Summary
Presentiamo un metodo automatico per la ricostruzione tridimensionale della linea germinale Caenorhabditis elegans . Il nostro metodo determina il numero e la posizione di ogni nucleo all'interno del germline e la distribuzione di analisi germinale della proteina e la struttura del citoscheletro.
Abstract
La linea germinale Caenorhabditis elegans (c. elegans) è usata per studiare i diversi processi biologicamente importanti tra cui dinamiche di sviluppo, apoptosi e cromosoma della cellula formativa. Mentre la linea germinale è un eccellente modello, l'analisi è spesso due dimensioni a causa del tempo e la manodopera necessaria per l'analisi tridimensionale. Principali letture in tali studi sono il numero/posizione dei nuclei e della distribuzione della proteina all'interno della linea germinale. Qui, presentiamo un metodo per eseguire l'analisi automatica della linea germinale usando microscopia confocale e approcci computazionali per determinare il numero e la posizione dei nuclei in ogni regione della linea germinale. Il nostro metodo analizza anche distribuzione di proteina di germline che consente l'esame tridimensionale dell'espressione proteica in differenti ambiti di provenienza genetici. Ulteriormente, il nostro studio mostra variazioni nell'architettura del citoscheletro in regioni distinte della linea germinale che può ospitare fino a specifiche esigenze di sviluppo spaziale. Infine, il nostro metodo consente un conteggio automatizzato dello sperma nella spermateca di ogni linea germinale. Presi insieme, il nostro metodo permette l'analisi fenotipica rapida e riproducibile della linea germinale di c. elegans .
Introduction
La conservazione delle vie con i mammiferi di segnalazione rende c. elegans un eccellente modello per studiare più processi biologici1,2. Nel nostro laboratorio, utilizziamo la linea germinale di c. elegans per studiare lo sviluppo delle cellule staminali, apoptosi e l'espressione genica. Mentre la linea germinale è una struttura tridimensionale, molti studi sono due dimensioni a causa della natura molto tempo e laborioso di analisi tridimensionale. È molto probabile che l'analisi bidimensionale può travisare in vivo gli eventi sulla linea germinale. L'ermafrodita adulto di c. elegans ha due braccia di germline, ognuno dei quali ospita una cellula somatica punta distale (DTC) che mantiene le cellule germinali distale in un stato indifferenziato3,4. Queste cellule germinali iniziano a differenziarsi come essi allontana il DTC, sfuggire la sua influenza e diventare ovociti e spermatozoi come raggiungono l'estremità prossimale della linea germinale. Durante questo processo, i nuclei delle cellule di germe subiscono la mitosi, prima di passare ai meiosi5,6. Produzione di spermatozoi è completata da stadio larvale 4 (L4) dello sviluppo, dopo di che gli ovociti sono prodotte durante l'età adulta. Gli spermatozoi vengono archiviati nella spermateca dove essi fertilizzare gli ovociti per generare embrioni.
Non ci sono più fattori genetici e ambientali che possono influenzare lo sviluppo di germline in c. elegans conseguente cambiamenti nel numero dei nuclei, il numero di fenomeni apoptotici, dinamiche del cromosoma e l'espressione della proteina e/o localizzazione7 ,8,9,10,11. L'analisi di questi eventi richiede l'identificazione di ogni fase di differenziazione basata sulla distribuzione e la morfologia nucleare. Per analizzare con precisione questi parametri manualmente con un campione di grandi dimensioni è laborioso e che richiede tempo. Per aggirare questi inconvenienti e per consentire la coerenza dell'analisi, abbiamo sviluppato un metodo automatizzato per l'esame tridimensionale della linea germinale per nuclei di conteggio, distribuzione di nuclei, espressione della proteina, c. elegans e del citoscheletro struttura. Combinando la microscopia confocale con rendering tridimensionale, abbiamo generato i parametri di dimensione e forma per l'identificazione di ogni fase di differenziazione delle cellule di germe. Inoltre, questo metodo consente di conteggio dei nuclei delle cellule di germe e sperma più segnando del cromosoma in ogni ovocita.
Una struttura fondamentale nella linea germinale è il citoscheletro, che fornisce stabilità al vano di germline, aids flusso citoplasmatico e protezione di germline nuclei12. Utilizzando il rendering computazionale, abbiamo eseguito la ricostruzione tridimensionale del citoscheletro germline ed abbiamo identificato caratteristiche distinte proteine citoscheletriche entro la linea germinale. Qui, descriviamo un protocollo passo-passo per illustrare come computazionale analisi combinata con confocale imaging consente analisi completa della linea germinale di c. elegans .
