Summary
Presenteren we een protocol voor de antimicrobiële karakterisering van geavanceerde materialen. Hier, de antibacteriële activiteit op materiële oppervlakken is gemeten op twee manieren die elkaar aanvullen: één is gebaseerd op de immunodiffusietest schijf, en de andere is een standaardprocedure die is gebaseerd op de ISO 22196:2007-norm.
Abstract
De ontwikkeling van nieuwe geavanceerde materialen met verbeterde eigenschappen wordt steeds meer en meer belangrijk in een brede waaier van toepassingen van de studierichtingen Bio-ingenieur. Dus, veel nieuwe biomaterialen worden ontworpen om na te bootsen specifieke omgevingen vereist voor biomedische toepassingen zoals weefseltechnologie en gecontroleerde drug delivery. De ontwikkeling van materialen met betere eigenschappen voor de immobilisatie van cellen of enzymen is ook een actueel onderzoeksonderwerp in bioprocess engineering. Echter, een van de meest wenselijke eigenschappen van een materiaal in deze toepassingen is de antimicrobiële capaciteit om te voorkomen dat eventuele ongewenste infecties. Hiervoor presenteren wij gemakkelijk-aan-volg protocollen voor de antimicrobiële karakterisering van materialen op basis van (i) de schijf immunodiffusietest (diffusie methode) en (ii) de ISO 22196:2007-norm voor het meten van de antimicrobiële activiteit op materiële oppervlakken (contact methode). Dit protocol moet worden uitgevoerd met behulp van gram-positieve en gram-negatieve bacteriën en gist te bestrijken een breed scala van micro-organismen. Als voorbeeld, worden 4 materialen met verschillende chemische aard getest volgens dit protocol tegen Staphylococcus aureus, Escherichia colien Candida albicans. De resultaten van deze tests vertonen non-antimicrobiële activiteit voor het eerste materiaal en verhoging van de antibacteriële activiteit tegen gram-positieve en gram-negatieve bacteriën voor de andere 3 materialen. Echter, geen van de 4 materialen zijn staat dat remt de groei van Candida albicans.
Introduction
Implantaat falen is vaak een gevolg van microbiële infecties die zich ondanks antimicrobiële profylaxe en aseptische arbeidsomstandigheden voordoen. Dit probleem wordt veroorzaakt door zeer hoge kosten van de gezondheidszorg en is schrijnend onder patiënten1. Belangrijke bacteriën zoals de Staphylococcus aureus zijn momenteel beschouwd als zeer gevaarlijke pathogenen in nosocomiale infecties gekoppeld katheters en andere medische implantaten, en zijn de belangrijkste contaminanten voor medische instrumenten2. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe strategieën voor antimicrobiële dringend nodig voor zowel de dagelijkse als de medische toepassingen.
Antimicrobiële stoffen omvatten antibiotica3, Quaternaire ammoniumverbindingen4, ionen/metaaloxiden5en antimicrobiële peptiden (AMPs)6. Antibiotica zijn stilaan minder efficiënt als gevolg van bacteriële resistentie,7, dat op de stijging te wijten aan antibioticum overmatig gebruik8 is. Quaternaire ammoniumverbindingen zijn alleen vanwege microbiële resistentie9heel efficiënt zijn voor een kortstondig gebruik. Ionen/metaaloxiden hebben lang gebruikt als zeer effectief antimicrobiële stoffen en worden gebruikt in vele gemeenschappelijke commerciële producten, met inbegrip van pleisters, waterfilters, verf, etc.10,11,12. Nochtans, is gebleken dat deze soorten verbindingen giftig voor sommige soorten zoogdiercellen13kunnen worden.
Versterkers tonen uitstekende antimicrobiële en immunomodulerende eigenschappen14,15, en bacteriën lijken te vinden het erg moeilijk om een weerstand tegen hen16. Echter, het proces voor de productie van zuivere versterkers is duur; een grootschalige productie is dus niet haalbaar. Dus, om de problemen in het produceren van versterkers zijn strategieën (bijvoorbeeld, kleine moleculaire antibacteriële peptoid nabootsers17, peptoids18, α-peptiden19 en β-peptiden20). Methylmethacrylaat-ended polypeptiden en polypeptoids hebben voor antimicrobiële en antifouling coatings21is gesynthetiseerd.
De ontwikkeling van nieuwe antimicrobiële stoffen zoals geavanceerde materialen in zuivere of hybride vorm, staat te voorkomen en behandelen van multiresistente infecties, is steeds noodzakelijker. Een breed scala van nieuwe geavanceerde materialen voor vele bioengineering velden zoals weefsel / bioprocess engineering zijn ontwikkeld met verbeterde chemische en fysische eigenschappen in de laatste decennia door middel van verschillende methoden: plasma-polymerisatie enten op een hydrofobe substraat22,23,24, afstemming van de crosslinking dichtheid25,26, polymerisatie in oplossing27,28,29 , 30, porogen ontbinding31,32, en door de opneming van nanomaterialen zoals grafeen oxide (GO)33,34,35,,36 en koolstof nanofibers (CNFs)37.
