von der DTC, seinen Einfluss zu entkommen und werden Eizellen und Spermien, wie sie das proximale Ende der Keimbahn erreichen. Während dieses Prozesses durchlaufen Keim Zellkerne Mitose, vor dem Übergang zur Meiose5,6. Larvenstadium 4 (L4) von der Entwicklung nach dem Eizellen, während das Erwachsenenalter produziert werden Spermienproduktion komplettiert. Die Spermien werden in der samentasche gespeichert wo sie, Eizellen befruchten, Embryonen zu erzeugen.
Es gibt mehrere genetische Faktoren und Umweltfaktoren, die Keimbahn Entwicklung in C. Elegans , was zu Veränderungen in der Anzahl der Kerne, Anzahl der Apoptotic Veranstaltungen, Chromosom Dynamik und Protein-Expression bzw. Lokalisierung7 beeinflussen können ,8,9,10,11. Die Analyse dieser Ereignisse erfordert die Ermittlung der einzelnen Phasen der Differenzierung, die anhand der nuklearen Morphologie und Verteilung. Um diese Parameter manuell mit einer großen Stichprobe-Größe genau zu analysieren ist arbeitsintensiv und zeitaufwändig. Um diese Nachteile zu umgehen und die Konsistenz der Analyse zu ermöglichen, entwickelten wir eine automatisierte Methode zur dreidimensionalen Prüfung von C. Elegans Keimbahn für Kerne zählen, Kerne Verteilung, Protein-Expression und Zytoskeletts Struktur. Durch die Kombination von konfokalen Mikroskopie mit dreidimensionale Darstellung, erzielten wir Größe und Form Parameter für die Identifizierung der einzelnen Phasen der Keimzelle Differenzierung. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode zählen der Keim Zellkerne und Sperma plus scoring der Chromosomenzahl in jeder Eizelle.
Eine wichtige Struktur in die Keimbahn ist das Zellskelett, das Stabilität in der Keimbahn Fach, Aids zytoplasmatischen streaming und Schutz für Keimbahn Kerne12bietet. Rechnerische Darstellung verwenden, wir Dreidimensionale Rekonstruktion des Zytoskeletts Keimbahn durchgeführt und identifiziert verschiedene Zellskelett Features in die Keimbahn. Hier beschreiben wir Schritt für Schritt-Protokoll zur Veranschaulichung wie computergestützte Analyse kombiniert konfokale Bildgebung ermöglicht umfassende Analyse der Keimbahn C. Elegans .
Wir schlagen eine schnelle Methode für die dreidimensionale Analyse von C. Elegans Keimbahn (Abbildung 1). Dreidimensionale Analyse verwenden, ist es möglich, die dreidimensionale Verteilung der Keimbahn Kerne (Abbildung 2 und Abbildung 3), automatische Zählung der Zellen (Abbildung 2), Rekonstruktion des Zytoskeletts Keimbahn ( zu studieren Abbildung 3), Verteilung von Proteinen (Abbildung 4), und zählen die Anzahl der Spermien in die samentasche und Chromosomen in Eizellen (Abbildung 5). Die Methode ermöglicht einfache und genaue Quantifizierung der Keimbahn nicht nur, sondern physiologisch relevante Phänotypen identifiziert.
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Protocol
1. Vorbereitung und Wurm Tierhaltung
Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien für alle Produktinformationen.
- OP50 Escherichia coli Kultur: Kultur OP50 Bakterien in Lysogeny Brühe (LB) (1 % Tryptone, 0,5 % Hefe, 0,5 % NaCl, pH 7,0) über Nacht bei 37 ° C ohne Antibiotika.
- Samen Sie 400 µL OP50 Bakterien, Nematoden Wachstumsfugen Medien (NGM) (1,5 g NaCl, 8,5 g Agar, 1,25 g Pepton, 1 mL 1 M CaCl2, 5 mg/mL Cholesterin in Ethanol, 1 mL 1 M MgSO4 1 mL und 25 mL 1 M KPO4 Puffer) und die Bakterien für 48 h der Luft trocknen lassen.