Proponiamo un metodo rapido per l'analisi tridimensionale di germline di c. elegans (Figura 1). Utilizzando analisi tridimensionale, è possibile studiare la distribuzione tridimensionale dei nuclei di germline (Figura 2 e Figura 3), automatizzato di conteggio delle cellule (Figura 2), ricostruzione del citoscheletro germinale ( Figura 3), distribuzione delle proteine (Figura 4) e segnando il numero di spermatozoi nella spermateca e cromosomi negli ovociti (Figura 5). Il metodo non solo consente il facile e precisa quantificazione della linea germinale, ma identifica fenotipi fisiologicamente rilevanti.
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Protocol
1. preparazione e allevamento della vite senza fine
Nota: Consultare la Tabella materiali per tutte le informazioni sul prodotto.
- OP50 Escherichia coli cultura: cultura OP50 batteri in brodo di Lisogenesi (LB) (tryptone di 1%, 0,5% lievito, 0.5% NaCl, pH 7,0) durante la notte a 37 ° C senza antibiotici.
- 400 µ l di OP50 batteri di cartilagini di accrescimento del nematode media (NGM) (1,5 g di NaCl, 8,5 g di agar, 1,25 g di peptone, 1 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di colesterolo 5 mg/mL in etanolo, 1 mL di 1 M MgSO4 del seme e 25 mL di buffer di4 1m KPO) e asciugare all'aria i batteri per 48 h.
- Prendono vermi sulle piastre di NGM seminati e incubare a 15 ° C o 20 ° C.
- Per l'analisi della linea germinale ermafrodita adulta, prendono ben nutriti L4 vermi al prato batterico e incubare per una notte a 20 ° C.
- Per il punteggio numero di spermatozoi in ermafroditi, incubare L4 vermi a 20 ° C per 12 h fino a raggiungono i vermi la molt L4/adulto. Per sincronizzare i vermi sul palco di L4, preparare le uova con la scelta di vermi adulti con un sacco di uova in soluzione di candeggina (1 M NaOH e candeggina nel rapporto 1:1). Lasciare le uova si schiudono e scegli gli animali L4 per l'esperimento.
- Preparare vetrini da microscopio Teflon posizionando 25 µ l di soluzione di poli-L-lisina sulla diapositiva e diffondendo la soluzione, utilizzando un puntale. Dopo la rimozione di poli-L-lisina in eccesso con carta assorbente, lasciare i vetrini asciugare all'aria e incubare i vetrini a 65 ° C per 15-20 min.
2. Germline dissezione e colorazione6,13
- Spot 10 µ l di 0.01% Tetramisolo (anestetico) su un vetrino coprioggetti 22 mm × 22 e prendere i vermi adulti 1 giorno di vita in esso.
- Sezionare il verme alla coda come si diventa placato con una siringa (5 mL) e un ago (24 "x 1") e assicurarsi che la linea germinale non sia danneggiata.
Nota: La dissezione deve essere effettuata prima che il worm diventa completamente paralizzato in modo che la pressione negativa nel verme e il movimento del verme aiutare l'espulsione della linea germinale. Per il punteggio dello sperma, necessario adottare precauzioni per non danneggiare la spermateca dall'ago durante la dissezione. Evitare di toccare la linea germinale con l'ago ad eccezione del punto di dissezione dopo la spermateca. Se c'è rottura nel vano di germline o qualsiasi scarico dalla linea germinale è osservato, la linea germinale non dovrebbe essere utilizzata per l'analisi. - Porre il coprivetrino invertito su una diapositiva rivestita di poli-L-lisina, mantenendo la linea germinale dissecata sulla diapositiva.
- Rimuovere il liquido in eccesso sotto il vetrino coprioggetto inserendo una torre di carta in un angolo del vetrino coprioggetto, quindi posto il vetrino in azoto liquido per 1 min, rimuovere rapidamente il vetrino coprioggetto utilizzando un ago con il germlines sulla diapositiva.