De studie van de antimicrobiële capaciteit van deze nieuwe materialen kan exponentieel toenemen hun mogelijke toepasbaarheid voor de studierichtingen Bio-ingenieur en, dus, essentieel geworden. Presenteren we een gemakkelijk-aan-volg protocol om te kwantificeren van de antibacteriële activiteit van dergelijke nieuwe geavanceerde materialen. Hier, na de bereiding van de monsters, twee complementaire methoden worden gevolgd: de eerste is gebaseerd op de agar schijf diffusie test38 (diffusie methode) en de tweede is gebaseerd op de ISO 22196:2007 norm39 voor het meten van de antimicrobiële activiteit op materiële oppervlakken (contact methode).
Protocol
1. de monstervoorbereiding
- Snijd de materiaalstalen in 10 mm diameter schijven met een diameter van 10 mm cilindrische punch.
Opmerking: Broze materialen kunnen worden verzacht in passende steriele oplosmiddelen voor 1 h en dan snijd in schijven. Bijvoorbeeld, hydrofiele materialen zoals zink alginaat zijn getest volgens dit protocol en werden bevochtigd in gesteriliseerde met autoclaaf water voordat ze snijden om te voorkomen dat monster breken. Echter, andere hydrofobe materialen zoals poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) hoeft niet elk soort vorige zwelling te worden goed snijden. - Droog de monster materiële schijven bij 60 ° C in een vacuüm oven (< 10-2 Torr) gedurende 24 uur.
Opmerking: Sommige materialen wellicht een hoogtemperatuur drogen. Het is echter belangrijk niet te bereiken een temperatuur die kan het materiaal thermisch degraderen. - Meten van de dikte van de materiële film met een digitale schuifmaat.
Opmerking: Dit protocol raadt het gebruik van materiële films met constante en soortgelijke diktes bij het vergelijken van de antibacteriële activiteit van verschillende materialen. - Elk specimen steriliseren door onderdompeling in ethanol 70% voor 10 min en latere ultraviolette (UV) straling gedurende 1 uur per iedere kant.
Opmerking: UV-straling kan worden uitgevoerd plaatsen van elk specimen in een steriele petrischaal binnen een laminaire flow-kap met een 12.0 W lamp van UV-C straling.
Let op: Onderzoekers moeten niet zichzelf blootstellen aan UV-straling, want het is mutageen. - Voer stap 1.1, 1.2, 1.3 en 1.4. met de materiële controle-schijven.
Opmerking: Polyethyleentereftalaat (PET) of alternatieve non-antimicrobiële materialen kunnen worden gebruikt als controle-schijven in de diffusie en contact methode. Bovendien, wanneer nanocomposieten of behandelde materialen karakteriseren, het basismateriaal moet worden gebruikt als controle materiaal.
2. Aanbevolen micro-organismen
Opmerking: Wij raden het gebruik van 3 verschillende micro-organismen te bestuderen van de antimicrobiële capaciteit van het geteste materiaal tegen een breed scala van micro-organismen.
- Reinculturen van 3 micro-organismen gebruiken: de gram-positieve bacteriën Staphylococcus aureus, de gram-negatieve bacteriën Escherichia colien de gist Candida albicans.
Opmerking: Andere soorten micro-organisme kan ook worden getest, met dit protocol door de incubatieomstandigheden indien nodig wijzigen.
Let op: De vereiste bioveiligheid metingen moeten worden gevolgd volgens het type van micro-organisme werkzaam in dit protocol. - Werken met vooraf steriel of gesteriliseerde met autoclaaf materiaal en gebruik van een bunsenbrander tijdens het hele proces van de microbiële manipulatie of een biologische veiligheid kabinet (indien nodig) om de aseptische condities.
Opmerking: Aanbevolen autoclaaf voorwaarden zijn 121 ° C gedurende 15 min voor cultuur mediums en 121 ° C gedurende 20 min voor de werkende materiaal en biologische residuen.
3. agar schijf immunodiffusietest (diffusie methode)
Opmerking: Wanneer een vloeibare verspreiding van antimicrobiële verbindingen misschien wel het belangrijkste antimicrobiële mechanisme van geavanceerde materialen, de diffusie-methode zeer nuttige informatie kan verstrekken over de antimicrobiële capaciteit van deze materialen. De materiële schijf gelegen in het centrum van de agarplaat kan een transparante ring zone (halo) waar een groeiremming van micro-organismen na 24 h van cultuur plaatsvindt vormen (Zie Figuur 1).
-
Diffusie-testprocedure
- Bereiden en autoclaaf al soja agar (TSA) volgens de instructies van de fabrikant.
- Giet de TSA in steriele petrischalen onder aseptische condities met behulp van een bunsenbrander of een laminaire flow-kap.
Opmerking: De TSA platen moet 4-6 mm dik. - Cultuur van de verschillende micro-organismen te beproeven aëroob voor 18 – 24 h in de petrischaaltjes met TSA in een incubator bij 37 ° C.
- Bereiden en autoclaaf al soja Bouillon (TSB) volgens de instructies van de fabrikant.
- Giet de TSB in een 50 mL vooraf gesteriliseerd centrifugebuis met een vooraf gesteriliseerd serologische pipet onder aseptische condities met behulp van een bunsenbrander of een laminaire flow-kap.