- Wählen Sie Würmer auf gesetzte NGM Platten und inkubieren Sie bei 15 ° C oder 20 ° C.
- Wählen Sie für die Analyse der Erwachsenen Zwitter Keimbahn wohlgenährt L4-Würmer auf den bakteriellen Rasen und Inkubation über Nacht bei 20 ° C.
- Inkubieren Sie für die Wertung Spermienzahl in Hermaphroditen L4 Würmer bei 20 ° C für 12 h bis die Würmer die L4/Erwachsene Häutung erreichen. Um die Würmer zu L4-Stadium zu synchronisieren, bereiten Sie Eiern durch Abnehmen der erwachsenen Würmer mit einer Menge von Eiern in Bleichmittel-Lösung (1 M NaOH und Bleichmittel im Verhältnis 1:1). Lassen Sie die Eiern schlüpfen und L4 Tiere für das Experiment.
- Bereiten Sie Teflon-Objektträger durch 25 µL Poly-L-Lysin-Lösung auf der Folie platzieren und verbreiten die Lösung gut, mit einer PIPETTENSPITZE vor. Nach dem Entfernen der überschüssigen Poly-L-Lysin mit Küchenpapier trockentupfen, ermöglichen Sie die Folien an der Luft trocknen und die Folien bei 65 ° C für 15-20 min inkubieren.
2. Keimbahn Präparation und Färbung6,13
- 10 µL 0,01 % Tetramisole (Narkose) auf einem 22 mm × 22 mm deckgläschen vor Ort und wählen Sie 1 - Tage alten Erwachsenen Würmer hinein.
- Den Wurm am Heck zu sezieren, wie es sediert wird mit einer Spritze (5 mL) und einer Nadel (24 "x 1"), und damit die Keimbahn nicht beschädigt wird.
Hinweis: Die Zerlegung muss erfolgen, bevor der Wurm vollständig gelähmt wird, so dass der Unterdruck in der Wurm und Wurm-Bewegung unterstützen das Auswerfen der Keimbahn. Zur Bewertung von Spermien, müssen Vorkehrungen getroffen werden, nicht zu beschädigen die samentasche durch die Nadel während der Präparation. Berühren Sie nicht die Keimbahn mit der Nadel mit Ausnahme der Dissektion Punkt nach der samentasche. Wenn es in die Keimbahn-Fach zu brechen oder eine Entlassung aus der Keimbahn beobachtet, sollte die Keimbahn nicht für die Analyse verwendet werden. - Ort der invertierten Deckglas auf einer Poly-L-Lysin beschichtete Folie, die sezierte Keimbahn auf der Folie.
- Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit unter dem Deckglas, indem man einen Papier-Turm an einer Ecke des Deckglases, dann legen Sie die Folie in flüssigem Stickstoff für 1 min. schnell das Deckglas mit Hilfe einer Nadel mit der Germlines auf der Folie zu entfernen.
- Übertragen Sie die Folien in Methanol-20 ° C für 30-60 s in einer Kammer, dann 30 min in frisch zubereitete festlegunglösung (1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 0,08 M HEPES pH 6,9, 1,6 mM MgSO4, 0,8 mM Ethylenglykol-Bis(beta-aminoethyl inkubieren Äther)-N, N, N', N'-Tetraacetic Säure (EGTA) und 3,7 % Paraformaldehyd) bei Raumtemperatur.
- Die Folien zu waschen, indem man in eine Kammer mit 1 X PBS, pH 7.4 mit 0,1 % Tween-20 für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
- Blockieren der Germlines mit 30 µL Lösung zu blockieren (30 % der ziegenserum vorbereitet, indem man 900 µL ziegenserum in 1700 µL destilliertes H2O und 300 µL 10 X PBS) in eine Feuchte Kammer, indem man feuchten Papiertuch in einer Plastikbox bei Zimmertemperatur 30 Minuten vorbereitet.