- Trasferire i vetrini in metanolo-20 ° C per 30-60 s in una camera, quindi incubare per 30 minuti nella soluzione preparata di fissaggio (1x tamponato fosfato salino (PBS) contenente 0.08 M HEPES pH 6.9, 1,6 mM MgSO4, glicole etilenico 0,8 mM-bis(beta-aminoethyl etere)-N, N, N', N'-tetraacetico acido (EGTA) e 3,7% paraformaldeide) a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini inserendo in una camera contenente 1X PBS, pH 7.4 con 0.1% Tween-20 per 10 min. Ripetere questo passaggio una volta.
- Bloccare il germlines con 30 µ l di soluzione bloccante (30% di siero di capra preparato aggiungendo 900 µ l di siero di capra nel 1700 µ l di acqua distillata H2O e 300 µ l di PBS 1x 10) in una camera umida preparata ponendo il tovagliolo di carta bagnato in una scatola di plastica a temperatura ambiente per 30 min.
- Aggiungere 50 µ l di soluzione di anticorpo REC-8 preparata in siero di capra 30% in un rapporto di 1: 300 per ogni campione. Incubare per una notte a 4° C.
- Lavare i vetrini inserendo in una camera contenente 1X PBS con 0,1% Tween-20 per 10 min. Ripetere il passo una volta e togliere il liquido in eccesso mettendo un asciugamano di carta all'angolo della diapositiva.
- Preparare la soluzione di anticorpo secondario diluendo fluoroforo verde (lunghezza d'onda emissione nm 488) anticorpo secondario coniugato (1: 1000), falloidina (macchia di actina, 1: 4000) e DAPI (macchia di DNA, 1: 4000) in siero di capra normale del 30%.
- Aggiungere 50 µ l di soluzione di anticorpo secondario alla diapositiva.
- Incubare per 1 h a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini due volte mettendo in una camera contenente 1X PBS con 0,1% Tween-20 per 10 minuti togliere il liquido in eccesso.
- Aggiungere 30 µ l di reagente sulla diapositiva di fissaggio e adagiarvi un 12 mm2 x 1,5 µm coprioggetto e asciugare i vetrini a 4 ° C durante la notte.
3. microscopio confocale
- Accendere il microscopio confocale laser, scanner risonante e software di microscopio confocale. Porre i vetrini con germlines macchiato il portavetrini sopra l'obiettivo X 63.
- Individuare un germline, messa a fuoco sulla parte superiore della linea germinale e contrassegnarla utilizzando software di microscopio confocale. Allo stesso modo concentrarsi sulla parte inferiore della linea germinale e contrassegnarlo per stabilire lo spessore totale di germline.
- Immagine intera linea germinale definendo lo spessore di ogni fetta fino a 0,5 µm. contrassegnare la completa acquisizione di germline e inizio. 8 tempi di scansione ogni fetta e media dei valori per migliorare la qualità dell'immagine. Lo scanner risonante consentirà scansione veloce per evitare lo sbiancamento durante la formazione immagine. Se il microscopio non dispone di uno scanner di risonanza, ridurre il numero di scansioni a quattro per evitare lo sbiancamento.
4. post analisi dei Nuclei di Imaging numero e distribuzione
Nota: Fare riferimento complementare figura 1 per screenshot per gli strumenti software e pulsanti utilizzati.
- Importare l'immagine a Imaris 8.4.1 o versioni successive del software.
- Definire regione mitotica, zona di transizione, regione meiotica, regione dell'ovocita e spermateca della linea germinale individuando la morfologia nucleare in ogni regione.
- Utilizzare il pulsante di funzione della superficie (complementare figura 1A) del software per selezionare la regione di interesse.
- Annullare la procedura guidata Creazione automatica della superficie e disegnare manualmente l'area di interesse presso la prima e l'ultima fetta dell'immagine dallo stack tridimensionale.
- Fare clic su Crea superficie.
Nota: È possibile che il software svilupperà automaticamente gli stack tra il primo e l'ultimo stack. - Maschera tutti i canali tranne DAPI facendo clic sul pulsante maschera canale (Complementare figura 1B-C).
- Definire i parametri di dimensione nucleare utilizzando il pulsante di funzione spot (complementare figura 1A). Per la regione mitotica, definire un diametro di x-y di 2 µm, lasciando diametro Z non definito. Per la zona di transizione, definire un diametro di x-y di 2 µm e Z come 1,5 µm. (complementare figura 1).