- Een paar kolonies van stap 3.1.3 in 25 mL van de TSB vervat in een steriele centrifugebuis met behulp van een steriele wattenstaafje en vortex resuspendeer hen voor 1 min tot een uniforme mengen.
- Aanpassen van de extinctie (bij 540 nm) van de cultuur met een spectrofotometer aan het geschikt aantal kolonievormende eenheden (kve) per mL: ongeveer 1,5 x 108 CFU/mL voor bacteriën en van 1 x 10,6 tot en met 5 x 106 CFU/mL voor gist.
Opmerking: De cultuur en cuvette volumes voor het meten van de extinctie moeten worden geselecteerd volgens de aard van de spectrofotometer gebruikt. - Vortex de microbiële Bouillon gedurende 5 seconden om het verbeteren van de verspreiding van het micro-organisme en kort dompelen een steriele wattenstaafje in deze microbiële schorsing. Verwijder de overmaat vloeistof uit het staafje door te drukken tegen de muur van de buis met de cultuur.
- Gelijkmatig Strijk de opschorting van de microbiële bouillon met de steriele wattenstaafje op het oppervlak van de platen van de TSA in 3 vliegtuigen te dekken van hun hele oppervlak met het micro-organisme en laat het drogen voor 5 min na de inenting.
Opmerking: Om het even welke vochtigheid te verwijderen, de TSA platen moeten worden geplaatst open in een omgekeerde positie bij 37 ° C gedurende 10 à 15 minuten voordat de inenting. - Steriliseren een paar pincet in onder te dompelen hen in een bekerglas met ethanol 96% en vervolgens flamberen ze met een bunsenbrander of alcohol brander.
- De monster-schijven worden getest en controleren van de schijf in het midden van de platen van de TSA met behulp van de paar steriel pincet te plaatsen.
- Incubeer aëroob de TSA platen in een omgekeerde positie bij 37 ° C gedurende 24 uur.
Opmerking: Om te voorkomen elk risico van besmetting, is het aanbevolen om Incubeer de platen van de TSA in een omgekeerde positie. Echter als het voorbeeld schijf is losgekoppeld van de TSA-platen, niet deze stap uitvoeren in een omgekeerde positie. In dit geval is het aanbevolen om het drogen van de platen in de laminaire flow kap. Deze antimicrobiële test moet ten minste in quadriplicate worden uitgevoerd op verschillende dagen zodat de reproduceerbaarheid.
-
Controle van de microbiële schorsing concentratie en zuiverheid
Opmerking: De volgende stappen zijn nodig om te controleren of de microbiële concentratie bepaald met de spectrofotometer in stap 3.1.7 klopt en zorgen dat er geen microbiële verontreiniging van het milieu. Een microbiële verontreiniging van het milieu kan gemakkelijk worden gedetecteerd door de verschijning van verschillende soorten microbiële kolonies na 24 h van cultuur. Bovendien moet geen bacteriële besmetting van de TSB-medium tijdens de manipulatie in de decimale seriële verdunningen worden gewaarborgd met een negatieve TSB controle plaat.- De steriele TSB (bereid in stap 3.1.4) afzien in steriele microcentrifuge buizen met behulp van een micropipet met geschikte gesteriliseerde met autoclaaf tips in aseptische condities. Een van hen zal worden gebruikt als een negatieve controle van de TSB.
- Decimale seriële verdunningen uit te voeren met de schorsing van de microbiële Bouillon gebruikt in stap 3.1.9 in de buizen van de steriele microcentrifuge met TSB.
- Verspreid 100 µL van elke verdunning op TSA platen met behulp van een spatel Drigalski vooraf gesteriliseerd of een alternatief instrument. Ook verspreid 100 μl van TSB medium zonder microorganism (bereid in stap 3.2.1) op een TSA plaat als een negatieve plaat van de TSB controle.
- Incubeer aëroob de TSA platen aëroob bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- Het aantal kolonies te controleren dat de CFU/mL zijn vergelijkbaar met die in stap 3.1.7 vastgesteld.
- Controleer of er geen microbiële verontreiniging van het milieu op de platen van de TSA met slechts één soort koloniën.
- Controleer of er geen bacteriële besmetting op de TSB negatieve controle plaat tonen geen koloniën
4. meting van de antimicrobiële activiteit op materiële oppervlakken (Contact methode)
Opmerking: Wanneer oppervlak contact misschien wel het belangrijkste antimicrobiële mechanisme van sommige geavanceerde materialen, de contactmethode zeer nuttige informatie kan verstrekken over de antimicrobiële capaciteit van deze materialen. Bij deze methode, de micro-organismen zijn geplaatst direct op het materiaal oppervlak en hun groeiremming kan worden bepaald na een bepaalde hoeveelheid tijd.
-
Eerste procedure
- Bereiden en autoclaaf TSB na instructies van de fabrikant.
- Giet de TSB in een 50 mL vooraf gesteriliseerd centrifugebuis met een vooraf gesteriliseerd serologische pipet onder aseptische condities met behulp van een bunsenbrander of een laminaire flow-kap.