- Fügen Sie 50 µL der REC-8 Antikörperlösung in 30 % ziegenserum in einem Verhältnis 1: 300, jede Probe vorbereitet. Über Nacht bei 4° c inkubieren
- Waschen Sie die Folien indem man in eine Kammer mit 1 X PBS mit 0,1 % Tween-20 für 10 min. Wiederholen Sie den Schritt einmal und überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, indem Sie ein Papiertuch auf die Ecke der Folie.
- Bereiten Sie Sekundärantikörper Lösung durch Verdünnung grüne Fluorophore (488 nm Emissionswellenlänge) konjugierten Sekundärantikörper (1: 1000), Phalloidin (Aktin Fleck, 1:4000) und DAPI (DNA-Fleck, 1:4000) in 30 % normalem ziegenserum vor.
- 50 µL Sekundärantikörper Lösung zur Folie hinzufügen.
- 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Die Objektträger waschen zweimal, indem man in eine Kammer mit 1 X PBS mit 0,1 % Tween-20 für 10 Minuten wischen Sie überschüssige Flüssigkeit.
- Fügen Sie 30 µL Reagenz auf der Folie zu fixieren hinzu und legen Sie ein 12 mm2 x 1,5 µm Deckglas darauf und trocknen Sie die Folien bei 4 ° C über Nacht.
(3) konfokalen Mikroskopie
- Schalten Sie die confocal Mikroskop, Laser, Resonanz-Scanner und confocal Mikroskop Software. Legen Sie die Folien mit gefärbten Germlines auf den Diahalter oben 63 X Objektiv.
- Suchen Sie eine Keimbahn, Fokus auf der Oberseite der Keimbahn und markieren Sie ihn mit confocal Mikroskop-Software. Ebenso konzentrieren Sie sich auf der Unterseite der Keimbahn und markieren Sie ihn um die totale Keimbahn Dicke herzustellen.
- Bild der gesamten Keimbahn definieren die Dicke der einzelnen Segmente bis zu 0.5 µm. Markieren Sie den vollständigen Erwerb der Keimbahn und Start. Jede Scheibe 8 Mal zu scannen und die Durchschnittswerte um die Bildqualität zu verbessern. Die resonante Scanner erlauben schnellen Scannen, um zu vermeiden, während der Bildgebung bleichen. Wenn das Mikroskop keinen resonanten-Scanner haben, reduzieren Sie die Anzahl der Scans auf vier bleichen zu vermeiden.
4. Post bildgebende Analyse der Kerne Anzahl und Verteilung
Hinweis: Siehe ergänzende Abbildung1 für Screenshots der Software-Tools und Tasten verwendet.
- Importieren Sie das Bild Imaris 8.4.1 oder spätere Versionen der Software.
- Definieren Sie mitotische Region, Übergangszone, meiotische Region, Eizelle Region und samentasche der Keimbahn durch die Identifizierung der nuklearen Morphologie in jeder region
- Verwenden Sie die Oberfläche Funktionstaste (ergänzende Abbildung 1A) der Software, wählen Sie die Region von Interesse.
- Brechen Sie automatische DGM-Erstellungsassistenten ab und manuell zeichnen Sie die Region von Interesse auf das erste und letzte Segment des Bildes aus dem dreidimensionalen Stapel.
- Klicken Sie auf Create Oberfläche.
Hinweis: Die Software wird automatisch die Stapel zwischen ersten und letzten Stapel entwickeln. - Maskieren Sie alle Kanäle außer DAPI Maskenkanal Schaltfläche (Ergänzende Abbildung 1 b-C).
- Definieren Sie Kerngröße Parameter mit Hilfe der spot Funktionstaste (ergänzende Abbildung 1A). Definieren Sie für die mitotische Region einen XY-Durchmesser von 2 µm wobei Z Durchmesser nicht definiert. Definieren Sie für die Übergangszone eine XY-Durchmesser von 2 µm und Z als 1,5 µm. (ergänzende Abbildung 1).