Nota: Risoluzione dei problemi i diametri seguendo le specifiche del microscopio e ingrandimento. Per il protocollo attuale, l'obiettivo utilizzato era 63 X e fornito un extra 1.70 volte ingrandimento durante la formazione immagine. Se si cambia l'obiettivo, per esempio 40 X, i diametri dovrebbero essere modificati di conseguenza. Risoluzione dei problemi deve essere eseguita con wildtype germlines per stabilire i parametri corretti. La regione mitotica di un braccio di germline di tipo selvaggio ha circa 250 nuclei. Il diametro deve essere modificato per ottenere questo valore. Utilizzare almeno 15 germlines per determinare il valore ottimale per il diametro. Un approccio simile dovrebbe essere usato per calibrare la zona di transizione (nuclei di 150-170) e la regione meiotica (nuclei di 600-700). - Limitare il rilevamento dei punti definendo la soglia minima (complementare Figura 1E). Uso DAPI macchiato germlines wild-type per stabilire la soglia minima aumentando la soglia di minima resa tridimensionale, fino a quando il primo spot appare all'esterno la linea germinale.
- Salvare l'immagine e ottenere il numero di nuclei dalla tabella generata automaticamente dal software. Esportare le immagini come file TIF.
5. post analisi di Imaging per il punteggio dello sperma e il numero di cromosoma
- Eseguire il rendering tridimensionale selezionando la spermateca come la regione di interesse. Per rilevare ogni sperma, definire il diametro del punto tra 0,75 - 1,0 µm per X e Y-asse, mentre Z diametro rimane indefinito. Utilizzare il pulsante di funzione di macchie come illustrato nella Figura 1 supplementare.
- Sottrarre lo sfondo selezionando sfondo sottrarre casella e utilizzando i valori di correzione del fondo calcolati dal software (complementare figura 1).
Nota: Software di Imaris sceglie punti ad alta intensità in primo luogo, quindi l'effetto di sfondo è minima, purché ci sia differenza significativa tra la regione di interesse e lo sfondo. Un secondo metodo è di definire manualmente la correzione del fondo, eventualmente valori può essere dato per lo sfondo. Correzione manuale sfondo sarà opportuno se l'intensità di campioni indipendenti ha bisogno di confronto. - Regolare la soglia di rendering tridimensionale per rilevare tutto lo sperma DAPI macchiato nella spermateca (complementare Figura 1E).
- Per il conteggio del cromosoma, definire il diametro del punto < 0,75 µm per X e Y-asse prima di sviluppare modelli tridimensionali.
- Salvare l'immagine e l'esportazione come file TIF.
6. pubblicare analisi di Imaging per la ricostruzione del citoscheletro della linea germinale
- Identificare la regione di interesse sulla linea germinale e mascherare tutti i canali tranne falloidina facendo clic sul pulsante maschera canali .
- Definire un particolare della superficie di 0.25 µm utilizzando il tasto di funzione della superficie (complementare figura 1).
Nota: Questo significa che ogni 0,25 µm verranno sottoposti a rendering in modelli tridimensionali. Particolare della superficie può essere costante per qualsiasi regione della linea germinale in cui verrà creato un modello di superficie tridimensionale per ogni 0,25 µm. Tuttavia, per la regione di ovocita, dettagli della superficie possono essere aumentata a 0,35 - 0,5 µm dovuta alla presenza di fibre di actina ben definito in questa regione. - Sottrarre lo sfondo selezionando sfondo sottrarre casella e utilizzando i valori di correzione del fondo calcolati dal software (complementare figura 1).
- Regolare la soglia di rendering tridimensionale a seconda della struttura che richiedono analisi (complementare Figura 1E).
- Salvare l'immagine tridimensionale sviluppata ed esportare come un file TIF.
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Representative Results
Figura 1 indica il tempo necessario per l'analisi tridimensionale di germline. L4 ermafroditi incubate a 20 ° C sono stati sezionati per isolare germlines e macchiati con DAPI, falloidina e anticorpi contro le proteine di germline. Germlines sono imaging usando la microscopia confocal. Microscopia confocale e colorazione richiede circa 24 h. analisi computazionale per la linea germinale completa richiede 10-15 min a contare il numero e la posizione dei nuclei, identificare la distribuzione della proteina, analizzare la struttura del citoscheletro e segnare il numero di spermatozoi. Analisi manuale completa richiede oltre 2 h per germinale e sono l'influenza dell'operatore, quindi, il nostro metodo automatizzato ad alta velocità riduce i tempi di analisi e migliora la riproducibilità.
