Summary
Vi præsenterer en automatiseret metode for tre-dimensionelle genopbygning af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel. Vores metode bestemmer antallet og placeringen af hver kerne inden for kønscelleoverførsel og analyser kønscelleoverførsel protein fordeling og cytoskeletal struktur.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) kønscelleoverførsel bruges til at studere adskillige biologisk vigtige processer herunder stamceller udvikling, apoptose og kromosom dynamics. Mens germline er en fremragende model, er analysen ofte to dimensionelle på grund af tid og arbejdskraft nødvendige for tre-dimensionelle analyse. Store udlæsninger i sådanne undersøgelser er nummeret/placeringen af kerner og protein fordeling i germline. Vi præsenterer her, en metode til at udføre automatiseret analyse af genom ved hjælp af Konfokal mikroskopi og beregningsmæssige metoder til at bestemme antallet og placeringen af kerner i hver region af germline. Vores metode analyserer også kønscelleoverførsel protein fordeling, der gør det muligt for de tre-dimensionelle undersøgelse af protein udtryk i forskellige genetiske baggrunde. Yderligere, vores undersøgelse viser variationer i cytoskeletal arkitektur i forskellige regioner af de germline, der kan rumme specifikke rumlige udviklingsmæssige krav. Endelig, vores metode muliggør automatisk optælling af sæd i spermatheca af hver kønscelleoverførsel. Tilsammen, vores metode giver mulighed for hurtig og reproducerbare fænotypiske analyser af C. elegans kønscelleoverførsel.
Introduction
Bevarelse af signalering veje med pattedyr gør C. elegans en fremragende model til at studere flere biologiske processer1,2. I vores laboratorium bruger vi C. elegans kønscelleoverførsel at studere stamcelle udvikling, apoptose og genekspression. Mens germline er en tredimensionel struktur, er mange undersøgelser to dimensionelle følge af tre-dimensionelle analyse tidskrævende og arbejdskrævende. Det er meget sandsynligt, at to-dimensionelle analyse kan forvanske i vivo begivenheder i germline. C. elegans voksen hermafrodit har to kønscelleoverførsel arme, hver især huser en somatisk distale tip celle (DTC), der fastholder distale kønsceller i en udifferentieret tilstand3,4. Disse kimceller begynde at skelne, når de bevæger sig væk fra DTC, undslippe sin indflydelse, og bliver æg og sæd når de når den proksimale ende af germline. Under denne proces gennemgå kønscelle kerner mitose, før du skifter til meiose5,6. Sperm produktion er afsluttet af larve fase 4 (L4) af udvikling, hvorefter oocyter er produceret i løbet af voksenlivet. Sædceller er gemt i spermatheca hvor de befrugte oocytter til at generere embryoner.
Der er flere genetiske og miljømæssige faktorer, der kan have indflydelse på genom udvikling i C. elegans resulterer i ændringer i antallet af kerner, antal apoptotiske begivenheder, kromosom dynamics, og protein udtryk og/eller lokalisering7 ,8,9,10,11. Analysen af disse begivenheder kræver identifikation af hver enkelt fase af differentiering baseret på nuklear morfologi og distribution. For præcist at analysere disse parametre manuelt med en stor stikprøve er arbejdskrævende og tidskrævende. At omgå disse ulemper og aktivere konsekvens af analyse, vi udviklede en automatiseret metode for tre-dimensionelle undersøgelse af C. elegans kønscelleoverførsel for kerner optælling, kerner distribution, protein udtryk, og cytoskeletal struktur. Ved at kombinere konfokalmikroskopi med tre-dimensionelle gengivelse, genereret vi størrelsen og formen parametre til identifikation af hver enkelt fase af kønscelle differentiering. Yderligere, denne metode giver mulighed for optælling af kønscelle kerner og sæd plus scoring af kromosomtal i hver oocyt.
En afgørende struktur i germline er cytoskeleton, som giver stabilitet til kønscelleoverførsel rum, aids cytoplasmatisk streaming og beskyttelse til kønscelleoverførsel kerner12. Bruger beregningsmæssige rendering, vi udført tre-dimensionelle genopbygning af germline cytoskelettet og identificeres særskilt cytoskeletal funktioner inden for germline. Her, beskriver vi en trinvis protokol for at illustrere hvordan beregningsmæssige analyse kombineret med Konfokal imaging giver omfattende analyse af C. elegans kønscelleoverførsel.