Hinweis: Beheben Sie die Durchmesser entsprechend der Vergrößerung und Spezifikationen des Mikroskops. Für das aktuelle Protokoll das Ziel verwendet wurde 63 X und Aufpreis 1,70 fache Vergrößerung während der Bildgebung. Ändert sich das Ziel, zum Beispiel 40 X, sollte der Durchmesser entsprechend geändert werden. Fehlerbehebung durchzuführen mit Wildtyp-Germlines, die richtigen Parameter zu etablieren. Die mitotische Region ein Wildtyp Keimbahn Arm hat ca. 250 Kerne. Der Durchmesser sollte geändert werden, um diesen Wert zu erreichen. Verwenden Sie mindestens 15 Germlines, um den optimalen Wert für den Durchmesser zu ermitteln. Ein ähnlicher Ansatz sollte verwendet werden, für die Kalibrierung der Übergangszone (150-170-Kerne) und meiotischen Region (600-700 Kerne). - Begrenzen Sie die Erkennung von Flecken durch die Festlegung der Untergrenze (ergänzende Abbildung 1E). Verwendung DAPI gefärbt Wildtyp Germlines um minimale Schwelle zu etablieren, durch die Erhöhung der minimalen dreidimensionale Darstellung Schwellenwerts, bis die erste Ort außerhalb der Keimbahn erscheint.
- Speichern Sie das Bild und erhalten Sie die Anzahl der Kerne aus der Tabelle generiert automatisch von der Software. Exportieren Sie die Bilder als TIF-Dateien.
5. buchen Sie Imaging-Analyse zur Bewertung von Sperma und Chromosomenzahl
- Führen Sie dreidimensionale Darstellung durch die Auswahl der samentasche als die Region von Interesse. Jedes Sperma zu erkennen, definieren den spot Durchmesser zwischen 0,75 - 1,0 µm für X und Y-Achse, während Z Durchmesser undefiniert bleibt. Verwenden Sie die Funktionstaste Flecken, wie ergänzende Abbildung1 gezeigt.
- Subtrahieren Sie den Hintergrund durch Ankreuzen Hintergrund subtrahieren Box und mit Hintergrund Korrekturwerten berechnet, indem die Software (ergänzende Abbildung 1).
Hinweis: Imaris Software wählt hoher Intensität Punkte zuerst, also die Wirkung der Herkunft ist minimal, solange gibt es wesentliche Unterschiede zwischen der Region von Interesse und den Hintergrund. Eine zweite Methode ist die Hintergrundkorrektur manuell definieren, wo geeignete Werte für den Hintergrund gegeben werden kann. Manuelle Untergrundkorrektur werden angebracht, wenn die Intensität der unabhängige Stichproben Vergleich braucht. - Passen Sie die dreidimensionale Darstellung Schwellenwert um alle DAPI gefärbt Spermien in der samentasche (ergänzende Abbildung 1E) zu erkennen.
- Zum zählen von Chromosom definieren die Spotdurchmesser < 0,75 µm für X und Y-Achse vor der Entwicklung von dreidimensionaler Models.
- Das Bild speichern und als TIF-Datei exportieren.
6. post Imaging-Analyse für Zellskelett Rekonstruktion der Keimbahn
- Identifizieren des Interessenbereichs in die Keimbahn und Maske alle Kanäle außer Phalloidin Schaltfläche Kanäle zu maskieren .
- Definieren Sie eine Oberflächendetails von 0,25 µm mithilfe der Oberfläche Funktionstaste (ergänzende Abbildung1).
Hinweis: Dies bedeutet, dass jede 0,25 µm in dreidimensionale Modelle dargestellt werden soll. Oberflächendetails kann für jede Region der Keimbahn konstant sein, wo ein dreidimensionales Oberflächenmodell für jeden 0,25 µm erstellt wird. Jedoch für die Eizelle Region Oberflächendetails auf 0,35 - erhöht werden kann 0,5 µm durch das Vorhandensein von genau definierten Aktin Fasern in dieser Region. - Subtrahieren Sie den Hintergrund durch Ankreuzen Hintergrund subtrahieren Box und mit Hintergrund Korrekturwerten berechnet, indem die Software (ergänzende Abbildung 1).
