Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Антимикробной характеристика современных материалов для приложений биоинженерии

Published: August 4, 2018 doi: 10.3791/57710
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Facultad de Veterinaria y Ciencias Experimentales, Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir
* These authors contributed equally

Summary

Мы представляем протокол для антибактериальной характеристика современных материалов. Здесь, антимикробной активности на поверхности материала измеряется двумя методами, которые дополняют друг друга: один основан на тестирование диффузии диска агар, и другой — стандартная процедура, основанный на норме ISO 22196:2007.

Abstract

Разработка новых современных материалов с усиленными свойствами становится все более и более важным в широком диапазоне приложений биоинженерии. Таким образом многие Роман биоматериалов предназначены для имитации конкретных условий, необходимых для биомедицинских приложений, таких как тканевой инженерии и доставки контролируемых наркотиков. Разработка материалов с улучшенными свойствами для иммобилизации клеток или ферменты также является текущей темы исследования в Биопроцесс технологий. Однако один из самых привлекательных свойств материала в этих приложениях является антимикробным потенциала для избежания любых нежелательных инфекций. Для этого мы представляем easy-to последующие протоколы для антибактериальной характеристики материалов, основанных на (i) агар тестового диска диффузии (метод диффузии) и (ii) 22196:2007 нормой ISO для измерения антимикробной активности на поверхности материала (контакт метод). Этот протокол должен производиться с использованием грамположительных и грамотрицательных бактерий и дрожжей чтобы охватить широкий спектр микроорганизмов. В качестве примера 4 материалов с различной химической природы проверяются после этот Протокол против золотистый стафилококк, кишечная палочкаи Candida albicans. Результаты этих испытаний выставку не антимикробной активности для первый материал и увеличивая антибактериальную активность против грамположительных и грамотрицательных бактерий для других 3 материалов. Однако ни один из 4 материалов способны подавлять рост Candida albicans.

Introduction

Имплантат неудачи часто является следствием микробных инфекций, которые происходят несмотря на антибактериальной профилактики и асептических условий труда. Эта проблема вызывает весьма высокие расходы на здравоохранение и тревогу среди пациентов1. Важных бактерий, таких как золотистый стафилококк , в настоящее время считаются весьма опасных патогенов в госпитальных инфекций, связанных с катетеры и других медицинских имплантатов и являются основными загрязнителями медицинских инструментов2. Таким образом разработка Роман антимикробной стратегий срочно необходима для ежедневных и медицинского использования.

Противомикробных препаратов включают антибиотики3, соединения аммония четвертичные4, ионов/оксиды металлов5и антимикробных пептидов (AMPs)6. Антибиотики постепенно становится менее эффективной из-за бактериальной резистентности,7, которая находится на подъеме благодаря антибиотика чрезмерное8. Соединения аммония четвертичные лишь весьма эффективны для краткосрочного использования из-за резистентности микроорганизмов9. Ионов/оксиды металлов давно использовались в качестве весьма эффективного антимикробных агентов и используются во многих общих коммерческих продуктов включая бинты, фильтры для воды, краски и т.д.10,,1112. Однако доказано, что эти виды соединений могут быть токсичными для некоторых типов клеток млекопитающих13.

Усилители показывают отличные противомикробные и иммуномодулирующие свойства14,15, и бактерии, как представляется, найти его очень трудно развивать устойчивость против них16. Однако процесс для производства чистого AMPs дорого; Таким образом крупномасштабное производство не является жизнеспособным. Таким образом разработаны стратегии борьбы, которые были проблемы в производстве AMPs (например, небольшой молекулярной антибактериальная peptoid имитирует17, peptoids18, α-пептиды19 и β-пептиды20). Метакрилат закончился полипептидов и polypeptoids синтезированы для противомикробным и необрастающие покрытия21.

Разработка новых противомикробных препаратов такие материалы в чистом или гибридных форм, состоянии для предотвращения и лечения лекарственно устойчивых инфекций, все более необходимым. Широкий спектр новых современных материалов для многих биоинженерии областях таких как ткани и Биопроцесс техники разработаны с улучшенными свойствами химические и физические в последние десятилетия через несколько методов: полимеризация в плазме подсадка на гидрофобные субстрата22,23,24, пошив сшивки плотности25,26, полимеризации в решение27,,2829 , 30, porogen распада31,32и путем включения в нее наноматериалы как графен оксид (GO)33,34,,3536 и Углеродные нановолокна (CNFs)37.

Изучение антимикробных потенциала этих новых материалов может экспоненциально увеличить их потенциальную применимость биоинженерии и таким образом, стал важным. Мы представляем easy-to последующие протокол для количественного определения антимикробной активности таких новых современных материалов. Здесь, после пробоподготовки, следуют два дополнительных метода: первый основан на агаре диска диффузии тест38 (метод диффузии) и второй основан на ISO 22196:2007 норма39 для измерения активности антимикробной на Материал поверхности (контактный метод).

