Summary
Biz üç boyutlu Caenorhabditis elegans germline. inşası için otomatik yöntemi mevcut Bizim yöntem sayısını ve her çekirdek germline ve analizleri germline protein dağıtım ve hücre iskeleti yapısı içindeki konumunu belirler.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline kök hücre geliştirme, Apoptozis ve kromozom dinamikleri dahil olmak üzere çeşitli biyolojik olarak önemli işlemleri incelemek için kullanılır. Germline mükemmel bir model olsa da, genellikle iki boyutlu zaman ve emek üç boyutlu analiz için gerekli nedeniyle analizidir. Bu tür çalışmalarda önemli dökümanları numarası/konumunu çekirdeği ve protein dağıtım germline içinde vardır. Burada, otomatik sayı ve germline her bölgede çekirdeği konumunu belirlemek için confocal mikroskobu ve Hesaplamalı yaklaşımları kullanarak germline analizini gerçekleştirmek için bir yöntem mevcut. Bizim yöntem da farklı genetik geçmişleri protein ifade üç boyutlu incelenmesi sağlar germline protein dağıtım analiz eder. Ayrıca, bizim çalışma belirli kayma gelişimsel gereksinimleri karşılamak germline farklı bölgelerinde hücre iskeleti mimaride varyasyonlar gösterir. Son olarak, bizim yöntemi otomatik her germline spermatheca Sperm sayımı etkinleştirir. Birlikte ele alındığında, bizim yöntemi C. elegans germline hızlı ve tekrarlanabilir fenotipik analizini etkinleştirir.
Introduction
Yollar memeliler ile sinyal koruma C. elegans birden çok biyolojik süreçlerin1,2eğitim için mükemmel bir model yapar. Bizim laboratuarımızda kök hücre gelişimi, Apoptozis ve gen ekspresyonu çalışmaya C. elegans germline kullanın. Germline üç boyutlu bir yapıdır, birçok çalışma iki boyutlu üç boyutlu analiz zaman alıcı ve emek yoğun doğası gereği vardır. İki boyutlu analiz germline vivo içinde olayları yanlış muhtemeldir. C. elegans yetişkin hermafrodit iki germline kolu, her biri bir farklılaşmamış devlet3,4distal germ hücreleri korur somatik distal ucu hücre (DTC) evler vardır. Bu germ hücreleri nüfuzunu, kaçan DTC'yi uzak hareket olarak ayırt etmek başlar ve germline proksimal sonuna ulaşmak yumurta ve sperm hale gelir. Bu işlem sırasında germ hücre çekirdeği mitoz, mayoz5,6için geçiş önce tabi. Sperm üretimini geçmesi sırasında yetişkinlik yumurta üretilmektedir gelişiminin larva aşamasında 4 (L4) tarafından tamamlanır. Sperm yumurta embriyo oluşturmak için nereye gübreliyorlar spermatheca içinde depolanır.
C. elegans değişiklikler çekirdek sayısı, apoptotik olaylar, kromozom dinamikleri ve protein ifade ve/veya Yerelleştirme7 sayısı sonuçlanan germline geliştirme etkileyebilir birden çok genetik ve çevresel faktörler ,8,9,10,11. Bu olayların analizi her aşamasında nükleer morfoloji ve dağıtım göre farklılaşma tanımlaması gerekir. Doğru bir şekilde bu parametreler büyük örnek boyutu ile el ile çözümlemek için emek ve zaman alıcı. Bu sakıncaları engelleyecek ve analiz tutarlılığını sağlamak için otomatik yöntemi C. elegans germline sayma çekirdekleri, çekirdek dağıtım, protein ifade, üç boyutlu incelenmesi için geliştirdiğimiz ve hücre iskeleti yapısı. Confocal mikroskobu ile üç boyutlu render birleştirerek, boyutu ve şekli parametreleri her aşamasında germ hücre farklılaşma tanımlanması için oluşturulan. Ayrıca, bu yöntem germ hücre çekirdeği ve sperm sayım artı kromozom sayısı her yumurta içinde Puanlama sağlar.