- Cultuur van de verschillende micro-organismen te beproeven aëroob overnachting in de buis met TSB in een roteerschudapparaat (140 rpm) bij 37 ° C.
- Verdun de overnachting cultuur in 20 mL van de TSB in een 50 mL vooraf gesteriliseerd centrifugebuis tot een concentratie van ongeveer 106 CFU/mL (bepaald met een spectrofotometer bij 540 nm).
Opmerking: De cultuur en cuvette volumes voor het meten van de extinctie moeten worden geselecteerd volgens de aard van de spectrofotometer gebruikt. - Decimale seriële verdunningen van deze cultuur in steriele microcentrifuge buizen met TSB uitvoeren. Verspreiden van 100 µL van de cultuur op TSA platen en Incubeer het aëroob bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- Tel het aantal kolonies om een concentratie van de eerste cel van de ongeveer 1 x 106 CFU/mL
- Plaats 4 controle schijven voor het tellen van de microbiële na 24 h en 4 monster schijven van elk type van de geteste materialen voor microbiële tellen na 24u in putjes van een steriele 48-well plaat scheidt.
- Pipetteer 150 µL van de microbiële schorsing op elk schijfoppervlak.
-
Microbiële tellen op de controle en het geteste materiaal (na 24 h)
- Na stap 4.1.6, aëroob broeden de 4 monster schijven die in de 48-well plaat bij 37 ° C gedurende 24 uur blijven.
Opmerking: Deze 24 uur incubatietijd kan worden gewijzigd om de groeiremming op kortere of langere tijden te bestuderen. - Na 24 uur incubatie Pipetteer 850 µL van steriele PBS op het oppervlak van de 4 monster schijven en meng het met de 150 µL van de microbiële schorsing.
- De PBS/microbiële schorsing mengsel en elke schijf van de 48-well plaat verzamelen en overbrengen naar een vooraf gesteriliseerd tube 10 mL.
- Vortex het PBS/microbiële schorsing mengsel en elke schijf voor 1 min, bewerk ultrasone trillingen ten het bij 50 Hz voor 5 min en vortex het weer voor 1 min om ervoor te zorgen dat er geen levensvatbare micro-organismen blijven aan de materiële oppervlakte nageleefd.
- Uitvoeren van decimale seriële verdunningen van iedere sonicated cultuur in steriele microcentrifuge buizen met TSB en verspreiden van 100 µL van de cultuur op TSA platen en Incubeer het aëroob bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- Het aantal kolonies, die het aantal levensvatbare micro-organismen op elk monster en controle schijfoppervlak. Express dit aantal levensvatbare cellen in (CFU/mL).
- Neem een foto van de definitieve microbiële cultuur voor de monster- en controle-schijven.
- Na stap 4.1.6, aëroob broeden de 4 monster schijven die in de 48-well plaat bij 37 ° C gedurende 24 uur blijven.
5. antimicrobiële resultaten analyse
Figuur 1: metingen voor de genormaliseerde breedte van de antimicrobiële "halo". Dit paneel toont de diameter van de remming zone (diz) en de diameter van de schijf (d). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
-
Diffusie methode resultaten analyse
- Meet de diameter van de remming zone (diz) en de diameter van de schijf (d) (Zie Figuur 1) met een digitale schuifmaat.
Opmerking: De remming zone of antimicrobiële "halo" wordt gevormd als gevolg van de remming van de microbiële groei geproduceerd door de antimicrobiële materiële schijf (Zie Figuur 1). Het is mogelijk om te constateren dat er een transparante ring zone dicht bij het monster in vergelijking met de rest van de plaat waar de micro-organismen goed zijn gegroeid (ondoorzichtig zone). - De genormaliseerde breedte van de antimicrobiële "halo" (nwhalo) van elke schijf bepaald door vergelijking (1) toe te passen.
(1)
- Het bepalen van het gemiddelde en de standaarddeviatie van de genormaliseerde breedte van de antimicrobiële "halo" met de 4 bepaald nwhalo waarden van elk monster.
- Neem een foto van de definitieve microbiële cultuur met de materiële schijf.
Opmerking: De diameter van de remming zone (diz) en de diameter van de schijf (d) kunnen ook worden gemeten vanaf de foto genomen in stap 5.1.4 met behulp van een geschikt beeld processing software.
- Meet de diameter van de remming zone (diz) en de diameter van de schijf (d) (Zie Figuur 1) met een digitale schuifmaat.
-
Contact methode resultaten analyse
- Bepaal het aantal levensvatbare micro-organismen hersteld volgens vergelijking (2).
(2)
Nota: Hier, N is het aantal levensvatbare micro-organismen hersteld per cm2 per monster; C is het kiemgetal; D is de verdunningsfactor; A is de oppervlakte van het monster in cm2 bepaald met de diameter van de schijf monster. - Bepalen het verlies van levensvatbaarheid (LV) om na te denken van de remming van de celgroei door het toepassen van vergelijking (3).