Protocol

1. Пробоподготовка

  1. Вырежьте образцы материалов на диски диаметром 10 мм с диаметром 10 мм цилиндрические удар.
    Примечание: Хрупких материалов можно смягчил в подходящих стерильные растворители для 1 h и затем нарезать диски. Например гидрофильные материалы, такие как цинк альгината были протестированы после этого протокола и были смоченной в воде, газобетона до резки их во избежание разрыва образца. Однако другие гидрофобные материалы, такие как poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) не нужно какой-либо предыдущих опухоль для того, чтобы быть должным образом сократить.
  2. Сухие образца материала диски при 60 ° C в вакуумной печи (< 10-2 торр) за 24 ч.
    Примечание: Некоторые материалы может понадобиться высокой температуры сушки. Однако это не важно достичь температуры, что может ухудшить термически материала.
  3. Измерение толщины материала фильма с цифровой штангенциркуль.
    Примечание: Этот протокол рекомендует использование материала фильмов с постоянным и аналогичные толщины при сравнении антимикробной активности различных материалов.
  4. Стерилизуйте каждый образец путем погружения в этанол 70% за 10 мин и последующих ультрафиолетового (УФ) излучения за 1 ч на каждой стороне.
    Примечание: УФ-излучение может производиться размещение каждого образца в стерильных Петри внутри Ламинарный шкаф с 12,0 Вт лампа УФ-излучения.
    Предупреждение: Исследователи должны не подвергать себя УФ-излучения, потому что это мутагенных.
  5. Выполните шаги 1.1, 1.2, 1.3 и 1.4. с материала диски управления.
    Примечание: Полиэтилентерефталат (ПЭТ) или альтернативные номера антимикробные материалы могут использоваться в качестве управления дисками в методе диффузии и контакт. Кроме того при характеристике нанокомпозиты или обработанные материалы, как контрольный материал следует использовать базовый материал.

2. Рекомендуемые микроорганизмов

Примечание: Мы рекомендуем использовать 3 различных микроорганизмов для изучения антимикробной потенциала испытания материала против широкого спектра микроорганизмов.

  1. Используйте чистые культуры 3 микроорганизмов: грамположительные бактерии золотистого стафилококка, грамотрицательные бактерии Escherichia coliи дрожжей Candida albicans.
    Примечание: Другие виды микроорганизмов также могут быть тестированны с настоящим Протоколом, изменяя условия инкубации при необходимости.
    Предупреждение: Необходимые биобезопасности измерения следует в зависимости от типа микроорганизма, используемые в настоящем Протоколе.
  2. Работа с предварительно стерильной или ячеистого материала и использовать горелку Бунзена во время всего процесса микробной манипуляции или шкаф биологической безопасности (при необходимости) для обеспечения асептических условий.
    Примечание: Рекомендуется автоклава условия являются 121 ° C в течение 15 минут для сред культуры и 121 ° C в течение 20 мин для рабочего материала и биологических остатков.

3. агар диска диффузии тест (метод диффузии)

Примечание: Когда жидкий диффузии антимикробных соединений может быть основным механизмом антимикробной передовых материалов, метод диффузии может предоставить весьма полезную информацию о антимикробных способности этих материалов. Материала диска, расположенный в центре пластины агар может сформировать прозрачный кольцо зоны (Хало), где происходит торможение роста микроорганизмов после 24 ч культуры (см. Рисунок 1).