Vi foreslår en hurtig metode til tre-dimensionelle analyse af C. elegans kønscelleoverførsel (figur 1). Med tre-dimensionelle analyse, er det muligt at studere tredimensionale distribution af kønscelleoverførsel kerner (figur 2 og figur 3), automatiseret tælling af celler (figur 2), genopbygning af germline cytoskelettet ( Figur 3), fordeling af proteiner (figur 4), og han scorede antallet af sædceller i spermatheca og kromosomer i oocyter (figur 5). Metoden, der ikke kun giver mulighed for nem og præcis kvantificering af germline men identificerer fysiologisk relevante fænotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse og ormen dyrehold
Bemærk: Se Tabel af materialer til alle produktinformationer.
- OP50 Escherichia coli kultur: kultur OP50 bakterier i Lysogeny bouillon (LB) (1% trypton, 0,5% gær, 0,5% NaCl, pH 7,0) natten over ved 37 ° C uden antibiotika.
- Seed 400 µL af OP50 bakterier til at ødelægge vækst medier (NGM) plader (1,5 g NaCl, 8,5 g agar, 1,25 g af pepton, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL af 5 mg/mL kolesterol i ethanol, 1 mL 1 M MgSO4 og 25 mL 1 M KPO4 buffer) og luft tørre bakterier for 48 h.
- Vælge orme på seedede NGM plader og inkuberes ved 15 ° C eller 20 ° C.
- Til analyse af de voksne hermafrodit kønscelleoverførsel pick velnærede L4 orme til bakteriel plænen og inkuberes natten over ved 20 ° C.
- For scoring sperm antallet i hermafroditter, Ruger L4 orme ved 20 ° C i 12 timer indtil ormene når L4/voksen molt. For at synkronisere orme til stadiet L4, forberede æg af picking voksne orme med en masse æg i blegemiddelopløsning (1 M NaOH og blegemiddel i forholdet 1:1). Tillad æg udklækkes og vælge L4 dyr for eksperimentet.
- Forberede Teflon objektglas ved at placere 25 µL af poly-L-lysin løsning på diaset og sprede løsningen, ved hjælp af en pipette tip. Efter at fjerne overskydende poly-L-lysin med køkkenrulle, tillade dias til at lufttørre og glassene inkuberes ved 65 ° C i 15-20 min.
2. kønscelleoverførsel dissektion og farvning6,13
- Spot 10 µL 0,01% tetramisole (bedøvende) på en 22 mm × 22 mm coverslip og pluk one - dag gamle voksne orme ind i den.
- Dissekere ormen på halen, som det bliver bedøvet ved hjælp af en sprøjte (5 mL) og en nål (24 "x 1"), og sikre at germline ikke er beskadiget.
Bemærk: Dissektion skal foretages, inden ormen bliver fuldt lammet, således at det negative tryk i orm og orm bevægelse støtte udslyngning af germline. For scoring sperm, træffes forholdsregler ikke at beskadige spermatheca af nålen under dissektion. Undgå at berøre germline med nål undtagen det dissektion efter spermatheca. Hvis der er pause i germline rum eller enhver udledning fra germline overholdes, bør germline ikke kan bruges til analyseformål. - Sted det inverterede coverslip på en poly-L-lysin belagt slide, holde den dissekeret kønscelleoverførsel på diaset.
- Fjern overskydende væske under coverslip ved at placere et papir tårn på et hjørne af den coverslip, derefter sted diaset i flydende nitrogen for 1 min. hurtigt fjerne coverslip ved hjælp af en nål med germlines på diaset.
- Overføre dias til-20 ° C methanol til 30-60 s i et kammer og derefter inkuberes i 30 min i frisklavede fastsættelse løsning (1 x phosphat bufferet saltvand (PBS) indeholdende 0,08 M HEPES pH 6,9, 1,6 mM MgSO4, 0,8 mM ethylenglycol-bis(beta-aminoethyl æter)-N, N, N', N'-tetraacetic syre (EGTA) og 3,7% PARAFORMALDEHYD) ved stuetemperatur.