(3)
Nota: Hier, C is het gemiddelde aantal levensvatbare micro-organismen (N) in CFU/mL•cm2, hersteld van de controle-exemplaren na 24u; S is het aantal levensvatbare micro-organismen (N) in CFU/mL•cm2, hersteld van de proefstukken na 24u. - Het bepalen van het gemiddelde en de standaardafwijking van het verlies van levensvatbaarheid met de 4 gevonden LV(%) waarden van elk monster.
- Bepaal het aantal levensvatbare micro-organismen hersteld volgens vergelijking (2).
Representative Results
Dit protocol was werkzaam, als een voorbeeld, voor het testen van de antimicrobiële capaciteit van 4 materialen met verschillende chemische aard tegen de 3 aanbevolen micro-organismen: Staphylococcus aureus, Escherichia colien Candida albicans . De resultaten van de agar schijf diffusie (verspreiding methode) tentoongesteld non-antimicrobiële activiteit voor het eerste materiaal (M1) zoals het gebeurd in de schijf van de controle (C, afbeelding niet weergegeven is) en het vergroten van de antibacteriële activiteit tegen gram-positieve en gram-negatieve bacteriën voor de andere 3 materialen M2, M3 en M4 (Zie Figuur 2).
Figuur 2: antimicrobiële diffusie methode resulteert. Dit paneel toont de antimicrobiële diffusie-methode voor de 4 materiële (M1, M2, M3 en M4) schijven (diameter 10 mm x 1 mm dikte) tegen S. aureus en E. coli na 24 uur incubatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 toont de verschillende genormaliseerde breedtes van de antimicrobiële "halo" (nwhalo) voor de verschillende voorbeeld materialen M1, M2, M3, M4 en tegen gram-positieve en gram-negatieve bacteriën berekend met de vergelijking (1). Geen van de 4 materialen waren echter kunnen dat remt de groei van de gist Candida albicans (afbeeldingen niet weergegeven).
Figuur 3: resultaten van de antimicrobiële diffusie "halo". Dit paneel toont de genormaliseerde "halo" (nwhalo) voor elke materiële (M1, M2, M3 en M4) schijf (diameter 10 mm x 1 mm dikte) tegen S. aureus en E. coli na 24 uur incubatie. De verschillen zijn statistisch significant (p < 0,01). Monster M1 tentoongesteld echter geen antimicrobiële activiteit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De resultaten van de contact methode ook tentoongesteld non-antimicrobiële activiteit voor het eerste materiaal (M1) zoals het gebeurd in de schijf van de controle (C) en de toenemende antibacteriële activiteit tegen Grampositive en gram-negatieve bacteriën voor de andere 3 materialen (zie is Figuur 4).
Figuur 4: antimicrobiële Neem contact op met de methode resultaten. Dit paneel toont de respectieve 90 mm platen van de 4 materiële (M1, M2, M3 en M4) antimicrobiële oppervlakteactiviteit bepaling volgens de ISO-22196:2007 na 24 uur broedtijd S. aureus en E. coli (verdunningsfactor van 10-4). C is de levensvatbare bacteriën hersteld van de schijf controle na 24 uur incubatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Het verlies van levensvatbaarheid (%) werd vastgesteld door vergelijking (2) en (3) zoals aangegeven in dit protocol (Zie Figuur 5).
Figuur 5: verlies van levensvatbaarheid door contactmethode. Dit paneel toont het verlies van levensvatbaarheid (%) voor M1, M2, M3 en M4 tegen S. aureus en E. coli op de materiële oppervlakken. Monster M1 tentoongesteld geen antimicrobiële activiteit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Geen van de 4 materialen waren echter kunnen dat remt de groei van de gist Candida albicans door de contactmethode ofwel (afbeeldingen niet weergegeven). Dus 3 van deze 4 geavanceerde materialen toonde positieve antimicrobiële resultaten tegen gram-positieve en gram-negatieve bacteriën en dus zeer nuttig voor veel studierichtingen Bio-ingenieur toepassingen met hoge antibacteriële activiteit eisen zou kunnen zijn. Geen van de 4 materialen waren echter kunnen dat remt de groei van de gist.
Discussion
De antibacteriële activiteit van nieuwe geavanceerde materialen kan door dit protocol van de gemakkelijk-aan-volg bestaande uit 2 aanvullende procedures op basis van 2 bestaande methoden worden geanalyseerd: de verspreiding van de schijf agar testen38 en de antimicrobiële activiteit gemeten op materiële oppervlakken volgens de ISO 22196:2007 norm39.
Op het gebied van dit onderzoek zijn veel van de antimicrobiële tests gemeld in de literatuur zeer assay-afhankelijk. Daarom is het zeer belangrijk om te beschikken over gedetailleerde en consistente protocollen in plaats in laboratoria. Dit artikel is een stap in die richting. Bovendien zou het zeer nuttig voor veel onderzoekers die minder ervaren zijn op dit gebied en grondige, stapsgewijze procedures te volgen voor nauwkeurige resultaten nodig.