  1. Процедура испытания диффузии
    1. Подготовить и автоклав tryptic соевый агар (TSA) следуя инструкциям производителя.
    2. Залейте TSA в стерильные чашки Петри в асептических условиях, с помощью горелки Бунзена или ламинарных капюшоном.
      Примечание: TSA плиты должны быть толщиной 4 – 6 мм.
    3. Культура различных микроорганизмов для проверки высокоусвояемого на 18 – 24 часа в чашках Петри с ВСТ в инкубаторе при 37 ° C.
    4. Подготовить и автоклав tryptic соевый бульон (TSB) следуя инструкциям производителя.
    5. Вливают 50 мл трубки предварительно стерилизованные центрифуги с предварительно стерилизованные Серологические Пипетки в асептических условиях, с помощью горелки Бунзена или ламинарных капюшоном TSB.
    6. Ресуспензируйте несколько колоний от шага 3.1.3 в 25 мл TSB, содержащихся в стерильных пластиковых пробирок с помощью стерильным ватным тампоном и вихревой им за 1 мин до достижения единообразного смешивания.
    7. Отрегулируйте поглощения (на 540 Нм) культуры с спектрофотометр подходящее количество колонии, образуя единиц (CFU) мл: приблизительно 1,5 x 108 кое/мл для бактерий и6 1 x 10-5 х 106 кое/мл для дрожжей.
      Примечание: Объемы культуры и кюветы для измерения оптической плотности должен быть выбран согласно типу спектрофотометр использованы.
    8. Вихрь микробной бульон 5 секунд для улучшения дисперсии микроорганизма и кратко погружать стерильным ватным тампоном в этой микробной подвеска. Удалите избыток жидкости от тампона, нажав против стены трубы, содержащие культуры.
    9. Равномерно испещрять микробной бульон подвеска с стерильным ватным тампоном на поверхность плит TSA в 3 самолетов для покрытия их всей поверхности с микроорганизма и дайте ему высохнуть в течение 5 мин после прививки.
      Примечание: Чтобы удалить влагу, TSA пластины должны помещаться открытым в перевернутом положении при 37 ° C 10 – 15 мин до прививки.
    10. Стерилизуйте пинцет, погружая их в стакан с Этанол 96% и затем пылающий их с помощью горелки Бунзена или спиртовая горелка.
    11. Поместите образец диски и испытываться диск в центре TSA плит с помощью пары стерильным пинцетом.
    12. Инкубируйте высокоусвояемого TSA пластины в перевернутом положении при 37 ° C в течение 24 ч.
      Примечание: Во избежание любого риска загрязнения, рекомендуется инкубировать TSA пластины в перевернутом положении. Однако если диск образец отсоединяется от TSA пластины, не выполняйте этот шаг в перевернутом положении. В этом случае рекомендуется для сухой и пластины в Ламинарный шкаф. Это испытание антимикробной должны выполняться по крайней мере в quadriplicate в разные дни, чтобы обеспечить воспроизводимость.
  2. Проверка чистоты и концентрация микробных подвеска
    Примечание: Следующие шаги необходимы для того, чтобы проверить правильность микробная концентрация определяется с спектрофотометром в шаге 3.1.7 и убедитесь, что существует не микробного загрязнения окружающей среды. Микробного загрязнения окружающей среды могут быть легко обнаружены, появление различных видов микробной колоний после 24 ч культуры. Кроме того не микробного загрязнения среды TSB во время его манипуляции в десятичных серийных разведений должна быть обеспечена с отрицательным TSB управления тарелкой.
    1. Отказаться от стерильного БСЭ (подготовленных на шаге 3.1.4) в стерильных microcentrifuge труб с помощью микропипеткой с подходящим газобетона советы в асептических условиях. Один из них будет использоваться как отрицательный контроль TSB.
    2. Выполните десятичных серийных разведений с подвеской микробной бульон, используемых в действии 3.1.9 microcentrifuge стерильные пробирки, содержащие TSB.
    3. Распространение 100 мкл каждого разведения на TSA пластины с помощью предварительно стерилизованные Drigalski шпателем или альтернативного инструмента. Также распространение 100 мкл TSB среды без микроорганизмов (подготовленных на шаге 3.2.1) на табличке TSA как негативные пластины управления TSB.
    4. Инкубируйте высокоусвояемого TSA пластины высокоусвояемого при 37 ° C в течение 24 ч.
    5. Подсчитать количество колоний для проверки, что кое/мл, аналогичны, определенный на шаге 3.1.7.
    6. Убедитесь, что не микробного загрязнения окружающей среды на TSA пластины с только одним типом колоний.
    7. Проверьте, что нет никаких микробов на табличке отрицательный контроль TSB, показаны не колоний

4. Измерение антимикробной активности на поверхности материала (контактный метод)


Примечание: Когда поверхности контакта может быть основным механизмом антимикробной некоторых передовых материалов, контактный метод может предоставить весьма полезную информацию о антимикробных способности этих материалов. В этом методе микроорганизмы размещены непосредственно на поверхности материала и их замедление роста могут быть определены после определенного количества времени.