- Vaske dias ved at placere i et kammer, som indeholder 1 x PBS, pH 7,4 med 0,1% Tween-20 til 10 min. Gentag trinnet én gang.
- Blokere germlines med 30 µL blokerende løsning (30% af ged serum fremstillet ved at tilføje 900 µL af ged serum i 1700 µL af destilleret H2O og 300 µL 10 x PBS) i et fugtigt kammer forberedt ved at placere våd køkkenrulle i en plastikboks ved stuetemperatur i 30 min.
- Tilsæt 50 µL af REC-8 antistof rengøringsopløsning, i 30% ged serum i en forholdet 1: 300 til hver prøve. Der inkuberes natten over ved 4° C.
- Vaske dias ved at placere i et kammer, som indeholder 1 x PBS med 0,1% Tween-20 til 10 min. Gentag trin en gang og fjerne overskydende væske ved at placere en køkkenrulle på hjørnet af diaset.
- Forberede sekundær antistof løsning ved at fortynde grøn fluorophore (488 nm emission bølgelængde) konjugeret sekundær antistof (1:1000), phalloidin (aktin pletten, 1:4000) og DAPI (DNA pletten, 1:4000) i 30% normal ged serum.
- Tilføje 50 µL af sekundær antistof løsning til diaset.
- Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
- Vaske dias to gange ved at placere i et kammer, som indeholder 1 x PBS med 0,1% Tween-20 til 10 min. aftørre overskydende væske.
- Tilføj 30 µL af fastsættelse af reagens i diaset og placere en 12 mm2 x 1,5 µm coverslip på toppen og tørre dias ved 4 ° C natten over.
3. konfokalmikroskopi
- Tænde Konfokal mikroskop, lasere, resonant scanner og konfokal mikroskop software. Placer dias med farvede germlines på diasholderen over 63 X målet.
- Find en genom, fokus på toppen af germline og markere den bruger Konfokal mikroskop software. Ligeledes fokuserer på bunden af germline og markeres for at etablere den samlede genom tykkelse.
- Billede af hele kønscelleoverførsel ved at definere tykkelsen af hver skive op til 0,5 µm. Mark den komplette kønscelleoverførsel og start erhvervelse. Scanne hver skive 8 gange og middelværdier for at forbedre billedkvaliteten. Den rungende scanner tillader hurtig scanning for at undgå blegning under imaging. Hvis mikroskop ikke har en resonant scanner, reducere antallet af scanninger til fire at undgå blegning.
4. indlæg Imaging analyse af kerner antal og fordeling
Bemærk: Se tillægs figur 1 for screenshots af de software-værktøjer og knapper, der bruges.
- Import billedet til Imaris 8.4.1 eller senere versioner af softwaren.
- Definere mitotiske region, overgangszone, meiotiske region, oocyt region og spermatheca af germline ved at identificere de nukleare morfologi i hver region.
- Brug funktionsknappen overflade (supplerende figur 1A) af softwaren til at vælge region af interesse.
- Annullere guiden til automatiske overflade oprettelse og manuelt tegne region af interesse på det første og sidste udsnit af billedet fra den tredimensionel stak.
- Klik på Opret overflade.
Bemærk: Softwaren vil automatisk udvikle stakke mellem første og sidste stak. - Maskere alle kanaler undtagen DAPI ved at klikke på maske kanal (Supplerende figur 1B-C).
- Definere nukleare størrelse parametre ved hjælp af funktionsknappen spot (supplerende figur 1A). Definere en XY-diameter på 2 µm mens Z diameter udefineret for regionen mitotiske. Definere en XY-diameter på 2 µm og Z diameter for overgangszone, som 1,5 µm. (tillægs figur 1 d).