- Stellen Sie dreidimensionale Darstellung Schwelle je nach Struktur Analyse (ergänzende Abbildung 1E) erfordern.
- Das entwickelte dreidimensionale Bild speichern und als TIF-Datei exportieren.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt den Zeitaufwand für die dreidimensionale Keimbahn-Analyse. L4 Hermaphroditen bei 20 ° C inkubiert wurden seziert, um Germlines zu isolieren und mit DAPI, Phalloidin und Antikörper gegen Proteine der Keimbahn befleckt. Germlines sind abgebildet mit der konfokalen Mikroskopie. Färbung und konfokalen Mikroskopie erfordert ca. 24 Std. computergestützte Analyse für die komplette Keimbahn 10-15 min erfordert, zählen Sie die Anzahl und Position der Kerne, die PROTEINVERTEILUNG zu identifizieren, analysieren das Zellskelett Struktur und Score der Anzahl der Spermien. Vollständige manuelle Analyse erfordert mehr als 2 h pro Keimbahn und Betreiber Einfluss unterliegt, daher unsere automatisierte Hochdurchsatz-Verfahren reduziert die Analysezeit und verbessert die Reproduzierbarkeit.
Automatisierte Kerne scoring zeigt, die ein Keimbahn-Arm befindet sich ca. 1.000-1.200 Kernen (Abbildung 2C), gut mit bereits veröffentlichten Handbuch scoring-Wert1entspricht. Bestätigen Sie die Richtigkeit des scoring, mehrere Mutanten und unterschiedlichen Bedingungen sind eingesetzt (Abbildung 2-D-G). Wir verglichen zum Beispiel rnp-8(tm435), cpb-3(bt17)und glp-1(e2141) mutierten Würmer zu Wildtyp Tiere. Automatische Zählung reproduziert die bekannten Reduzierung der Anzahl der Kerne in Cpb-3 und Glp-1 mutant Germlines14,15,16,17. Einem massiven Abbau Kerne Zahl wurde auch in den glp-1(e2141) temperatursensible Mutanten wenn bei 25 ° c inkubiert beobachtet. Die Verteilung der Kerne ist abhängig von der Phase der Differenzierung. Die mitotische Region, enthält ca. 250 Kerne in Wildtyp ist dicht gepackt mit Kernen, die verglichen mit dem Rest der Keimbahn (Abbildung 3)1. Der Abstand zwischen den mitotischen Kerne ist minimal und Kerne befinden sich in der mitotischen Region. Jedoch wenn die Kerne vom distalen Ende bewegen, werden sie stärker auf den Umfang der Keimbahn (Abbildung 3). Die Veränderung der Verteilung beginnt bei der Wechselzone und vervollständigt die Kerne Meiose/Pachytene betreten.