Automatizzate i nuclei segnando rivela che un braccio di germline ospita circa 1.000-1.200 nuclei (Figura 2C), corrispondente bene con manuale precedentemente pubblicati segnando dati1. Per confermare che l'esattezza del punteggio, più mutanti e condizioni differenti sono usati (Figura 2D-G). Per esempio, abbiamo confrontato rnp-8(tm435), cpb-3(bt17)e glp-1(e2141) worm mutante agli animali wild-type. Conteggio automatico riprodotta la nota riduzione del numero dei nuclei in cpb-3 e glp-1 mutante germlines14,15,16,17. Una grave riduzione nel numero di nuclei inoltre è stata osservata nel mutante termosensibile glp-1(e2141) quando incubate a 25 ° C. La distribuzione dei nuclei è dipenda dallo stadio di differenziazione. La regione mitotica, che contiene circa 250 nuclei in wild-type, è fitto con nuclei rispetto al resto del germinale (Figura 3)1. La spaziatura tra i nuclei mitotici è minima e i nuclei si trovano in tutta la regione mitotica. Tuttavia, come i nuclei allontana dalle estremità distale, appaiono più verso la circonferenza della linea germinale (Figura 3). Il cambiamento nella distribuzione inizia la zona di transizione e completa come i nuclei entra meiosi/pachitene.
La linea germinale ha strutture citoscheletriche specifiche nelle diverse fasi di differenziazione. Abbiamo visualizzato F-actina macchiando la linea germinale con falloidina. La distribuzione di F-actina dal distale all'estremità prossimale della linea germinale era distinta in ogni regione (Figura 3 e Figura 5). In generale, ci sono due strutture separate che appaiono come un 'cilindro all'interno del cilindro'. Presso la regione mitotica, actina interiore appare come una massa solida con una forma specifica (Figura 3). Come la linea germinale raggiunge la zona di transizione, l'actina interno presuppone una struttura più cilindrica e diventa un cilindro vuoto come raggiunge tardi pachitene. Il secondo strato di actina copre lo strato interno, dando forma alla linea germinale. Questa struttura di actina 'bombola all'interno cilindro' scompare verso la regione dell'ovocita (Figura 5). Alla regione dell'ovocita, actina appare come fibre spesse. Gli ovociti sono separati da un rachide di actina, anche se sembra essere dinamico per permettere il movimento degli ovociti per la spermateca. Infine, l'actina nella spermateca anche forme spessi fasci di fibre di actina. Tuttavia, le fibre sembrano essere imballato più vicino nella regione degli ovociti. La struttura del citoscheletro sembra integrare i modelli di distribuzione dei nuclei (Figura 3). Presso la regione mitotica, i nuclei sembrano essere collocato attorno alla struttura interna dell'actina. Come raggiungere meiosi/pachitene, i nuclei organizzano tra i due cilindri di actina, lasciando la metà della linea germinale per lo più privo di nuclei (Figura 3). Questo potrebbe probabilmente aiuto ininterrotto flusso citoplasmatico sulla linea germinale. Germlines sono stati macchiati con un anticorpo contro la proteina di REC-8 e analizzati mediante microscopia confocale. REC-8 è distribuito in modo omogeneo in tutto i primi nuclei della linea germinale e più tardi è spaccati e degradati durante meiosi18. REC-8 distribuzione in tridimensionale analisi trasversale della linea germinale Mostra la distribuzione della proteina nella regione mitotica (Figura 4).
Rendering tridimensionale dell'estremità prossimale della linea germinale include la spermateca e primi tre ovociti distali per la spermateca. La nostra analisi riconosciuto una media di 151 sperma in ogni spermateca (n = 18). Ciò corrisponde alla letteratura pubblicata, che indica l'affidabilità del metodo (Figura 5F)19. Questa analisi può essere eseguita insieme a citoscheletro o gli studi di distribuzione della proteina. Il genoma di c. elegans è distribuito tra sei cromosomi. In ovociti di tipo selvaggio completamente sviluppato, questi cromosomi sono visibili e possono essere contati. Questa separazione del cromosoma può essere utilizzata per studiare la stabilità del cromosoma o altri difetti associati con lo sviluppo degli ovociti. Di rendering tridimensionale, il numero dei cromosomi possa essere fruito, e se i cromosomi sono separati correttamente, il numero può essere ottenuto con precisione (Figura 5).