Bemærk: Fejlfinding i forbindelse med diametre forstørrelse og specifikationer af mikroskopet. For den nuværende protokol, mål anvendes var 63 X og givet en ekstra 1,70 gange forstørrelse under imaging. Hvis målet ændrer for eksempel 40 X, bør diameteren ændres i overensstemmelse hermed. Fejlfinding skal udføres med vildtype germlines at fastlægge de korrekte parametre. En vildtype kønscelleoverførsel arm mitotiske regionen har ca 250 kerner. Diameter bør ændres for at opnå denne værdi. Brug mindst 15 germlines til at bestemme den optimale værdi for diameteren. En lignende fremgangsmåde bør anvendes til kalibrering overgangszone (150-170 kerner) og meiotiske region (600-700 kerner). - Begrænse påvisning af steder ved at definere minimumstærskel (supplerende figur 1E). Brug DAPI farves vildtype germlines at etablere minimumstærskel ved at forhøje tærsklen minimum tre-dimensionelle gengivelse indtil det første stedet vises uden for germline.
- Opspare billedet og få antallet af kerner fra tabellen genereres automatisk af softwaren. Eksportere billederne som TIF-filer.
5. post Imaging analyse for Scoring Sperm og kromosomtal
- Udføre tre-dimensionelle gengivelse ved at vælge spermatheca som region af interesse. At opdage hver sperm, definere stedet diameter mellem 0,75 - 1,0 µm for X og Y-aksen, mens Z diameter forbliver udefineret. Brug knappen steder funktion, som vist i tillægs figur 1.
- Subtrahere baggrunden ved at afkrydse baggrund trække boksen og ved hjælp af baggrunden korrektion værdier beregnet ved software (tillægs figur 1 d).
Bemærk: Imaris software picks høj intensitet point først, derfor effekten af baggrunden er minimal, så længe der er betydelig forskel mellem det pågældende område, og baggrunden. En anden metode er at definere baggrundskorrektion manuelt, i givet fald værdier kan gives til baggrunden. Manuel baggrundskorrektion vil være hensigtsmæssigt, hvis intensiteten af uafhængige prøver har brug for sammenligning. - Justere den tre-dimensionelle gengivelse tærskel for at opdage alle DAPI farves sperm i spermatheca (supplerende figur 1E).
- For kromosom counting, definere stedet diameter < 0,75 µm for X og Y-aksen før udviklingen af tre-dimensionelle modeller.
- Opspare billedet og eksportere som TIF-fil.
6. post Imaging analyse for Cytoskeletal genopbygning af Germline
- Identificere region af interesse i germline og maske alle kanaler undtagen phalloidin ved at klikke på maske kanaler knap.
- Definere en overflade detaljer på 0,25 µm ved hjælp af funktionsknappen overflade (tillægs figur 1).
Bemærk: Dette betyder, at hver 0,25 µm gengives i tre-dimensionelle modeller. Overflade detaljer kan være konstant for enhver region i germline hvor der oprettes en tredimensional overflade model for hver 0,25 µm. Men for regionen oocyt overflade detaljer kan øges til 0,35 - 0,5 µm skyldes tilstedeværelsen af veldefinerede actin fibre i denne region. - Subtrahere baggrunden ved at afkrydse baggrund trække boksen og ved hjælp af baggrunden korrektion værdier beregnet ved software (tillægs figur 1 d).
- Justere tre-dimensionelle gengivelse tærskel afhængigt af den struktur, som kræver analyse (supplerende figur 1E).
- Gem den udviklede tre-dimensionelle billede og eksportere som en TIF-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser den nødvendige tid til tre-dimensionelle kønscelleoverførsel analyse. L4 hermafroditter inkuberes ved 20 ° C blev dissekeret for at isolere germlines og farves med DAPI, phalloidin og antistoffer mod kønscelleoverførsel proteiner. Germlines er afbildet ved hjælp af Konfokal mikroskopi. Farvning og konfokal mikroskopi kræver ca 24 h. beregningsmæssige analyse til den komplette kønscelleoverførsel kræver 10-15 min at tælle antal og placering af kerner, identificere protein fordeling, analysere cytoskeletal struktur og score den antallet af sædceller. Komplet manual analyse kræver mere end 2 timer pr. kønscelleoverførsel og er underlagt operatør indflydelse, derfor vores automatiserede høj overførselshastighed metode reducerer tid, analyse og forbedrer reproducerbarhed.