Die Keimbahn hat spezifische Zellskelett Strukturen in den verschiedenen Phasen der Differenzierung. Wir haben F-Aktin durch Färbung der Keimbahn mit Phalloidin visualisiert. Die Verteilung von F-Aktin von distal zum proximalen Ende der Keimbahn war in jeder Region (Abbildung 3 und Abbildung 5). Im Allgemeinen gibt es zwei unterschiedliche Strukturen, die als "Zylinder innerhalb Zylinder." angezeigt werden Bei der mitotischen Region erscheint innere Aktin als eine feste Masse mit einer bestimmten Form (Abbildung 3). Wie die Keimbahn die Wechselzone erreicht, die innere Aktin übernimmt eine mehr zylindrische Struktur und es wird ein Hohlzylinder späten Pachytene erreicht. Die zweite Schicht der Aktin deckt die innere Schicht der Keimbahn Form verleihen. Diese "Zylinder im Zylinder" Aktin Struktur verschwindet in die Eizelle-Region (Abbildung 5). Bei der Eizelle Region erscheint Aktin als dicken Fasern. Die Eizellen werden durch eine Aktin Rachis, getrennt, wenn es angezeigt wird, dynamisch, um die Bewegung der Eizellen, die samentasche zu ermöglichen. Schließlich bildet Aktin in der samentasche auch dicke Bündel von Aktin Fasern. Allerdings erscheinen die Fasern zu verpackenden näher als in der Eizelle Region. Die Zellskelett Struktur scheint das Verteilungsmuster der Kerne (Abbildung 3) ergänzen. Die Kerne scheinen bei der mitotischen Region rund um die inneren Aktin-Struktur platziert werden. Wie sie Meiose/Pachytene zu erreichen, organisieren die Kerne zwischen den zwei Aktin-Zylindern, die Mitte der Keimbahn meist Kerne (Abbildung 3). Dies könnte wahrscheinlich Hilfe ununterbrochene zytoplasmatischen streaming in die Keimbahn. Germlines waren mit einem Antikörper gegen das Protein REC-8 fleckig und analysiert von konfokalen Mikroskopie. REC-8 ist ist homogen verteilt, um frühe Kerne der Keimbahn und später gespalten und abgebaut während der Meiose18. REC-8 Verteilung in dreidimensionale Querschnittsanalyse der Keimbahn zeigt die Verteilung des Proteins in der mitotischen Region (Abbildung 4).
Dreidimensionale Darstellung des proximalen Endes der Keimbahn umfasst die samentasche und ersten drei Eizellen distal der samentasche. Unsere Analyse erkannt durchschnittlich 151 Sperma in jeder samentasche (n = 18). Dies entspricht der veröffentlichten Literatur, zeigt die Zuverlässigkeit der Methode (Abbildung 5F)19. Diese Analyse kann durchgeführt werden, zusammen mit Zellskelett oder Protein Reichweitenstudien. Das Genom von C. Elegans ist sechs Chromosomen verteilt. In der voll entwickelten Wildtyp Eizellen diese Chromosomen sind sichtbar und können gezählt werden. Dieses Chromosom Trennung kann verwendet werden, um Chromosom Stabilität oder sonstige Mängel im Zusammenhang mit Entwicklung der Eizelle zu studieren. Dreidimensionale Darstellung die Anzahl der Chromosomen visualisiert werden und wenn die Chromosomen korrekt getrennt sind, die Anzahl genau erhalten werden (Abbildung 5).
Abbildung 1 . Zeitplan für die automatisierte Analyse. Zeitvergleich zwischen manuellen und rechnerische Analyse der Keimbahn C. Elegans . Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Verteilung der Kerne in die Keimbahn. (A) DAPI gefärbt zeigen mitotischen Keimbahn, Übergangs- und Pachytene/meiotische Regionen. (B) dreidimensionale Computermodell der Keimbahn. (C) Scoring für die Gesamtzahl der Kerne in Wildtyp-Germlines. (D-F) Scoring für die Anzahl der Nukleonen bei mitotischen, Übergangs- und meiotischen Bereiche der Wildtyp, rnp-8, Cpb-3und Glp-1 mutierten Germlines. (G) Vergleich in der Gesamtzahl der Kerne in der Glp-1 -Mutante bei 20 ° C und 25 ° C. Fehlerbalken stellt Standardfehler. Studenten Test. n < 0,0001, ***n < 0,001, **n < 0,01, *n < 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Zellskelett Struktur der Keimbahn. (A-B) Organisation des Zytoskeletts der Keimbahn bei der mitotischen Region innere Aktin (rot). Die innere Aktin hat eine diffuse Struktur im Vergleich zu äußeren Aktin an der mitotischen Region. (C-D) In der Pachytene Region nimmt das Zytoskelett eine zylindrische Struktur durch die Bildung von zwei Zylindern, zwischen, denen die Zellkerne (blau) organisiert sind. (E-F) Organisation der Keimbahn Kerne in den Regionen mitotischen und Pachytene. Die Verteilung der Kerne ist stärker auf den Umfang des "Germtube" in der Pachytene-Region, im Vergleich zu mitotischen Region (grün) und Mitte der Keimbahn werden Kerne. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . REC-8 Ausdruck in der mitotischen Region. (A) Schliffbild zeigt das distale Ende des einen REC-8-gefärbten Keimbahn. (B-C) Dreidimensionale Darstellung der REC-8 Färbung (in blau dargestellt) und Verteilung des Proteins zwischen den mitotischen Kernen (grün). REC-8 Färbung ist weniger reichlich proximal der mitotischen Region (gekennzeichnet durch weiße Punkte repräsentieren Kerne). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Keimbahn Struktur am proximalen Ende. (A) DAPI Färbung der Keimbahn am proximalen Ende. (B) dreidimensionale Darstellung des DAPI-Färbung zeigt Sperma in der samentasche (gelb) und Chromosomen in die Eizellen (weiß). (C-E) Dreidimensionale Zellskelett Struktur am proximalen Ende der Keimbahn. Rot markiert die komplette proximale Ende und grün markiert die samentasche. Cross sectional Analyse zeigt, dass das Zytoskelett nicht nur eine filamentöse Struktur von Aktin um Eizellen bildet, aber auch zwischen Eizellen trennt. (F) Graph zeigt die Anzahl der Spermien in jedem spermatheken und Durchschnitt aus mehreren spermatheken gewonnen (n = 18). Fehlerbalken stellt Standardfehler. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Zusätzliche Abbildung 1 . Software-tools Beschreibung. (A) die Flecken und Oberflächenwerkzeuge zur Detektion von Kernen und Protein zu beflecken. (B-C) Die Auswahl der dreidimensionalen Region von Interesse mit dem Oberflächen-Werkzeug. (D) Festlegung des XY-Durchmessers, mit Flecken Tool für Kerne Erkennung. Je nach Region von Interesse und Färbung kann die z-Achse Durchmesser und Hintergrund-Korrektur verwendet werden. (E) minimale und maximale Intensität Schwelle Erkennung. Ein ähnlicher Ansatz eignet sich für Oberflächen Funktion wo anstelle der Festlegung des Durchmessers und die Oberflächendetails können definiert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das Ziel dieses Protokolls ist es, verbessern die Genauigkeit und reduzieren den Zeitaufwand für die Keimbahn-Analyse. Nach standard Vorbereitung der seziert Germlines ist ein dreidimensionales Modell der Keimbahn Kerne durch rechnerische Rendering vorbereitet. Und ermöglicht die Beobachtung der Keimbahn Kerne Verteilung im Raum, berechnet dreidimensionale Darstellung die Anzahl der Kerne auf bestimmte Regionen der Keimbahn. Der kritische Aspekt unserer Methode ist präzise Definition der Größe und Form der Zellkerne. Dies hängt von der Klarheit der Färbung und der Vergrößerung verwendet Bild. Wir wird bestätigt, dass die Genauigkeit der Methode im Vergleich zu manuell analysiert Daten1veröffentlicht. Zur weiteren Bestätigung der Richtigkeit unserer Methode, wir nutzten mehrere Mutanten unter verschiedenen Bedingungen und bestätigten die Ergebnisse mit der veröffentlichten Literatur. Es bestätigt auch die Fähigkeit der Methode zu erkennen subtile und starke Phänotypen - Cpb-3 und Glp-1- Mutanten, beziehungsweise. Darüber hinaus zeigt diese Methode Anpassungsfähigkeit an Veränderungen in Kernen Größe und Form in die Keimbahn oder sogar zwischen den Stämmen. Diese Eigenschaft ermöglicht auch die Identifizierung und Bewertung der kleineren Strukturen in die Keimbahn wie Chromosomen und Sperma. Die Methode ermöglicht auch weitere Fehlerbehebung für Größe und Form Parameter, falls erforderlich. Unsere Analyse war in der Lage, die Verteilung der Kerne in die Keimbahn aufzuklären und zeigte, dass Kerne in mitotischen und Pachytene Regionen gliedern sich in verschiedenen Mustern. Dreidimensionale Darstellung auf REC-8 und DAPI-Färbung anwenden, haben wir auch die Verteilung der REC-8 Kerne der mitotischen Region gezeigt.