Figura 1 . Timeline per l'analisi automatizzata. Tempo di confronto tra analisi manuale e computazionale della linea germinale di c. elegans . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Distribuzione di nuclei la linea germinale. (A) DAPI macchiato germline risultati mitotica, transizione e regioni pachitene/meiotica. (B) modello tridimensionale computazionale della linea germinale. (C) Scoring per il numero totale di nuclei nel wild-type germlines. (D-F) Punteggio per il numero dei nuclei a mitotica, transizione e regioni meiotiche di tipo selvaggio, rnp-8, cpb-3e glp-1 germlines mutante. (G) confronto del numero totale dei nuclei nel mutante glp-1 a 20 ° C e 25 ° C. Barra di errore rappresenta l'errore standard. Test di Student. n < 0,0001, * * *n < 0,001, * *n < 0.01, *n < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Struttura del citoscheletro della linea germinale. (A-B) Organizzazione del citoscheletro di actina interna (rosso) della linea germinale alla regione mitotica. L'actina interno ha una struttura diffusa rispetto all'actina esterno alla regione mitotica. (C-D) Presso la regione di pachitene, il citoscheletro presuppone una struttura cilindrica formando due cilindri tra i quali sono organizzati i nuclei (blu). (E-F) Organizzazione dei nuclei di germline nelle regioni mitotiche e pachitene. La distribuzione dei nuclei è più verso la circonferenza del 'germtube' presso la regione di pachitene rispetto alla regione mitotica (verde) e metà della linea germinale divenuta priva di nuclei. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . REC-8 espressione mitotica della regione. (A) micrografia mostrando l'estremità distale di una REC-8-macchiati di germline. (B-C) Rendering tridimensionale del REC-8 colorazione (mostrato in blu) e la distribuzione della proteina fra i nuclei mitotici (verde). REC-8 la colorazione è meno abbondante prossimale alla regione mitotica (contrassegnata da puntini bianchi che rappresentano i nuclei). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Struttura di germline all'estremità prossimale. (A) DAPI macchiatura della linea germinale all'estremità prossimale. (B) tridimensionale rendering di DAPI macchiatura visualizzando sperma nella spermateca (giallo) e cromosomi negli ovociti (bianco). (C-E) Struttura tridimensionale del citoscheletro all'estremità prossimale della linea germinale. Rosso segna l'estremità prossimale completa e verde segna la spermateca. Analisi sezionale trasversale dimostra che il citoscheletro costituisce non solo una struttura filamentosa di actina nei dintorni di ovociti, ma separa anche tra gli ovociti. (F) grafico che mostra il numero di spermatozoi in ogni spermateca e media ottenuta da spermateca multipli (n = 18). Barra di errore rappresenta l'errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare figura 1 . Descrizione di strumenti di software. (A) le macchie e strumenti per la rilevazione di nuclei e colorazione delle proteine di superficie. (B-C) La selezione della regione tridimensionale di interesse utilizzando lo strumento superficie. (D) la definizione di XY-diametro, utilizzando tool di macchie, per il rilevamento di nuclei. A seconda della regione di interesse e di colorazione, la correzione di diametro e sfondo di z-axis può essere utilizzata. (E) minimo e rilevamento della soglia di massima intensità. Un approccio simile può essere utilizzato per la funzione di superficie dove invece di definire il diametro, e particolari lavorazioni della superficie possono essere definiti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'obiettivo del presente protocollo è quello di migliorare la precisione e ridurre il tempo necessario per l'analisi di germline. Dopo preparazione standard del germlines dissecata, un modello tridimensionale dei nuclei di germline è preparato dal rendering computazionale. Pur consentendo l'osservazione della distribuzione di nuclei di germline nello spazio, rendering tridimensionale calcola il numero dei nuclei alle regioni specifiche della linea germinale. L'aspetto critico del nostro metodo è accurata definizione dei parametri di dimensione e forma dei nuclei. Questo dipende dalla chiarezza di colorazione e di ingrandimento usato all'immagine. Abbiamo confermato la precisione del metodo confrontando pubblicare manualmente analizzati dati1. Per confermare ulteriormente la precisione del nostro metodo, abbiamo usato mutanti multipli in condizioni diverse e hanno confermato i risultati con letteratura pubblicata. Ha inoltre confermato la capacità del metodo di rilevare fenotipi sottili e forti - mutanti cpb-3 e glp-1 , rispettivamente. Inoltre, questo metodo Mostra l'adattabilità ai cambiamenti in nuclei di dimensioni e forma entro la linea germinale o anche tra ceppi. Questa proprietà consente inoltre l'identificazione e segnando di strutture più piccole sulla linea germinale come cromosomi e sperma. Il metodo consente inoltre di ulteriore risoluzione dei problemi per i parametri di dimensione e forma, se necessario. La nostra analisi è stato in grado di chiarire la distribuzione dei nuclei nella linea germinale e ha mostrato che i nuclei in mitotic e regioni di pachitene sono organizzate in diversi modelli. Applicando il rendering tridimensionale a REC-8 e colorazione DAPI, abbiamo mostrato anche la distribuzione di REC-8 all'interno dei nuclei della regione mitotica.