Bir çok önemli germline germline yuvası, AIDS sitoplazmik akarsu ve koruma germline çekirdeği12istikrar sağlar sitoiskeleti yapıdır. Hesaplamalı işlemesini kullanan, biz germline sitoiskeleti üç boyutlu rekonstrüksiyon uygulandı ve farklı hücre iskeleti özellikle germline içinde teşhis etti. Burada, biz nasıl sayısal analiz confocal görüntüleme sağlar kapsamlı analiz C. elegans germline ile kombine göstermek için adım adım bir protokol tanımlamak.
C. elegans germline (şekil 1) üç boyutlu analizi için hızlı bir yöntem öneriyorum. Üç boyutlu analizi kullanılarak, otomatik germline çekirdeği (Şekil 2 ve şekil 3), üç boyutlu dağılımı hücreleri (Resim 2), ( germline sitoiskeleti yeniden inşası sayma çalışma olanağı vardır Şekil 3), proteinler (şekil 4) ve spermatheca sperm ve yumurta (şekil 5) kromozom sayısı puanlama dağıtımını. Yöntem sadece germline kolay ve doğru miktar sağlar ama fizyolojik ilgili fenotipleri tanımlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlık ve solucan yetiştiriciliği
Not: Tüm ürün bilgileri için Malzemeler tablo bakın.
- OP50 Escherichia coli kültür: Lysogeny suyu (LB) (% 1'tryptone, % 0.5 Maya, %0,5 NaCl, pH 7,0) gecede 37 ° C'de Antibiyotikler olmadan OP50 bakteri kültürü.
- 400 µL OP50 bakterilerin nematodunun büyüme medya (NGM) levhalar (1,5 gr NaCl, agar, pepton, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL etanol, 1 mL 1 M MgSO4 5 mg/mL kolesterol 1,25 g 8.5 gram tohum ve 1 M KPO4 arabellek 25 mL) ve hava kuru bakteri 48 h için.
- Solucanlar numaralı seribaşı NGM plakaları almak ve 15 ° C veya 20 ° c kuluçkaya
- Yetişkin hermafrodit germline analizi için iyi beslenmiş L4 solucanlar bakteriyel çim için almak ve bir gecede 20 ° C'de kuluçkaya
- Solucanlar L4/yetişkin tüy dökme ulaşana kadar sperm sayı hünsa içinde puanlama için L4 solucanlar için 12 h 20 ° C'de kuluçkaya. Solucanlar L4 sahneye eşitlemeye, çamaşır suyu çözüm (1 M NaOH ve çamaşır suyu 1:1 oranında) yumurta bir sürü yetişkin solucanlar seçerek yumurta hazırlamak. Yumurta yumurtadan ve L4 hayvan deney için almak izin verir.
- Teflon mikroskop slaytlar poly-L-lizin çözüm 25 µL slaytta yerleştirerek ve çözüm de, bir pipet ucu kullanarak yayılan hazırlayın. Kağıt havlu ile Poli-L-lizin aşırı kaldırdıktan sonra kurutma ve slaytlar için 15-20 dk 65 ° C'de kuluçkaya slaytların izin.
2. Germline diseksiyon ve boyama6,13
- 10 µL % 0,01 (anestezik) tetramisole 22 mm × 22 mm coverslip üzerinde bir nokta ve o içine bir - gün eski yetişkin solucanlar seçin.
- Bir şırınga (5 mL) ve bir iğne (24 "x 1") kullanarak sakin olur gibi kuyruk, solucan teşrih ve germline zarar görmediğinden emin olun.
Not: negatif basınç solucan ve kurt hareketi yardım germline çýkartýlmasýný böylece solucan tamamen felç olur önce diseksiyon yapılmalıdır. Sperm puanlama için önlemler spermatheca zarar vermemesi için iğne tarafından diseksiyon sırasında alınması gerekir. Spermatheca sonra diseksiyon noktası dışındaki iğne ile germline dokunmaktan kaçının. Germline kompartımanda kırmak veya herhangi bir deşarj germline görülmektedir varsa germline analiz için kullanılmamalıdır. - Ters coverslip disseke germline slayt üzerinde tutmak bir Poli-L-lizin kaplamalı slayt üzerine yerleştirin.