Automatiseret kerner scoring afslører, at en kønscelleoverførsel arm huser ca 1.000-1.200 kerner (figur 2C), svarer godt med tidligere udgivet håndbog scoring data1. At bekræfte nøjagtigheden af scoring, flere mutanter og forskellige betingelser er brugt (figur 2D-G). For eksempel, sammenlignede vi rnp-8(tm435), cpb-3(bt17)og glp-1(e2141) mutant orm vildtype dyr. Automatiseret tælle gengivet den kendt reduktion af antallet af kerner i cpb-3 og glp-1 mutant germlines14,15,16,17. En svær reduktion kerner antallet blev også observeret i glp-1(e2141) temperatur-følsomme mutant når inkuberes ved 25 ° C. Fordelingen af kerner er afhængig af fase af differentiering. Regionen mitotiske, som indeholder ca 250 kerner i vildtype, er tæt pakket med kerner i forhold til resten af germline (figur 3)1. Afstanden mellem mitotiske kerner er minimal og kerner er placeret overalt i regionen mitotiske. Når atomkerner bevæge sig væk fra distale ende, vises de dog mere i retning af omkredsen af kønscelleoverførsel (figur 3). Ændringen i distribution starter ved overgangszonen og fuldender som atomkerner Angiv meiose/pachytene.
Germline har specifikke cytoskeletal strukturer på forskellige stadier af differentiering. Vi visualiseret F-actin ved farvning kønscelleoverførsel med phalloidin. Fordelingen af F-actin fra den distale til den proksimale ende af germline var særskilt på hver region (figur 3 og figur 5). Der er generelt to separate strukturer, der vises som en «cylinder inden for cylinder.» På regionen mitotiske vises indre actin som en fast masse med en bestemt figur (figur 3). Som germline når overgangszonen, den indre actin antager en mere cylindrisk struktur og bliver det en hul cylinder som den når slutningen pachytene. Det andet lag af actin dækker den inderste lag giver form til germline. Denne cylinder inden for cylinder actin struktur forsvinder mod oocyt region (figur 5). På regionen oocyt vises actin som tyk fibre. Oocyter er adskilt af en actin rachis, selvom det ser ud til at være dynamisk at tillade flytning af oocytter til spermatheca. Endelig danner actin i spermatheca også tykke bundter af actin fibre. Fibrene synes imidlertid at være pakket tættere end i regionen oocyt. Strukturen cytoskeletal synes at supplere spredningsmønstre for kerner (figur 3). På regionen mitotiske synes atomkerner placeres rundt om den indre actin struktur. Da de når meiose/pachytene, organisere atomkerner mellem de to actin cylindre forlader midten af kønscelleoverførsel for det meste uden kerner (figur 3). Dette kunne sandsynligvis støtte uafbrudt cytoplasmatisk streaming i germline. Germlines var farves med et antistof mod REC-8 protein og analyseret af Konfokal mikroskopi. REC-8 er er homogent fordelt rundt tidlige kerner af germline og senere kløvet og forringet under meiose18. REC-8 distribution i tre-dimensionelle tværsnits analyse af germline viser fordelingen af protein i regionen mitotiske (figur 4).
Tre-dimensionelle gengivelse af den proksimale ende af germline omfatter spermatheca og første tre oocyter distalt for spermatheca. Vores analyse anerkendt et gennemsnit på 151 sædceller i hver spermatheca (n = 18). Dette svarer til den publicerede litteratur, med angivelse af pålideligheden af metode (figur 5F)19. Denne analyse kan udføres sammen med cytoskeletal eller protein fordeling undersøgelser. C. elegans genom er fordelt på seks kromosomer. I fuldt udviklet vildtype oocytter, disse kromosomer er synlige og kan tælles. Denne kromosom adskillelse kan bruges til at studere kromosom stabilitet eller andre defekter, tilknyttet oocyt udvikling. Af tre-dimensionelle gengivelse, antallet af kromosomer kan visualiseres, og hvis kromosomerne er separeret korrekt, nummeret præcist kan fås (figur 5).