  1. Первоначальные процедуры
    1. Подготовить и автоклав TSB следуя инструкциям производителя.
    2. Вливают 50 мл трубки предварительно стерилизованные центрифуги с предварительно стерилизованные Серологические Пипетки в асептических условиях, с помощью горелки Бунзена или ламинарных капюшоном TSB.
    3. Культура, которую различные микроорганизмы испытываемого высокоусвояемого ночь в трубку с БСЭ в орбитальный шейкер (140 об/мин) при 37 ° C.
    4. Разбавить ночь культуры в 20 мл БСЭ в 50 мл трубки предварительно стерилизованные центрифуги к концентрации приблизительно 106 кое/мл (с спектрофотометром в 540 Нм).
      Примечание: Объемы культуры и кюветы для измерения оптической плотности должен быть выбран согласно типу спектрофотометр использованы.
    5. Выполните десятичных серийных разведений этой культуры в microcentrifuge стерильные пробирки, содержащие TSB. Распространение 100 мкл культуры на TSA пластины и инкубировать высокоусвояемого при 37 ° C в течение 24 ч.
    6. Подсчитать количество колоний для обеспечения первоначальная клеточная концентрация приблизительно 1 x 10-6 кое/мл
    7. 4 место управления диски для микробные подсчёта после 24 h и 4 образца диски каждого типа испытания материалов для микробные подсчёта после 24 часов отделяет скважин стерильные 48-ну плиты.
    8. Пипетка 150 мкл микробной подвеска на каждую поверхность диска.
  2. Микробные рассчитывает на контроль и испытания материалов (после 24 ч)
    1. После шага 4.1.6 высокоусвояемого Инкубируйте 4 образца диски, оставшиеся в 48-ну пластины при 37 ° C в течение 24 ч.
      Примечание: Это время инкубации 24 h могут быть изменены с целью изучения торможение роста короче или длиннее время.
    2. После 24 ч инкубации Пипетка 850 мкл стерильных PBS на поверхности дисков 4 образца и смешать с 150 мкл микробной подвеска.
    3. Собирать PBS/микробной смесь подвеска и каждый диск от 48-ну пластины и передавать их на предварительно стерилизованные тюбик 10 мл.
    4. Вихревой PBS/микробной смесь подвеска и каждый диск за 1 мин, sonicate его на 50 Гц 5 мин и вихрь, который он снова за 1 мин, чтобы оставались не жизнеспособные микроорганизмы присоединились к поверхности материала.
    5. Выполните десятичных серийных разведений каждого sonicated культуры в стерильных microcentrifuge пробирки, содержащие TSB и распространение 100 мкл культуры на TSA пластины и инкубировать высокоусвояемого при 37 ° C в течение 24 ч.
    6. Подсчитать количество колоний, которые являются количество жизнеспособных микроорганизмов на каждого образца и контроля поверхности диска. Выразить это количество жизнеспособных клеток (кое/мл).
    7. Сфотографируйте окончательного микробные культуры для образца и управления дисками.

5. антимикробной результаты анализа

Figure 1
Рисунок 1: измерения для нормализованных ширины антимикробные «halo». Эта панель показывает ингибирование зоны (diz) и диск диаметром (d). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Анализ результатов метода диффузии
    1. Измерить диаметр зоны ингибирование (diz) и диаметр диска (d) (см. Рисунок 1) с цифровой штангенциркуль.
      Примечание: Ингибирование зоны или антимикробные «halo» образуется вследствие ингибирования микробного роста производства антимикробных материала диска (см. Рисунок 1). Это можно наблюдать, что существует прозрачный кольцо зоне недалеко от выборки по сравнению с остальной части пластины где микроорганизмы выросли правильно (непрозрачный зона).
    2. Определяют нормализованный ширину антимикробные «halo» (nwгало) каждого диска, применяя уравнения (1).
      (1)Equation 1
    3. Определите среднее и стандартное отклонение нормализованных ширины антимикробной «halo» с 4 определяется nwгало значения каждого образца.
    4. Сфотографируйте окончательного микробные культуры с материала диска.
      Примечание: Ингибирование зоны (diz) и диск диаметром (d) также может измеряться на фотографии, сделанной в шаге 5.1.4 с помощью подходящего обработки изображений программное обеспечение.
  2. Анализ результатов контактным способом
    1. Определите количество жизнеспособных микроорганизмов, взыскиваемых согласно уравнение (2).
      (2)Equation 2
      Примечание: Здесь N — это количество жизнеспособных микроорганизмов, восстановлены на2 см на испытательный образец; C это число плиты; D является коэффициент разрежения; A — площадь поверхности испытательного образца в см2 определяется с диаметром диска образца.
    2. Определите потерю жизнеспособности (LV) для отражения ингибирование роста клеток, применяя уравнения (3).
      (3)Equation 3
      Примечание: Здесь, C является среднее количество жизнеспособных микроорганизмов (N) в CFU/mL•cm2, оправился от управления образцов после 24 ч; S — количество жизнеспособных микроорганизмов (N) в CFU/mL•cm2, оправился от испытательных образцов после 24 ч.
    3. Определите среднее и стандартное отклонение утраты жизнеспособности с 4 LV(%) значениями каждого образца.