- Coverslip altında aşırı sıvı 1 dk. hızlı bir şekilde kaldırmak için slayt üzerinde germlines ile bir iğne kullanarak coverslip bir kağıt Kulesi coverslip sonra yer slayt köşesinde sıvı azot yerleştirerek kaldırın.
- Slaytları-20 ° C metanol için 30-60 s bir odasında içine, daha sonra 30 dk içinde taze hazırlanmış sabitleme çözüm (1 fosfat tamponlu tuz (PBS) içeren 0,08 M HEPES pH 6,9, 1.6 mM MgSO4, 0.8 mM etilen glikol bis(beta-aminoethyl x için kuluçkaya eter)-N, N, N', N'-tetraacetic asit (EGTA) ve % 3.7 paraformaldehyde) oda sıcaklığında.
- 1 x PBS, pH 7.4 içeren bir odaya yerleştirerek slaytları yıkama %0,1 ile ara-20 10 dakika süreyle tekrarlamak bu adım bir kez.
- Germlines ile 30 µL çözüm engelleme engellemek (keçi serum 1700 µL içinde keçi serum 900 µL ekleyerek hazırlanan % 30'u H2O distile ve 10 x PBS 300 µL), oda sıcaklığında 30 dk için plastik bir kutu içinde ıslak kağıt havlu koyarak hazırlanan bir nemli odasında.
- REC-8 antikor çözüm olarak her örnek için bir oranı %1:300 30 keçi Serumda hazırlanan 50 µL ekleyin. Gecede 4 ° C'de kuluçkaya
- Slaytları yıkayın 1 x PBS % 0.1 ile içeren bir odasında yerleştirerek ara-20 10 dk. için bir kez yineleyin ve aşırı sıvı slayt köşesinde bir kağıt havlu koyarak kaldırmak.
- İkincil antikor çözüm yeşil fluorophore (488 nm emisyon dalga boyları) konjuge ikincil antikor (1: 1000), phalloidin (aktin leke, 1:4000) ve DAPI (DNA leke, 1:4000) % 30 normal keçi serum içinde sulandrarak hazırlayın.
- İkincil antikor çözüm 50 µL slayda ekleyin.
- Oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
- Slaytları yıkama iki kez 1 x PBS % 0.1 ile içeren bir odaya yerleştirerek ara-20 10 dakika süreyle silin aşırı sıvı.
- Reaktif bir slayda sabitleme 30 µL ekleyin ve 12 mm2 x 1,5 µm coverslip üstüne yerleştirin ve slaytlar 4 ° C'de gecede kuru.
3. confocal mikroskobu
- Confocal mikroskop, lazerler, rezonans tarayıcı ve confocal mikroskop bilgisayar yazılımı açın. Lekeli germlines ile slaytlar slayt sahibi 63 X amaç yukarıda yerleştirin.
- Bir germline, odak üstünde germline bulun ve confocal mikroskop bilgisayar yazılımı kullanarak işaretler. Benzer şekilde germline dibinde odaklanmak ve toplam germline kalınlığı kurmak için işaretler.
- Görüntü en çok 0,5 µm. Mark tam germline ve başlangıç Alım her dilim kalınlığı tanımlayarak tüm germline. Her dilimin 8 kere tarama ve görüntü kalitesini artırmak için değerlerin ortalamasını. Rezonans tarayıcı tarama hızlı görüntüleme sırasında ağartma önlemek için izin verir. Mikroskop bir rezonans tarayıcı varsa, tarama sayısı dört ağartma önlemek için azaltmak.
4. mesaj çekirdeği analiz görüntüleme numarasını ve dağıtım
Not: Ekran görüntüleri kullanılan düğmeler ve yazılım araçları için ek resim 1 bakın.
- Görüntü Imaris 8.4.1 veya yazılımın sonraki sürümleri için alın.
- Mitotik bölge, geçiş bölgesi, segregasyonun bölge, oosit bölge ve germline spermatheca her bölgede nükleer Morfoloji belirleyerek tanımlayın.
- Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı yüzey function butonu (ek şekil 1A) ilgi bölgeyi seçmek için kullanın.
- Otomatik yüzey oluşturma Sihirbazı iptal etmek ve el ile görüntünün ilk ve son dilim ilgi bölge üç boyutlu yığın çizin.
- Oluştur yüzey' i tıklatın.
Not: Yazılım otomatik olarak ilk ve son yığını arasında yığınları gelişecektir. - DAPI hariç tüm kanallar maskesi kanalı düğmesini (Ek şekil 1B-C) maske.
- Spot function butonu (ek şekil 1A) kullanarak nükleer boyutu parametreleri tanımlayın. Mitotik bölgesi için Z çapı tanımsız bırakarak bir XY çapı 2 µm tanımlayın. Geçiş bölgesi için bir XY çapı 2 µm ve Z çapı 1,5 µm. (ek şekil 1 d) tanımlayın.
Not: büyütme ve belirtme-in mikroskop göre çapları ile ilgili sorunları giderme. Geçerli protokol için kullanılan objektif 63 X yapıldı ve fazladan 1,70 kez büyütme görüntüleme sırasında sağlanan. Amaç, örneğin 40 X, değişirse çapları buna göre değiştirilmelidir. Sorun giderme doğru parametreleri kurmak için wildtype germlines ile yapılmalıdır. Bir vahşi tipi germline kolu Mitotik bölgesi yaklaşık 250 çekirdeği vardır. Çapı bu değer elde etmek için değiştirilmesi gerekir. En az 15 germlines çapı en uygun değerini belirlemek için kullanın. Benzer bir yaklaşım geçiş bölgesi (150-170 çekirdeği) ve segregasyonun bölge (600-700 çekirdeği) kalibre için kullanılır. - Noktalar tespiti minimum eşik (ek şekil 1E) tanımlayarak sınırlayın. Kullanım DAPI ilk nokta dışında germline görünene kadar en az üç boyutlu işleme eşik artırarak minimum eşiği belirlemek için vahşi türü germlines lekeli.
- Görüntü kaydetmek ve çekirdek sayısı otomatik olarak yazılım tarafından oluşturulan tablo elde etmek. Görüntüler TIF dosyaları olarak dışa aktarma.
5. analiz Sperm ve kromozom sayısı puanlama için Imaging post
- Faiz bölgesi olarak spermatheca seçerek üç boyutlu işleme gerçekleştirin. Her sperm tespit, spot çapı 0,75 arasında-tanımlamak için 1.0 µm x ve Y-ekseni Z çapı tanımsız kalır iken,. Noktalar function butonu ek şekil 1' de gösterildiği gibi kullanın.
- Yanında tıkırtı arka plan arka plan çıkarmak kutusu ve yazılım (ek şekil 1 d) tarafından hesaplanan arka plan düzeltme değerlerini kullanarak çıkarın.
Not: Imaris yazılım ilk yüksek yoğunluklu puan alır, bölgenin ilgi ve arka plan arasında anlamlı bir fark var olduğu sürece bu nedenle arka plan etkisi en az düzeydedir. Arka plan düzeltme tanımlarken, burada uygun değerleri için arka plan için verilebilir bir ikinci yöntemdir. El ile arka plan düzeltme bağımsız örnekleri yoğunluğunu karşılaştırma ihtiyacı varsa uygun olacaktır. - Tüm lekeli DAPI sperm spermatheca (tamamlayıcı şekil 1E) tespit etmek için üç boyutlu işleme eşik ayarlayın.
- Kromozom sayımı için spot çapı tanımla < x 0,75 µm ve üç boyutlu modelleri geliştirmeden önce Y-eksen.
- Görüntü kaydetmek ve TIF dosyası olarak verin.
6. post Germline hücre iskeleti yeniden inşası için analiz görüntüleme
- İlgi germline bölge tanımlamak ve phalloidin dışında tüm kanallar tıklayarak kanal maskesi maske.
- 0.25 µm yüzey detayını yüzey function butonu (ek şekil 1) kullanarak tanımlayın.