Figur 1 . Tisdlinje for automatiseret analyse. Tid sammenligning mellem manuel og beregningsmæssige analyse af C. elegans kønscelleoverførsel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Kerner distribution i germline. (A) DAPI farves genom viser mitotiske, overgang og pachytene/meiotiske regioner. B beregningsmæssige tre-dimensionelle model af germline. C Scoring for det samlede antal kerner i vildtype germlines. (D-F) Scoring for antallet af kerner på mitotiske, overgang og meiotiske regioner af vildtype, rnp-8, cpb-3og glp-1 mutant germlines. (G) sammenligning i det samlede antal kerner i glp-1 mutant ved 20 ° C og 25 ° C. Fejllinje repræsenterer standardfejl. Elevs test. n < 0,0001, ***n < 0,001, **n < 0,01, *n < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Cytoskeletal struktur af germline. (A-B) Organisation af indre actin (rød) cytoskelettet af kønscelleoverførsel på den mitotiske region. Den indre actin har en diffus struktur i forhold til ydre actin på den mitotiske region. (C-D) På regionen pachytene antager cytoskelettet en cylindrisk struktur ved at danne to cylindre mellem som kerner (blå) er organiseret. (E-F) Organisation af kønscelleoverførsel kerner i regionerne mitotiske og pachytene. Fordelingen af kerner er mere i retning af omkredsen af 'germtube' på det pachytene område i forhold til mitotiske region (grøn) og midten af germline bliver blottet for kerner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . REC-8 udtryk i regionen mitotiske. (A) Mikrograf viser den distale ende af en REC-8-farvede kønscelleoverførsel. (B-C) Tre-dimensionelle gengivelse af REC-8 farvning (vist i blåt) og fordeling af protein mellem de mitotiske kerner (grøn). REC-8 farvning er mindre rigelige proksimalt for mitotiske regionen (markeret med hvide prikker repræsenterer kerner). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Kønscelleoverførsel struktur på den proksimale ende. (A) DAPI farvning af kønscelleoverførsel på den proksimale ende. (B) tre-dimensionelle gengivelse af DAPI farvning viser sædceller i spermatheca (gul) og kromosomer i oocyter (hvid). (C-E) Tre-dimensionelle cytoskeletal struktur på den proksimale ende af germline. Rød markerer den komplette proksimale ende og grøn markerer spermatheca. Cross Sektional analyse viser at cytoskelettet ikke kun danner en tråddannende struktur af actin omkring oocytter, men også adskiller mellem oocyter. (F)-graf viser antallet af sædceller i hver spermatheca og gennemsnit af flere spermatheca (n = 18). Fejllinje repræsenterer standardfejl. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1 . Software værktøjer beskrivelse. (A) de steder og overflade værktøjer til detektion af kerner og protein farvning. (B-C) Udvalg af tre-dimensionelle region af interesse ved hjælp af værktøjet overflade. D definere XY-diameter, brug af steder værktøj til registrering af kerner. Afhængigt af regionen af interesse og farvning, kan z-aksen diameter og baggrunden korrektion bruges. (E) minimum og maksimal lysstyrke tærsklen påvisning. En lignende fremgangsmåde kan benyttes til overfladen funktion hvor i stedet for at definere diameteren og overflade detaljer kan defineres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne protokol er at forbedre nøjagtigheden og reducere den tid, der kræves for kønscelleoverførsel analyse. Efter standardpraeparat af dissekerede germlines, er en tre-dimensionelle model af kønscelleoverførsel kerner udarbejdet af computational rendering. Samtidig giver mulighed for observation af kønscelleoverførsel kerner fordeling i rummet, beregner tre-dimensionelle gengivelse antallet af kerner på bestemte områder af germline. Den kritiske aspekt af vores metode er nøjagtig definition af størrelsen og formen Parametre for kerner. Dette afhænger af klarhed af farvning og forstørrelse bruges til billedet. Vi bekræftede metodens nøjagtighed ved at sammenligne med offentliggjort manuelt analyseret data1. Du kan yderligere bekræfte rigtigheden af vores metode, vi brugte flere mutanter under forskellige forhold og bekræftede resultater med publicerede litteratur. Det bekræftede også en metodes evne til at registrere subtile og stærk fænotyper - cpb-3 og glp-1 mutanter, henholdsvis. Desuden viser denne metode tilpasningsevne til ændringer i kerner størrelse og form i germline eller endda mellem stammer. Denne egenskab giver også mulighed for identifikation og scoring af mindre strukturer i kønscelleoverførsel som kromosomer og sperm. Metoden giver også mulighed for yderligere fejlfinding for størrelsen og formen parametre, hvis det kræves. Vores analyse var i stand til at klarlægge fordelingen af kerner i germline og viste, at kerner i mitotiske og pachytene regioner er organiseret i forskellige mønstre. Ved at anvende tredimensionale rendering REC-8 og DAPI farvning, viste vi også fordelingen af REC-8 inden for kerner i regionen mitotiske.