Representative Results

Этот протокол применялся, как, например, для тестирования антимикробной емкость 4 материалов с различной химической природы против 3 рекомендовал микроорганизмов: золотистый стафилококк, кишечная палочкаи Candida albicans . Результаты испытаний диффузии диска агар (метод диффузии) выставлены не антимикробной активности для первого материала (M1), как это имело место на диске управления (C, изображение не показано) и антибактериальной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерии на 3 материалы, м2, м3 и М4 (см. Рисунок 2).

Figure 2
Рисунок 2: результаты метода диффузии антимикробной. Эта панель показывает метод антибактериальной диффузии для 4 материала (М1, м2, м3 и М4) дисков (диаметр 10 мм x 1 мм толщиной) против S. aureus и E. coli после 24 ч инкубации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 показывает различные нормализованные ширины антимикробные «halo» (nwгало) для различных пример материалов М1, м2, м3 и М4 против грамположительных и грамотрицательных бактерий рассчитывается с уравнением (1). Однако ни один из 4 материалы смогли препятствовать рост дрожжей Candida albicans (изображения не отображаются).

Figure 3
Рисунок 3: Противомикробные диффузии «halo» результаты. Эта панель показывает нормализованных «halo» (nwгало) для каждого материала (М1, м2, м3 и М4) диска (диаметр 10 мм x 1 мм толщиной) против S. aureus и E. coli после 24 ч инкубации. Статистически значимые различия (p < 0.01). Однако образец M1 выставлены не антимикробной активности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Результаты метода контактной также выставлены не антимикробной активности для первого материала (M1), как это имело место в управления диск (C) и увеличения антибактериальную активность против Grampositive и грамотрицательных бактерий для других 3 материалов (см. Рисунок 4).

Figure 4
Рисунок 4: Противомикробные контакт результаты метода. Эта панель показывает соответствующие 90 мм пластин 4 материала (М1, м2, м3 и М4) поверхностной активности антимикробной assay согласно ISO 22196:2007 после 24 ч инкубации для S. aureus и E. coli (коэффициент разбавления 10-4). C является жизнеспособным бактерий, оправился от управления диска после 24 ч инкубации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Утрата жизнеспособности (%) определяется уравнение (2) и (3) как указано в настоящем Протоколе (см. Рисунок 5).

Figure 5
Рисунок 5: потеря жизнеспособности контакта методом. Эта панель показывает потерю жизнеспособности (%) для M1, M2, M3 и M4 против S. aureus и E. coli на поверхности материала. Образец M1 выставлены не антимикробной активности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Однако ни один из 4 материалы смогли препятствовать рост дрожжей Candida albicans , контактным способом либо (изображения не отображаются). Таким образом 3 этих 4 передовых материалов показал положительные результаты антимикробной против грамположительных и грамотрицательных бактерий и таким образом может быть очень полезным для многих приложений биоинженерии с требованиями высокой антибактериальной активностью. Однако ни один из 4 материалы смогли препятствовать рост дрожжей.

Discussion

Антимикробная активность новых передовых материалов могут быть проанализированы настоящим Протоколом easy-to последующие, состоящий из 2 дополнительных процедур, основанных на 2 существующие методы: агар диска диффузии тест38 и антимикробной активности измеряется на Материал поверхности согласно норме ISO в 22196:200739.

В этой области исследований многие из антимикробной тесты, описанные в литературе зависят от весьма пробирного. Таким образом, это очень важно, чтобы иметь подробную и последовательной протоколов в различных лабораториях. Эта статья представляет собой шаг в этом направлении. Кроме того это может быть очень полезным для многих исследователей, которые обладают меньшим опытом в этой области и требуют углубленного, пошаговые процедуры для получения точных результатов.

Этот протокол может использоваться с много типов материалов, нарезать формы диска диаметром 10 мм. Хрупких материалов может быть опухшими в подходящего растворителя для 1 h для отображения процесса резки легче. Таким образом гидрофильные материалы, такие как альгинаты можно гидратированных в газобетона дистиллированной воды. Другие растворители, такие как этанол, кетонов и дихлорметан, могут быть использованы для набухают гидрофобные материалы за 1 ч до резки их. Однако некоторые материалы, такие как poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) не нужно быть опухшими и они могут быть сокращены непосредственно. После этого очень важно для сухой образца материала диски в вакуумной печи и стерилизовать каждый образец с этанолом и УФ-излучения для 1 h чтобы избежать любого риска загрязнения.

Этот протокол рекомендует TSA и БСЭ как носителей культуры и использование чистых культур 3 микроорганизмов для достижения широкого спектра микроорганизмов: грамположительные бактерии золотистого стафилококка, грамотрицательные бактерии Escherichia coli, и дрожжи Candida albicans. Однако альтернативные культуры средств массовой информации и других микроорганизмов, нуждаются в различных инкубационных условий может также использоваться с настоящим Протоколом. Иногда только 1 микроорганизма проверяется иметь первоначальное представление о антимикробной активности нового материала.