Not: Bu üç boyutlu modelleri içine her 0.25 µm işlenip anlamına gelir. Yüzey ayrıntı germline nerede üç boyutlu yüzey manken-ecek var olmak mahluk her 0.25 µm için herhangi bir bölge için sabit olabilir. Ancak, oosit bölgesi için yüzey ayrıntı için 0,35 - artırılabilir iyi tanımlanmış aktin iplikleri bu bölgedeki varlığı nedeniyle 0.5 µm. - Yanında tıkırtı arka plan arka plan çıkarmak kutusu ve yazılım (ek şekil 1 d) tarafından hesaplanan arka plan düzeltme değerlerini kullanarak çıkarın.
- Üç boyutlu işleme eşik analizi (ek şekil 1E) gerektiren yapısına bağlı olarak ayarlayın.
- Gelişmiş üç boyutlu görüntü kaydetmek ve TIF dosyası olarak verin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 üç boyutlu germline analiz için gereken süreyi gösterir. 20 ° C'de inkübe L4 hünsa germlines yalıtmak için disseke ve DAPI, phalloidin ve germline proteinler karşı antikor lekeli. Germlines kullanarak confocal mikroskobu görüntüsü. Boyama ve confocal mikroskobu gerektirir yaklaşık 24 h sayısal analiz için tam germline sayısını ve konumunu çekirdeği saymak, protein dağıtım tanımlamak, puan ve hücre iskeleti yapısını analiz için 10-15 dk gerektirir sperm sayısı. Tam manuel analiz 2 h germline ücret üzerinden gerektirir ve operatör etkisi tabi olduğunu, bu nedenle, bizim otomatik olarak yüksek üretilen iş yöntemi analiz süresini azaltır ve tekrarlanabilirlik geliştirir.
Çekirdeklerin germline kol yaklaşık 1000-1200 çekirdeği (Şekil 2C), veri1puanlama de daha önce kılavuzu Yayınlandı ile karşılık gelen evler ortaya puanlama otomatik. Puanlama doğruluğunu, birden çok mutantlar ve farklı koşullarda onaylamak için (Şekil 2D-G) kullanılır. Örneğin, rnp-8(tm435), cpb-3(bt17)ve glp-1(e2141) mutant solucanlar vahşi türü hayvanlar için karşılaştırıldı. Otomatik sayma çekirdeği KPB-3 ve glp-1 mutant germlines14,15,16,17sayısı bilinen azalma çoğaltılamaz. Çekirdek sayısı ciddi bir azalma da 25 ° C'de inkübe zaman glp-1(e2141) sıcaklığa duyarlı mutant gözlenmiştir Çekirdeklerin dağıtımını farklılaşma sahnede bağlıdır. Yaklaşık 250 çekirdeği vahşi türü içeren, Mitotik, germline (şekil 3)1diğerleri ile karşılaştırıldığında farklıdır çekirdeği ile sıkı paketlenmiş bölgedir. Mitotik hücre çekirdeği arasındaki aralığı en az düzeydedir ve çekirdekleri Mitotik bölgede yer alır. Ancak, çekirdek distal uç uzak hareket ettirdiğinizde, germline (şekil 3) çevresi doğru daha fazla görünürler. Dağıtım değişikliği geçiş bölgesi başlar ve çekirdekleri mayoz/pachytene girerken tamamlar.