Dit protocol kan worden gebruikt met veel soorten materialen, snijd in schijf vormen van 10 mm diameter. Brosse materialen kunnen worden gezwollen in een geschikt oplosmiddel voor 1 h tot het snijproces gemakkelijker te maken. Dus, kunnen de hydrofiele materialen zoals alginaten worden gehydrateerd in gesteriliseerde met autoclaaf gedestilleerd water. Andere oplosmiddelen zoals ethanol, keton en dichloormethaan, kunnen worden gebruikt om te zwellen hydrofobe materialen gedurende 1 uur vóór het snijden van hen. Echter, sommige materialen zoals poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) hoeft niet te worden gezwollen en zij kunnen rechtstreeks worden gesneden. Na dat is het zeer belangrijk voor de monster materiële schijven in een vacuüm oven droog en steriliseren van elk monster met ethanol en UV-straling voor 1 h om te voorkomen dat elk risico van besmetting.
Dit protocol raadt TSA en TSB als voedingsbodems en het gebruik van zuivere culturen van 3 micro-organismen tot een breed scala van micro-organismen: de gram-positieve bacteriën Staphylococcus aureus, de gram-negatieve bacteriën Escherichia coli, en de gist Candida albicans. Alternatieve cultuur, media en andere micro-organismen behoefte aan verschillende incubatieomstandigheden kunnen echter ook worden gebruikt met dit protocol. Soms is slechts 1 micro-organismen getest om te hebben een eerste idee van de antibacteriële activiteit van een nieuw materiaal.
De materialen waaruit blijkt sterke antimicrobiële activiteit tegen de aanbevolen 3 verschillende soorten micro-organismen moeten tevens worden getoetst aan de antibiotica-resistente pathogenen, zoals methicilline-resistente Staphylococcus epidermidis (MRSE), die hebben met succes gebruikt met dit protocol. Andere belangrijke resistente micro-organismen die er de oorzaak van veel zorg zijn de gram-positieve methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) en vancomycine-resistente enterokokken (VRE) en de gram-negatieve Pseudomonas aeruginosa40,41.
Biofilm inhibitie en de antibacteriële activiteit van materialen tegen andere soorten micro-organismen zoals virussen en parasieten kunnen niet worden getest met dit protocol. Dit protocol biedt echter een zeer goed uitgangspunt voor een antimicrobiële studie van een nieuwe geavanceerde materiaal.
In de antimicrobiële schijf immunodiffusietest, een kritieke stap treedt op wanneer de steekproef schijf worden geplaatst in het midden van de plaat moet omdat sommige materialen vouwen, zodra ze in contact met de agarmedia. In dit geval is het aanbevolen om het gebruik maken van een steriel pincet te ontvouwen zorgvuldig het monster. Aan de andere kant, in de contact methode, het is essentieel voor het wassen van het besturingselement en monster schijven zeer goed met PBS waarbij ze vier keer gevolgd door een krachtige vortexing en ultrasoonapparaat opdat geen levensvatbare micro-organismen blijven aan het materiaal zelfklevend oppervlak.
Dit video protocol kan worden gebruikt in veel toepassingen van de studierichtingen Bio-ingenieur, zoals bioprocess engineering, weefselkweek, gecontroleerde drug delivery, verpakkingsmaterialen, behandeling van afvalwater, en landbouw, die gebruik maken van biomaterialen met een zeer wenselijk antimicrobiële capaciteit.
De resultaten met dit protocol zijn kwalitatieve (de beelden) en kwantitatieve (de genormaliseerde breedte van de antibacteriële "halo" en het verlies van levensvatbaarheid) met een goede analyse van de reproduceerbaarheid (gemiddelde ± standaardafwijking). Bij het vergelijken van verschillende materialen, moeten deze gemiddelde waarden, verkregen met de verspreiding en contact methode resultaten analyse door one-way ANOVA, gevolgd door de Turkse post hoc analyse, om te studeren als ze, statistisch gezien, aanzienlijk zijn worden geanalyseerd verschillende (p < 0,01).