Dreidimensionale Darstellung der Aktin Färbung ermöglicht detaillierte Prüfung der Keimbahn Zellskelett Strukturen. Die Keimbahn scheint zwei separate Aktin Strukturen haben, wenn sie physischen Kontakt zu halten. Während die Rekonstruktion des Zytoskeletts für die gesamte Keimbahn möglich als eine Einheit ist, die besten Ergebnisse erzielt werden, wenn die Regionen von Interesse in mitotischen vorausgewählt werden, Übergang, und meiotischen Regionen. Die distale Keimbahn Zytoskelett hat eine unbestimmte Form und entwickelt sich zu einer faserigen Struktur am proximalen Ende. Unser Protokoll ermöglicht somit Dreidimensionale Rekonstruktion der Keimbahn-Aktin-Zytoskelett definieren spezifische Parameter um Unterschiede in der Verteilung von Aktin unterzubringen. Der wichtigste Aspekt der Analyse ist die Definition der Parameter wie Größe der Kerne und Oberflächendetails Anforderung. Senkung der Kerne Größe unterhalb der tatsächlichen Größe riskiert die Software um Lichtblicke in den Kernen als separate Objekte auszuwählen. Ebenso führt die hohe Oberflächendetails Werte zum Verlust der genaue dreidimensionale Strukturen. Die vorgeschlagene Methode stützt sich auf die Präzision der Dissektion und die Qualität der Keimbahn Färbung. Eine beschädigte Keimbahn führen zur Freisetzung von Kernen aus der Keimbahn, wodurch falsche Nummerierung. Hoher Hintergrund von der Färbung bewirkt auch die ungenaue Kerne Graf und unsachgemäße dreidimensionale Darstellung.
Unsere Methode erweitert vorbekannte automatisierten Analysemethoden Keimbahn wo sind wir in der Lage, die Anzahl der Kerne und Verteilung/Ausdruck der Keimbahn Proteine im Raum mit einem einzigen Protokoll20zu analysieren. Zweitens ermöglicht unsere Methode Punktesystem von kleineren Strukturen wie Chromosomen in die Keimbahn. Chromosom Segregation ist ein wichtiger Aspekt der Eizelle Entwicklung21. Mit unserer Methode ist es möglich, die Anzahl und Position der Chromosomen, wo die Entfernung definiert werden kann, durch die Kalibrierung gegen Wildtyp Eizellen, zu erkennen. Jede Mutation, die die Chromosom Trennung kann mit diesem Tool untersucht werden. Die Methode ist auch, erweiterbar um Chromosomen in Embryonen im 2-Zell-Stadium zu studieren. Die computergestützte Analyse bietet auch die Anzahl der Spermien in die samentasche, Zahl der Chromosomen in eine Eizelle und Keimbahn Zellskelett Strukturen. Zusammengenommen, bietet die Methode umfassende Analyse der C. Elegans Keimbahn mit ein einziges Protokoll während der Analysezeit deutlich reduzieren. Die Methode entfällt die Notwendigkeit mehrerer Tools für jede Analyse (Anzahl der Kerne, PROTEINVERTEILUNG und Zytoskeletts Struktur) und entfernt die Codierung Zeitaufwand in eine bestimmte Software. Schließlich kann diese Methode effektiv mit anderen Wurm Studien einschließlich der dreidimensionale Analyse der sediert live Würmer erweitert werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.
Acknowledgments
Wir danken Monash Microimaging für ihre technische Unterstützung. Einige Stämme lieferte Caenorhabditis Genetik Zentrum, das von NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Diese Arbeit wurde unterstützt durch eine Monash University Biomedizin Entdeckung Fellowship, NHMRC Project Grant (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) und Veski-Innovation-Stipendium: VIF 23, Roger Pocock.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
References
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- Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).
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