Germline farklılaşma farklı aşamalarında belirli hücre iskeleti yapılara sahiptir. Biz F-aktin germline phalloidin ile boyama tarafından görüntülenmiştir. F-aktin germline proksimal sonuna dağıtıma karşı distal her bölge (şekil 3 ve şekil 5) farklı. Genel olarak, bir 'silindir' silindir içinde görünür iki ayrı yapı vardır Mitotik bölgesi iç aktin belirli bir şekilde (şekil 3) ile sağlam bir kitle olarak görünür. Geçiş bölgesi germline ulaştığı gibi bir daha silindirik yapısı iç aktin varsayar ve geç pachytene ulaşır gibi içi boş bir silindir olur. Aktin ikinci katman için germline şekil veren iç tabaka kapsar. Bu 'silindir silindir içinde' aktin yapı oosit bölge (şekil 5) doğru kaybolur. Oosit bölgesi aktin kalın elyaf görünür. Yumurta spermatheca için hareket izin vermek için dinamik olarak görünse yumurtalar bir aktin rachis tarafından ayrılır. Son olarak, aktin spermatheca içinde Ayrıca kalın demetleri aktin iplikleri oluşturur. Ancak, ambalajlanacak lifler görünür oosit bölgesinde daha yakın. Hücre iskeleti yapı çekirdeği (şekil 3) dağıtım şekillerinin tamamlayacak şekilde görünür. Mitotik bölge çekirdeklerin iç aktin yapısı yerleştirilmesi için görünür. Mayoz/pachytene ulaşmak, çoğunlukla çekirdek (şekil 3) yoksun germline ortasına bırakarak iki aktin silindir arasında çekirdeklerin düzenlemek. Bu muhtemelen kesintisiz sitoplazmik germline akış yardımı olabilir. Germlines REC-8 protein karşı bir antikor ile lekeli ve confocal mikroskobu tarafından analiz edildi. REC-8 homojen germline erken çekirdeklerin dağıtılır ve sonra i ciddi ve mayoz18sırasında bozulmuş. Üç boyutlu kesit analizi REC-8 dağılımı germline Mitotik bölgede (şekil 4) protein dağılımını gösterir.
Üç boyutlu render germline proksimal ucunun spermatheca ve ilk üç yumurta spermatheca için distal içerir. İncelemelerimiz her spermatheca 151 sperm ortalama tanınan (n = 18). Bu yöntem (şekil 5F)19güvenilirliğini gösteren yayınlanmış edebiyat için karşılık gelir. Bu analiz ile birlikte hücre iskeleti gerçekleştirilebilir veya protein dağıtım çalışmaları. C. elegans genom altı kromozomlar arasında dağıtılır. Tam olarak gelişmiş vahşi türü yumurta, bu kromozomlar görülebilir ve sayılabilir. Bu kromozom ayrılık kromozom istikrar ya da yumurta gelişimi ile ilişkili diğer kusurlar eğitim için kullanılabilir. Üç boyutlu işleme, kromozom sayısı görüntülenir ve kromozom düzgün virgülle ayrılmışsa, numarayı doğru bir şekilde (şekil 5) elde edilebilir.
Resim 1 . Zaman çizelgesi için otomatik analizi. C. elegans germline manuel ve sayısal analiz arasında zaman karşılaştırma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Çekirdeklerin dağıtım germline. (A) DAPI Mitotik gösterilen germline, geçiş ve pachytene/segregasyonun bölgeleri lekeli. (B) germline hesaplama üç boyutlu modeli. (C) puanlama için çekirdek vahşi türü germlines içinde toplam sayısı. (D-F) Çekirdekleri sayısı için puanlama Mitotik, geçiş ve vahşi türü, rnp-8, KPB-3ve glp-1 mutant germlines segregasyonun bölgelerinde. (G) buna karşılık çekirdeği 20 ° C ve 25 ° c, glp-1 mutant içinde toplam sayısı Hata çubuğu standart hatasını gösterir. Öğrenci testi. n < 0,0001, ***n < 0,001, **n < 0,01, *n < 0,05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Hücre iskeleti germline yapısını. (A-B) Mitotik bölge, germline iç aktin (kırmızı) sitoiskeleti organizasyonu. İç aktin Mitotik bölge, dış aktin karşılaştırıldığında diffüz bir yapıya sahiptir. (C-D) Pachytene bölge iki silindir aralarında çekirdeği (mavi) düzenlenir oluşturarak bir silindirik yapısı sitoiskeleti varsayar. (E-F) Mitotik ve pachytene bölgelerinde germline çekirdeği organizasyonu. Çekirdeklerin dağıtımını Mitotik bölgesine (yeşil) göre pachytene bölgesi, germtube çevresi doğru daha fazla ve germline ortasına haline çekirdeği yoksun. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . REC-8 ifade Mitotik bölgesinde. (A) bir REC 8 lekeli germline distal sonu gösterilen test. (B-C) REC-8 (mavi renkle gösterilir) Boyama ve dağıtım Mitotik hücre çekirdeği (yeşil) arasında proteinin üç boyutlu render. REC-8 boyama daha az bol proksimal Mitotik bölgesine (çekirdeklerin temsil eden beyaz nokta ile işaretli). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Proksimal sonunda germline yapısı. (A) DAPI germline proksimal sonunda, boyama. (B) üç boyutlu işleme spermatheca (sarı) gösteren sperm ve yumurta (beyaz) kromozomlar boyama DAPI. (C-E) Üç boyutlu hücre iskeleti yapısı germline proksimal ucunda. Kırmızı tam proksimal sonunu işaretler ve yeşil spermatheca işaretler. Çapraz kesit analizi sitoiskeleti sadece yumurta etrafında aktin ipliksi yapısını oluşturur, ama aynı zamanda yumurtalar arasında ayıran gösteriyor. (F) her spermatheca ve birden çok spermatheca elde edilen ortalama sperm sayısını gösteren grafik (n = 18). Hata çubuğu standart hatasını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek resim 1 . Yazılım araçları açıklama. (A) noktalar ve çekirdek ve protein boyama tespit için yüzey araçları. (B-C) İlgi yüzey aracını kullanarak üç boyutlu bölge seçimi. (D) XY-çapı, çekirdeği algılama için noktalar aracını kullanarak tanımlama. Faiz ve boyama bölgeye bağlı olarak, z ekseni çapı ve arka plan düzeltme kullanılabilir. (E) en az ve en fazla yoğunluk eşik algılama. Benzer bir yaklaşım-ebilmek var olmak kullanılmış için yüzey işlevi çapı tanımlamak nerede yerine ve yüzey detayları tanımlanabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı doğruluğunu geliştirmek ve germline analiz için gereken süreyi azaltmak için hedeftir. Disseke germlines standart hazırlanması sonra germline çekirdeği üç boyutlu bir model Hesaplamalı işleme tarafından hazırlanmıştır. Germline çekirdeği dağıtım uzay gözlem izin verirken, üç boyutlu işleme germline belirli bölgelerinde, çekirdeği sayısını hesaplar. Önemli bir özelliği, bizim yöntemi çekirdek boyutu ve şekli parametreleri doğru tanımıdır. Bu boyama ve kullanılan büyütme netlik üzerinde bağlıdır görüntü için. Biz yönteminin doğruluğunu Yayınlanan el ile analiz veri1karşılaştırarak doğruladı. Daha fazla bizim yöntem doğruluğunu onaylamak için kullanılan farklı koşullar altında birden fazla mutantlar ve sonuçları Yayınlanan edebiyat ile doğruladı. Yöntemi ince ve güçlü fenotipleri - algılama yeteneğini de doğruladı KPB-3 ve glp-1 mutantlar, anılan sıraya göre. Buna ek olarak, bu yöntem çekirdek boyutu ve şekli germline içinde veya suşları arasında bile değişikliklere uyum gösterir. Bu özellik ayrıca kimliği ve germline kromozomlar ve sperm gibi daha küçük yapıların puanlama olanak sağlar. Yöntemi aynı zamanda daha fazla boyutu ve şekli parametreleri için sorun giderme gerekirse sağlar. Bizim analiz ve çekirdekleri germline içinde dağıtım aydınlatmak başardı gösterdi ki içinde Mitotik hücre çekirdeği ve pachytene bölgeleri farklı desen düzenlenir. REC-8 ve DAPI boyama için üç boyutlu işleme uygulayarak, biz de REC-8 dağıtım Mitotik bölge çekirdekleri içinde gösterdi.