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs wil erkennen de Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir voor de financiële steun voor dit werk via de 2017-231-001UCV en 2018-231-001UCV verleent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cylindrical punch | 10 mm diameter | ||
| Petri dishes | soria genlab | P101 | 90 mm diameter, sterile |
| Tryptic soy agar (TSA) | Liofilchem | 610052 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
| Tryptic soy broth (TSB) | Liofilchem | 610053 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
| Sterile cotton swab | EUTOTUBO | 300200 | |
| Centrifuge tubes | VIDRA FOC, SA | 429900 | 50 mL, sterile |
| Ethanol | VWR | 83813360 | Absolute ethanol |
| Sterile 48-wells plate | COSTAR | 3548 | Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene |
| A pair of tweezers | BRAUN | 24612036 | Toothless |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS). | VWR | E404-100TAPBS | |
| Vaccum oven with a connected vacuum pump | JP Selecta, SA | 5900620 | |
| Laminar flow hood | TELSTAR Technologies, SL | TELSTAR AH-100 | 12.0 W lamp of UV-C radiation |
| Class II Biological safety cabinet | LABOGENE | MARS 1200 | |
| Incubator | ASTEC CO, LTD | SCA-165DR | |
| Vortex mixer | Biosan | V-1 Plus | |
| Spectrophotometer | Macherey-Nagel, Germany | Nanocolor UV/VIS II | |
| Bunsen burner | JP Selecta, SA | 7001539 | |
| Alcohol burner | VIDRA FOC, SA | 1658/20 | In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet |
| Orbital shaker | sartorius stedim | 8864845 | |
| Sonicator | SELECTA | 3000617 | 50/60 Hz |
| Digital calliper | ACHA | 17-260 | 0-150 mm |
| Serological pipette | Fisherbrand | 13-678-11 | 25 mL, sterile |
| Serological pipette | VWR | 612-4950 | 5 mL, sterile |
| Serological pipette | VWR | 612-5541 | 10 mL, sterile |
| Micropipette | GILSON | FA10005P | Pipetman L P200L, plastic 20-200 µL |
| Micropipette | GILSON | F123602 | Pipetman P1000, 200-1000 µL |
| Micropipette | GILSON | FA10016 | Pipetman L P12X300L, 20-300 µL |
| Micropipette tips | LABBOX | TIBP-200-960 | 2-200 µL |
| Micropipette tips | LABBOX | TIBP-1K0-480 | 100-1000 µL |
| Pre-sterilized tube | INSULAB | 301402 | 10 mL |
| Photo camera | Canon EOS 5D | Any camera with high resolution can also be utilized | |
| Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus | strain V329 | Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9), 2888–2896 (2001) | |
| Gram-negative bacteria Escherichia coli | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 101 | |
| Yeast Candida albicans | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 1394 | |
| Microcentrifuge tubes | DASLAB | 175508 | 1,5 mL |
| Autoclave | JP Selecta, SA | 4002136 | |
| Spectrophotometer-cuvettes | UVAT Bio CB | F-0902-02 | 4,5 mL |
| Drigalski spatula | LABBOX | SPRP-L05-1K0 | Sterile, disposable |
| glass balls (2 mm diameter) | Hecht Karl | 1401/2 | Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula |
| Autoclave bags | DELTALAB | 200318 | To sterilize microbiological residues or contaminated material |
| Electronic pipette filling device | JetPip | JET BIOFIL | |
| Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-100-010 | 100 mL, for autoclaving culture media |
| Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-250-010 | 250 mL, for autoclaving culture media |
| Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-500-010 | 500 mL, for autoclaving culture media |
| Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-1K0-010 | 1000 mL, for autoclaving culture media |
| Latex gloves | DENIA | 2278000000 | |
| Indicator tape for sterilization | LABBOX | STAP-A55-001 | Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process. |
| Universal test tube rack | LABBOX | MTSP-001-001 | To hold centrifuge tubes |
| Microcentrifuge tube rack | VWR | 211-0210 | To hold microcentrifuge tubes |
| Sterile loop | ACEFE S.A. | 100140055 | 10 µL of capacity for microbial culture |
| Material M1 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 1 | |
| Material M2 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 2 | |
| Material M3 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type3 | |
| Material M4 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 4 | |
| Material C | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Control material |
References
- Sydnor, E. R. M., Perl, T. M. Hospital epidemiology and infection control in acute-care settings. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 141-173 (2011).
- Chessa, D., et al. Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Virulence Strains as Causative Agents of Persistent Infections in Breast Implants. PLoS One. 11 (1), e0146668 (2016).
- Pandey, H., Parashar, V., Parashar, R., Prakash, R., Ramteke, P. W., Pandey, A. C. Controlled drug release characteristics and enhanced antibacterial effect of graphene nanosheets containing gentamicin sulfate. Nanoscale. 3 (10), 4104 (2011).
- Jia, Z., Shen, D., Xu, W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan. Carbohydr Res. 333 (1), 1-6 (2001).
- Liu, Y., Wang, X., Yang, F., Yang, X. Excellent antimicrobial properties of mesoporous anatase TiO2 and Ag/TiO2 composite films. Microporous Mesoporous Mater. 114 (1-3), 431-439 (2008).
- Wang, L., Chen, J., Shi, L., Shi, Z., Ren, L., Wang, Y. The promotion of antimicrobial activity on silicon substrates using a "click" immobilized short peptide. Chem Commun (Camb). 50 (8), Cambridge, England. 975-977 (2014).
- Kümmerer, K. Resistance in the environment. J Antimicrob Chemother. 54 (2), 311-320 (2004).
- Ng, V. W. L., et al. Antimicrobial hydrogels: A new weapon in the arsenal against multidrug-resistant infections. Adv Drug Deliv Rev. 78, 46-62 (2014).
- Hegstad, K., Langsrud, S., Lunestad, B. T., Scheie, A. A., Sunde, M., Yazdankhah, S. P. Does the Wide Use of Quaternary Ammonium Compounds Enhance the Selection and Spread of Antimicrobial Resistance and Thus Threaten Our Health? Microb Drug Resist. 16 (2), 91-104 (2010).
- Rana, D., Matsuura, T. Surface modifications for antifouling membranes. Chem Rev. 110 (4), 2448-2471 (2010).
- Lok, C. N., et al. Proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteome Res. 5 (4), 916-924 (2006).
- Chen, X., Schluesener, H. J. Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxicol Lett. 176 (1), 1-12 (2008).
- Ahamed, M., AlSalhi, M. S., Siddiqui, M. K. J. Silver nanoparticle applications and human health. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 1841-1848 (2010).