Материалы, показаны сильной антибактериальной активностью против рекомендуется 3 различных видов микроорганизмов также должны быть проверены в отношении антибиотикоустойчивых патогенов, таких как метициллин резистентный стафилококк (MRSE), который были успешно использованы с настоящим Протоколом. Другие важные лекарственно устойчивых микроорганизмов, которые вызывают большую озабоченность, являются грамположительных метициллин резистентный золотистый стафилококк (MRSA) и к ванкомицину энтерококков (VRE) и грамотрицательных Синегнойной палочки40,41.

Ингибирование биопленки и антимикробной активности материалов против других видов микроорганизмов, таких как вирусы и паразитов не может испытываться с этот протокол. Однако этот протокол расширенный весьма полезной отправной точкой для антибактериальной изучения нового материала.

В тесте диффузии диска антимикробной агар важнейшим шагом происходит, когда диск образец должен находиться в центре пластины, потому что некоторые материалы раз, как только они получают при контакте с агар СМИ. В этом случае рекомендуется использовать стерильные пара пинцеты тщательно разворачиваться образца. С другой стороны в методе контакта, важно мыть управления и образца диски очень хорошо с PBS, закупорить их четыре раза следуют активные vortexing и sonication для обеспечения того, чтобы не жизнеспособные микроорганизмы остаются приклеенная к материалу поверхности.

Этот видео-протокол может использоваться во многих приложениях биоинженерии, например Биопроцесс ткани и проектирование, поставки контролируемых наркотиков, упаковочные материалы, сточных вод и сельского хозяйства, которые используют биоматериалов с высокой желательно антимикробным потенциала.

Результаты, полученные с этого протокола являются качественными (изображения) и количественный (нормализованное ширина антибактериальные «halo» и утрата жизнеспособности) с хорошим анализом его воспроизводимости (среднее ± стандартное отклонение). При сравнении различных материалов, эти средние значения, полученные с анализа результатов метода диффузии и контакты должны быть проанализированы на одностороннюю ANOVA, следуют Турции должность Специального анализа, для того, чтобы учиться, если они являются, по статистике, значительно разные (p < 0.01).