Aktin boyama üç boyutlu işleme ayrıntılı inceleme germline hücre iskeleti yapıları, etkin. Fiziksel teması rağmen germline iki ayrı aktin yapıları, var gibi görünüyor. Tüm germline sitoiskeleti yeniden tek bir varlık olarak mümkün olsa da, en iyi sonuçları ilgi bölgelerinde içine Mitotik önceden seçilmiş olarak gösterilir Eğer elde edilebilir, geçiş ve segregasyonun bölgeler. Distal germline sitoiskeleti proksimal sonunda ipliksi bir yapıda oluşturulduğunu ve tanımsız bir şekli vardır. Bizim bu nedenle üç boyutlu rekonstrüksiyon germline aktin sitoiskeleti aktin dağıtım farklılıkları barındırmak için belirli parametreleri tanımlayarak sağlayan protokol. En kritik analizi çekirdek boyutu ve yüzey ayrıntı gereksinimi gibi parametreleri tanımı yönüdür. Gerçek boyutu aşağıda çekirdek boyutu düşürmek olduğu gibi ayrı nesneler çekirdek içinde parlak noktalar almak için yazılım göze. Benzer şekilde, yüksek yüzey detayları değerleri doğru üç boyutlu yapılar kaybına yol açacaktır. Önerilen yöntem diseksiyon ve germline boyama kalitesini duyarlığını kullanır. Hasarlı germline çekirdek sürümü yanlış numaralandırma neden germline neden olabilir. Boyama üzerinden yüksek arka plan da yanlış çekirdek sayısı ve uygun olmayan üç boyutlu işleme neden olur.
Bizim yöntem nereye biz çekirdek sayısı ve dağıtım/deyim tek iletişim kuralı20uzayda germline proteinlerin analiz edebiliyoruz germline analiz daha önce bilinen otomatik yöntemleri genişletir. İkinci olarak, bizim yöntem kromozomlar germline içinde gibi daha küçük yapıların puanlama sağlar. Kromozom segregasyon oosit geliştirme21önemli bir yönüdür. Bizim yöntemini kullanarak, numarası ve kromozomlar nerede mesafe vahşi türü yumurta karşı ayarlama tarafından tanımlanabilir konumunu algılamak mümkündür. Kromozom ayrılık etkileyen herhangi bir mutasyon bu aracı kullanarak okudu olabilir. Ayrıca, yöntem 2-hücre aşamada kromozomlar embriyo içinde çalışmaya genişletilebilir. Sayısal analiz Ayrıca hücre iskeleti yapıları olan kromozomlarının bir yumurta ve germline spermatheca sperm sayısını sağlar. Birlikte ele alındığında, kapsamlı analiz analiz süresini önemli ölçüde azaltırken bir protokolü kullanarak C. elegans germline yöntemdir. Bu yöntem her analiz (çekirdek numarası, protein dağıtım ve hücre iskeleti yapısı) için birden çok araç gerekliliğini ortadan kaldırır ve belirli herhangi bir yazılım gerekli kodlama zaman kaldırır. Son olarak, bu yöntem etkili uyuşturulan canlı solucanlar üç boyutlu analizi de dahil olmak üzere diğer solucan çalışmalar için genişletilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çatışma bildirin.
Acknowledgments
Monash Microimaging onların teknik destek için teşekkür ederiz. Bazı suşları NIH ofisi araştırma altyapı programları (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis genetik Merkezi tarafından temin edilmiştir. Bu eser bir Monash Üniversitesi Biyomedikal keşif Bursu, NHMRC proje desteği (GNT1105374), NHMRC üst düzey araştırma bursu (GNT1137645) ve veski yenilik bursu tarafından desteklenmiştir: Roger Pocock VIF 23.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
References
- Hubbard, E. J. Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology. Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).
- Kershner, A., et al. Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).
- Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (2), 88372 (2014).
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).
- Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crittenden, S. L., et al. A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans. Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).
- Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).
- Schumacher, B., et al. Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis. Cell. 120 (3), 357-368 (2005).
- McMullen, P. D., et al. Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress. PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).
- Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. Physiological control of germline development. Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).
- Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).
- Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development. Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).
- Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development. Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).
- Austin, J., Kimble, J. glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell. 51 (4), 589-599 (1987).
- Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors. Development. 124 (4), 925-936 (1997).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).
- Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
- Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).
- Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells. Development. 139 (5), 859-870 (2012).
- Laband, K., et al. Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes. Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).