- Yeaman, M. R. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance. Pharmacol Rev. 55 (1), 27-55 (2003).
- McLean, D. T. F., Lundy, F. T., Timson, D. J. IQ-motif peptides as novel anti-microbial agents. Biochimie. 95 (4), 875-880 (2013).
- Brogden, K. A. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol. 3 (3), 238-250 (2005).
- Ghosh, C., et al. Small molecular antibacterial peptoid mimics: The simpler the better! J Med Chem. 57 (4), 1428-1436 (2014).
- Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci. 105 (8), 2794-2799 (2008).
- Chen, Y., Mant, C. T., Farmer, S. W., Hancock, R. E. W., Vasil, M. L., Hodges, R. S. Rational design of alpha-helical antimicrobial peptides with enhanced activities and specificity/therapeutic index. J Biol Chem. 280 (13), 12316-12329 (2005).
- Porter, E. A., Wang, X., Lee, H. S., Weisblum, B., Gellman, S. H. Non-haemolytic beta-aminoacid oligomers. Nature. 404 (6778), 565 (2000).
- Gao, Q., Li, P., Zhao, H., Chen, Y., Jiang, L., Ma, P. X. Methacrylate-ended Polypeptides and Polypeptoids for Antimicrobial and Antifouling Coatings. Polym Chem. 8 (41), 6386-6397 (2017).
- Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Vidaurre-Garayo, A., Suay-Antón, J. Characterisation of macroporous poly(methyl methacrylate) coated with plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate). Eur Polym J. 43 (10), 4552-4564 (2007).
- Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Plasma-induced polymerisation of hydrophilic coatings onto macroporous hydrophobic scaffolds. Polymer (Guildf). 48 (7), 2071-2078 (2007).
- Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Rault, J. Thermal analysis of water in reinforced plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Eur Polym J. 72, 523-534 (2015).
- Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego-Ferrer, G., SuayAntón, J., Pissis, P. Interaction between water and polymer chains in poly(hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Colloid Polym Sci. 279 (4), 323-330 (2001).
- Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Effect of crosslinking on porous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation. Colloid Polym Sci. 286 (2), 209-216 (2008).
- Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego Ferrer, G., Suay Antón, J., Pissis, P. Porous poly (2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Polymer (Guildf). 42 (10), 4667-4674 (2001).
- Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Macroporous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation during polymerisation in solution. Colloid Polym Sci. 285 (7), 753-760 (2007).
- Serrano-Aroca, Á, Llorens-Gámez, M. Dynamic mechanical analysis and water vapour sorption of highly porous poly(methyl methacrylate). Polymer (Guildf). 125, 58-65 (2017).
- Serrano-Aroca, Á, Campillo-Fernández, A. J., Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Gallego-Ferrer, G., Pissis, P. Porous poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels prepared by radical polymerisation with methanol as diluent. Polymer (Guildf). 45 (26), 8949-8955 (2004).
- Rodríguez-Hernández, J. C., Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M. Three-dimensional nanocomposite scaffolds with ordered cylindrical orthogonal pores. J Biomed Mater Res - Part B: Appl Biomater. 84 (2), 541-549 (2008).
- Brígido-Diego, R., et al. Acrylic scaffolds with interconnected spherical pores and controlled hydrophilicity for tissue engineering. J Mater Sci Mater Med. 40 (18), 4881-4887 (2005).
- Serrano-Aroca, Á, Ruiz-Pividal, J. F., Llorens-Gámez, M. Enhancement of water diffusion and compression performance of crosslinked alginate with a minuscule amount of graphene oxide. Sci Rep. 7, 11684 (2017).
- Serrano-Aroca, Á, Deb, S. Synthesis of irregular graphene oxide tubes using green chemistry and their potential use as reinforcement materials for biomedical applications. PLoS One. 12 (9), e0185235 (2017).
- Sánchez-Correa, F., Vidaurre-Agut, C., Serrano-Aroca, A., Campillo-Fernández, A. J. Poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels reinforced with graphene oxide: Remarkable improvement of water diffusion and mechanical properties. J Appl Polym Sci. , (2018).
- Serrano-Aroc, Á, Iskandar, L., Deb, S. Green synthetic routes to alginate-graphene oxide composite hydrogels with enhanced physical properties for bioengineering applications. Eur Polym J. 103, 198-206 (2018).
- Llorens-Gámez, M., Serrano-Aroca, Á Low-Cost Advanced Hydrogels of Calcium Alginate/Carbon Nanofibers with Enhanced Water Diffusion and Compression Properties. Polymers (Basel). 10 (4), 405 (2018).
- Bauer, A. W., Kirby, W. M. M., Sherris, J. C., Turck, A. M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. A J Clin Pathol. 45, 493-496 (1966).
- ISO Specification 22196: measurement of antibacterial activity on plastics surfaces. , 584 (2007).
- Taubes, G. The bacteria fight back. Science. 321 (5887), 356-361 (2008).
- Boucher, H. W., et al. 10 x '20 progress--development of new drugs active against Gram-negative bacilli: an update from the infectious diseases society of America. Clinical Infectious Diseases. 56 (12), 1685-1694 (2013).