Tre-dimensionelle gengivelse af actin farvning aktiveret detaljeret gennemgang af kønscelleoverførsel cytoskeletal strukturer. Germline synes at have to separate actin strukturer, selv om de holde sig i fysisk kontakt. Genopbygningen af cytoskeleton for den hele genom er muligt som en enkelt enhed, de bedste resultater kan opnås, hvis regioner af interesse er forvalgt i mitotiske, overgang, og meiotiske regioner. Distale kønscelleoverførsel cytoskeleton har en udefineret form og udvikler sig til en tråddannende struktur på den proksimale ende. Vores protokollen giver derfor mulighed for tre-dimensionelle genopbygning af kønscelleoverførsel actin cytoskeleton ved at definere specifikke parametre for at imødekomme forskellene i actin distribution. Det mest kritiske aspekt af analysen er definitionen af parametre som kerner størrelse og overflade detaljer krav. Sænke kerner størrelse under den faktiske størrelse vil risikere software at vælge lyse steder inden for kerner som separate objekter. Ligeledes vil høj overflade detaljer værdier føre til tab af præcise tredimensionale strukturer. Den foreslåede metode bygger på præcisionen af dissektion og kvaliteten af de germline farvning. En beskadiget kønscelleoverførsel kan føre til udgivelsen af kerner fra den germline, forårsager upræcise nummerering. Høj baggrund fra farvning vil også medføre unøjagtige kerner count og forkert tre-dimensionelle gengivelse.
Vores metode udvider tidligere kendte automatiserede analysemetoder kønscelleoverførsel hvor vi er i stand til at analysere kerner antal og distribution/udtryk for kønscelleoverførsel proteiner i rummet med en enkelt protokol20. For det andet vores metode giver mulighed for scoring af mindre strukturer som kromosomer inden for germline. Kromosom segregation er et vigtigt aspekt af oocyt udvikling21. Med vores metode, er det muligt at registrere antallet og placeringen af kromosomer hvor afstanden kan defineres ved kalibrering mod vildtype oocyter. Enhver mutation, der påvirker kromosom adskillelse kan studeres ved hjælp af dette værktøj. Metoden kan også udvides til at studere kromosomer i embryoner på de 2-celle stadium. Den beregningsmæssige analyse giver også antallet af sædceller i spermatheca, antallet af kromosomer i en oocyt og kønscelleoverførsel cytoskeletal strukturer. Tilsammen, giver metoden omfattende analyse af C. elegans kønscelleoverførsel ved hjælp af en enkelt protokol samtidig reducere analyse tid betydeligt. Metoden fjerner kravet om flere værktøjer til hver analyse (kerner antal, protein fordeling og cytoskeletal struktur) og fjerner den kodning tid i nogen specifik software. Endelig kan denne metode forlænges effektivt til andre orm studier herunder en tre-dimensionelle analyse af bedøvet levende orme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Monash Microimaging for deres tekniske support. Nogle stammer blev leveret af Caenorhabditis genetik Center, som er finansieret af NIH Office for forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Dette arbejde blev støttet af en Monash Universitet biomedicin Discovery Fellowship, NHMRC Project Grant (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) og veski innovation fellowship: VIF 23 til Roger Pocock.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
References
- Hubbard, E. J. Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology. Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).
- Kershner, A., et al. Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).
- Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (2), 88372 (2014).
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).
- Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crittenden, S. L., et al. A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans. Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).
- Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).
- Schumacher, B., et al. Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis. Cell. 120 (3), 357-368 (2005).
- McMullen, P. D., et al. Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress. PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).
- Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. Physiological control of germline development. Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).
- Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).
- Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development. Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).
- Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development. Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).
- Austin, J., Kimble, J. glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell. 51 (4), 589-599 (1987).
- Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors. Development. 124 (4), 925-936 (1997).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).
- Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
- Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).
- Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells. Development. 139 (5), 859-870 (2012).
- Laband, K., et al. Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes. Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).