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы признать Universidad Católica де Валенсия-Сан-Висенте Мартир для финансовой поддержки для этой работы через 2017-231-001UCV и предоставляет 2018-231-001UCV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cylindrical punch  10 mm diameter
Petri dishes soria genlab P101 90 mm diameter, sterile
Tryptic soy agar (TSA) Liofilchem 610052 Dehydrated medium 500 g (powder)
Tryptic soy broth (TSB) Liofilchem 610053 Dehydrated medium 500 g (powder)
Sterile cotton swab EUTOTUBO 300200
Centrifuge tubes VIDRA FOC, SA 429900 50 mL, sterile
Ethanol VWR 83813360 Absolute ethanol
Sterile 48-wells plate COSTAR 3548 Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene
A pair of tweezers BRAUN 24612036 Toothless
Sterile phosphate buffered saline (PBS). VWR E404-100TAPBS
Vaccum oven with a connected vacuum pump JP Selecta, SA 5900620
Laminar flow hood TELSTAR Technologies, SL TELSTAR AH-100 12.0 W lamp of UV-C radiation
Class II Biological safety cabinet LABOGENE MARS 1200
Incubator ASTEC CO, LTD SCA-165DR
Vortex mixer Biosan V-1 Plus
Spectrophotometer Macherey-Nagel, Germany Nanocolor UV/VIS II
Bunsen burner JP Selecta, SA 7001539
Alcohol burner VIDRA FOC, SA 1658/20 In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet
Orbital shaker sartorius stedim 8864845
Sonicator SELECTA 3000617 50/60 Hz
Digital calliper ACHA 17-260 0-150 mm
Serological pipette Fisherbrand 13-678-11 25 mL, sterile
Serological pipette VWR 612-4950 5 mL, sterile
Serological pipette VWR 612-5541 10 mL, sterile
Micropipette GILSON FA10005P Pipetman L P200L, plastic 20-200 µL
Micropipette GILSON F123602 Pipetman P1000, 200-1000 µL
Micropipette  GILSON FA10016 Pipetman L P12X300L, 20-300 µL
Micropipette tips LABBOX TIBP-200-960 2-200 µL
Micropipette tips LABBOX TIBP-1K0-480 100-1000 µL
Pre-sterilized tube  INSULAB 301402 10 mL 
Photo camera Canon EOS 5D Any camera with high resolution can also be utilized
Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus  strain V329 Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9),  2888–2896 (2001)
Gram-negative bacteria Escherichia coli Colección Española de Cultivos Tipo CECT CECT 101
Yeast Candida albicans Colección Española de Cultivos Tipo CECT CECT 1394
Microcentrifuge tubes  DASLAB 175508 1,5 mL
Autoclave JP Selecta, SA 4002136
Spectrophotometer-cuvettes UVAT Bio CB F-0902-02 4,5 mL
Drigalski spatula LABBOX SPRP-L05-1K0 Sterile, disposable 
glass balls (2 mm diameter) Hecht Karl 1401/2 Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula
Autoclave bags DELTALAB 200318 To sterilize microbiological residues or contaminated material
Electronic pipette filling device JetPip JET BIOFIL
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-100-010 100 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-250-010 250 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-500-010 500 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-1K0-010 1000 mL, for autoclaving culture media
Latex gloves DENIA 2278000000
Indicator tape for sterilization LABBOX STAP-A55-001 Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process.
Universal test tube rack LABBOX MTSP-001-001 To hold centrifuge tubes
Microcentrifuge tube rack VWR 211-0210 To hold microcentrifuge tubes
Sterile loop ACEFE S.A. 100140055 10 µL of capacity for microbial culture 
Material M1 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 1 
Material M2 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 2 
Material M3 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type3
Material M4 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 4 
Material C Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Control material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sydnor, E. R. M., Perl, T. M. Hospital epidemiology and infection control in acute-care settings. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 141-173 (2011).
  2. Chessa, D., et al. Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Virulence Strains as Causative Agents of Persistent Infections in Breast Implants. PLoS One. 11 (1), e0146668 (2016).
  3. Pandey, H., Parashar, V., Parashar, R., Prakash, R., Ramteke, P. W., Pandey, A. C. Controlled drug release characteristics and enhanced antibacterial effect of graphene nanosheets containing gentamicin sulfate. Nanoscale. 3 (10), 4104 (2011).
  4. Jia, Z., Shen, D., Xu, W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan. Carbohydr Res. 333 (1), 1-6 (2001).
  5. Liu, Y., Wang, X., Yang, F., Yang, X. Excellent antimicrobial properties of mesoporous anatase TiO2 and Ag/TiO2 composite films. Microporous Mesoporous Mater. 114 (1-3), 431-439 (2008).
  6. Wang, L., Chen, J., Shi, L., Shi, Z., Ren, L., Wang, Y. The promotion of antimicrobial activity on silicon substrates using a "click" immobilized short peptide. Chem Commun (Camb). 50 (8), Cambridge, England. 975-977 (2014).
  7. Kümmerer, K. Resistance in the environment. J Antimicrob Chemother. 54 (2), 311-320 (2004).
  8. Ng, V. W. L., et al. Antimicrobial hydrogels: A new weapon in the arsenal against multidrug-resistant infections. Adv Drug Deliv Rev. 78, 46-62 (2014).
  9. Hegstad, K., Langsrud, S., Lunestad, B. T., Scheie, A. A., Sunde, M., Yazdankhah, S. P. Does the Wide Use of Quaternary Ammonium Compounds Enhance the Selection and Spread of Antimicrobial Resistance and Thus Threaten Our Health? Microb Drug Resist. 16 (2), 91-104 (2010).
  10. Rana, D., Matsuura, T. Surface modifications for antifouling membranes. Chem Rev. 110 (4), 2448-2471 (2010).
  11. Lok, C. N., et al. Proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteome Res. 5 (4), 916-924 (2006).
  12. Chen, X., Schluesener, H. J. Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxicol Lett. 176 (1), 1-12 (2008).