Rendering tridimensionale di actina macchiatura abilitato esame dettagliato delle strutture citoscheletriche germinale. La linea germinale sembra avere due strutture di actina separato, anche se mantengono il contatto fisico. Mentre la ricostruzione del citoscheletro per l'intera linea germinale è possibile come una singola entità, i migliori risultati possono essere ottenuti se le regioni di interesse sono preselezionate in mitotica, di transizione e regioni meiotiche. Il citoscheletro di germline distale ha una forma non definita e si evolve in una struttura filamentosa all'estremità prossimale. Nostro protocollo, pertanto, consente la ricostruzione tridimensionale del citoscheletro germline definendo parametri specifici per accogliere le differenze nella distribuzione dell'actina. L'aspetto più critico dell'analisi è la definizione dei parametri come dimensioni nuclei e requisito particolare della superficie. Riduzione delle dimensioni di nuclei sotto la dimensione effettiva rischiero ' il software per raccogliere punti luminosi all'interno dei nuclei come oggetti separati. Allo stesso modo, valori alti dettagli della superficie porterà alla perdita di strutture tridimensionali accurati. Il metodo proposto si basa sulla precisione della dissezione e la qualità della colorazione germinale. Un germline danneggiato può condurre al rilascio dei nuclei dalla linea germinale, causando inesatta numerazione. Alta priorità bassa dalla macchiatura causerà anche il numero di nuclei imprecise e improprio rendering tridimensionale.
Il nostro metodo si estende precedentemente noti metodi automatizzati di analisi di germline dove siamo in grado di analizzare il numero di nuclei e distribuzione/espressione delle proteine di germline nello spazio con un singolo protocollo20. In secondo luogo, il nostro metodo permette segnando di strutture più piccole quali cromosomi all'interno della linea germinale. Segregazione del cromosoma è un aspetto importante dell'ovocita sviluppo21. Utilizzando il nostro metodo, è possibile rilevare il numero e la posizione dei cromosomi dove la distanza può essere definita calibrando contro gli ovociti wild-type. Qualsiasi mutazione che interessa la separazione del cromosoma possa essere studiati utilizzando questo strumento. Inoltre, il metodo può essere esteso per studiare i cromosomi in embrioni allo stadio di 2-cellule. L'analisi computazionale fornisce anche il numero di spermatozoi nella spermateca, numero di cromosomi in un ovocita e germinale strutture citoscheletriche. Presi insieme, il metodo fornisce un'analisi completa della linea germinale di c. elegans utilizzando un unico protocollo riducendo notevolmente il tempo di analisi. Il metodo elimina la necessità di più strumenti per ciascuna analisi (numero di nuclei, distribuzione della proteina e struttura del citoscheletro) e rimuove il tempo di codifica richiesto in alcun software specifico. Infine, questo metodo può essere esteso in modo efficace agli altri studi di verme tra cui l'analisi tridimensionale di vermi vivi sedati.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Ringraziamo Monash Microimaging per il loro supporto tecnico. Alcuni ceppi sono stati forniti dal centro Caenorhabditis genetica, che è finanziato dall'ufficio di NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440). Quest'opera è stata sostenuta da un Monash University biomedicina Discovery Fellowship, NHMRC progetto Grant (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) e veski fellowship di innovazione: VIF 23 a Roger Pocock.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
References
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