  13. Ahamed, M., AlSalhi, M. S., Siddiqui, M. K. J. Silver nanoparticle applications and human health. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 1841-1848 (2010).
  14. Yeaman, M. R. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance. Pharmacol Rev. 55 (1), 27-55 (2003).
  15. McLean, D. T. F., Lundy, F. T., Timson, D. J. IQ-motif peptides as novel anti-microbial agents. Biochimie. 95 (4), 875-880 (2013).
  16. Brogden, K. A. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol. 3 (3), 238-250 (2005).
  17. Ghosh, C., et al. Small molecular antibacterial peptoid mimics: The simpler the better! J Med Chem. 57 (4), 1428-1436 (2014).
  18. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci. 105 (8), 2794-2799 (2008).
  19. Chen, Y., Mant, C. T., Farmer, S. W., Hancock, R. E. W., Vasil, M. L., Hodges, R. S. Rational design of alpha-helical antimicrobial peptides with enhanced activities and specificity/therapeutic index. J Biol Chem. 280 (13), 12316-12329 (2005).
  20. Porter, E. A., Wang, X., Lee, H. S., Weisblum, B., Gellman, S. H. Non-haemolytic beta-aminoacid oligomers. Nature. 404 (6778), 565 (2000).
  21. Gao, Q., Li, P., Zhao, H., Chen, Y., Jiang, L., Ma, P. X. Methacrylate-ended Polypeptides and Polypeptoids for Antimicrobial and Antifouling Coatings. Polym Chem. 8 (41), 6386-6397 (2017).
  22. Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Vidaurre-Garayo, A., Suay-Antón, J. Characterisation of macroporous poly(methyl methacrylate) coated with plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate). Eur Polym J. 43 (10), 4552-4564 (2007).
  23. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Plasma-induced polymerisation of hydrophilic coatings onto macroporous hydrophobic scaffolds. Polymer (Guildf). 48 (7), 2071-2078 (2007).
  24. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Rault, J. Thermal analysis of water in reinforced plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Eur Polym J. 72, 523-534 (2015).
  25. Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego-Ferrer, G., SuayAntón, J., Pissis, P. Interaction between water and polymer chains in poly(hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Colloid Polym Sci. 279 (4), 323-330 (2001).
  26. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Effect of crosslinking on porous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation. Colloid Polym Sci. 286 (2), 209-216 (2008).
  27. Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego Ferrer, G., Suay Antón, J., Pissis, P. Porous poly (2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Polymer (Guildf). 42 (10), 4667-4674 (2001).
  28. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Macroporous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation during polymerisation in solution. Colloid Polym Sci. 285 (7), 753-760 (2007).
  29. Serrano-Aroca, Á, Llorens-Gámez, M. Dynamic mechanical analysis and water vapour sorption of highly porous poly(methyl methacrylate). Polymer (Guildf). 125, 58-65 (2017).
  30. Serrano-Aroca, Á, Campillo-Fernández, A. J., Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Gallego-Ferrer, G., Pissis, P. Porous poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels prepared by radical polymerisation with methanol as diluent. Polymer (Guildf). 45 (26), 8949-8955 (2004).
  31. Rodríguez-Hernández, J. C., Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M. Three-dimensional nanocomposite scaffolds with ordered cylindrical orthogonal pores. J Biomed Mater Res - Part B: Appl Biomater. 84 (2), 541-549 (2008).
  32. Brígido-Diego, R., et al. Acrylic scaffolds with interconnected spherical pores and controlled hydrophilicity for tissue engineering. J Mater Sci Mater Med. 40 (18), 4881-4887 (2005).
  33. Serrano-Aroca, Á, Ruiz-Pividal, J. F., Llorens-Gámez, M. Enhancement of water diffusion and compression performance of crosslinked alginate with a minuscule amount of graphene oxide. Sci Rep. 7, 11684 (2017).
  34. Serrano-Aroca, Á, Deb, S. Synthesis of irregular graphene oxide tubes using green chemistry and their potential use as reinforcement materials for biomedical applications. PLoS One. 12 (9), e0185235 (2017).
  35. Sánchez-Correa, F., Vidaurre-Agut, C., Serrano-Aroca, A., Campillo-Fernández, A. J. Poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels reinforced with graphene oxide: Remarkable improvement of water diffusion and mechanical properties. J Appl Polym Sci. , (2018).
  36. Serrano-Aroc, Á, Iskandar, L., Deb, S. Green synthetic routes to alginate-graphene oxide composite hydrogels with enhanced physical properties for bioengineering applications. Eur Polym J. 103, 198-206 (2018).
  37. Llorens-Gámez, M., Serrano-Aroca, Á Low-Cost Advanced Hydrogels of Calcium Alginate/Carbon Nanofibers with Enhanced Water Diffusion and Compression Properties. Polymers (Basel). 10 (4), 405 (2018).
  38. Bauer, A. W., Kirby, W. M. M., Sherris, J. C., Turck, A. M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. A J Clin Pathol. 45, 493-496 (1966).
  39. ISO Specification 22196: measurement of antibacterial activity on plastics surfaces. , 584 (2007).
  40. Taubes, G. The bacteria fight back. Science. 321 (5887), 356-361 (2008).
  41. Boucher, H. W., et al. 10 x '20 progress--development of new drugs active against Gram-negative bacilli: an update from the infectious diseases society of America. Clinical Infectious Diseases. 56 (12), 1685-1694 (2013).

Tags

Биоинженерии выпуск 138 современные материалы антимикробные характеристика диск диффузии поверхности материала биоинженерии
Антимикробной характеристика современных материалов для приложений биоинженерии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martí, M., Frígols, B.,… More

Martí, M., Frígols, B., Serrano-Aroca, A. Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications. J. Vis. Exp. (138), e57710, doi:10.3791/57710 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter