Summary
ב פרוטוקול זה, נתאר כיצד להפוך Loewe סמים additivity אינטראקציה מדידות של pairwise ואת שילובים תרופתיים-כיוונית.
Abstract
שילוב סינרגטי סמים יש על יעילות גבוהה יותר בהשוואה להשפעות של סמים בודדים. מבחני לוח שחמט, איפה הסמים משולבים במינונים רבים מאפשרים מדידה רגיש של תגובות בין תרופתיות. עם זאת, מבחני האלה יקרות, אל תגדיל גם עבור מדידת אינטראקציה בין תרופות רבות. מספר מחקרים שנערכו לאחרונה דיווחו על סמים אינטראקציה מדידות באמצעות דגימה אלכסוני של לוח שחמט מסורתי וזמינותו. מתודולוגיה חלופית זו במידה רבה מקטין את העלות של סמים אינטראקציה ניסויים ומאפשר אינטראקציה המדידה שילובים עם תרופות רבות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד את האינטראקציות pairwise שלושה, אחד אינטראקציה משולשת בין שלושה אנטיביוטיקה על כפולות, תוך חמישה ימים, תוך שימוש רק שלושה microplates 96-ובכן וציוד מעבדה סטנדרטיים. אנו מציגים תוצאות נציג מראה כי שילוב שלוש-אנטיביוטיקה Levofloxacin + חומצה Nalidixic + פניצילין G הוא סינרגטי. פרוטוקול שלנו להרחבה מדרגית כדי למדוד אינטראקציות בין תרופות רבות, בהקשרים אחרים ביולוגי, המאפשרות מסכי יעיל עבור סינרגיה סמים רב נגד פתוגנים וגידולים.
Introduction
שילובים תרופתיים ייתכן שיישומים השפעה מפתיעה גבוה או נמוך על הפנוטיפ נתון להשפעות של סמים המרכיבים אותה, המתאים סינרגטי או אויבת תרופתיות, בהתאמה1,2,3. השימוש של שילוב סינרגטי עשוי לאפשר המינון להגדלת היעילות וצמצום במינון להקלה לוואי. שילוב הטיפולים עשוי לחול גם עיכובים מרובים למכונאות הסלולר, ובכך חוסם מנגנוני הבריחה אבולוציונית פוטנציאל ההתנגדות4. לכן, שילובים של שלושה או יותר תרופות משמשים באופן שגרתי פתוגן או סרטן הטיפול5.
סינרגיה, אנטגוניזם מוגדרים על-ידי השוואה בין השפעת שילוב לעומת אפקט הצפויה בהתחשב סמים בודדים תופעות שנצפו. בין המודלים תרופתיות, לואי additivity היא המחמירה והקפדנית ביותר יש מודל null מוגדרים היטב (איור 1)6ואת האינטראקציה סינרגיה הנגזרת/אנטגוניזם אינו תלוי ריכוז התרופה בשימוש 6 , 7. לעומת זאת, המודל Loewe היא השפעול יקר אפילו עבור מבחן pairwise אינטראקציה. מבחני אינטראקציה סמים באופן מסורתי המרכיבים של מטריצה דו-ממדית של שילובים תרופתיים ריכוז (וזמינותו לוח שחמט) (איור 2). 5 מנות משמשים עבור כל סם, אם 25 שילובים נדרשים, התואם לאחד מחצית microplate אם מתבצעות בשכפול. העלות של גישה זו אוסרת על סינרגיה מדידה לפי מודל additivity Loewe עבור שילובי סמים רב (איור 3). לדוגמה, כדי לבדוק את האינטראקציה של 10-way, שיטות מסורתיות ידרוש יותר מ 100 אלף microplates, ולסיסמא מדידה ניסיוני של סינרגיה גבוהה-הזמנה לפי מודל additivity Loewe מחמירים, theorized היטב, שאינו תלוי-ריכוז 8.
טיפולים קליניים שוטפים מנצלים רק שבריר של שילובים תרופתיים אפשרי. לדוגמה, הטיפול הסטנדרטי של שחפת פעילה הוא שילוב של שלושה אנטיביוטיקה. ישנם כ 20 אנטיביוטיקה המשמשים לטיפול שחפת Mycobacterium (שחרור מהיר למוט אוכף). ישנם 1140 הקומבינציות אסידו בין 20 תרופות, כל אחד עם פוטנציאל יש סינרגיה חזקה נגד שחרור מהיר למוט אוכף. שם כבר אין שיטה חסכונית כדי למדוד את תגובות בין תרופתיות בין תרופות רבות, הצלת חיים פוטנציאל סינרגטי שילובים נשארים שלא נבדקו.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול פשוט למדוד pairwise וכיוונית תרופתיות באמצעות דגימת רק באלכסון של וזמינותו לוח שחמט (איור 4 , איור 5). הרעיון הבסיסי של דגימה האלכסון של ניסוי לוח שחמט היתה תיאוריה על-ידי Berenbaum בעבודתו החלוצי ב 19789. ובכל זאת, גישה זו רק לאחרונה הוחל סמים סינרגיה מסכי10,11,12. אנו מציגים את הפרוטוקול שלנו עם Escherichia coli (e. coli) ותפקיד של צמיחה. עם זאת, נציין כי הפרוטוקול עצמאי של מינים ביולוגיים, פנוטיפ של עניין, ולכן ניתן להחיל את המידה של סמים גבוהים סינרגיה בהקשרים ביולוגיים אחרים.
Protocol
הערה: כל מולקולה קטנה זה מעכב התפתחות חיידקים e. coli יכול לשמש עבור שיטת אלכסוני. ב פרוטוקול זה, levofloxacin (לב), חומצה nalidixic (NAL), ו פניצילין G (PNG) ישמש כדוגמה, מאז תרופות אלה להראות סינרגיה משולשת מובהקת. זרימת העבודה של פרוטוקול זה מוצג באיור 6. לבצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר. השתמש aliquots טריים של חיידקים, תרופות כל יום. לבצע את הניסוי תחת רמות אבטחה מתאים e. coli.
1. הכנה צעדים
- להכין לוריא-Bertani (LB) מדיה על-ידי הוספת 25 גר' מרק LB 1 ליטר של מים מזוקקים ומערבבים. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות וחנות המדיה בלוק בטמפרטורת החדר.
- הכן e. coli גליצרול מניות על ידי ערבוב נפחים שווים של גליצרול 50% סטרילי, תאים חיידקיים מדולל כדי OD600 = 1 LB מרק ומקפיאים 150 aliquots µL 1.5 mL צינורות microcentrifuge ב-80 מעלות צלזיוס.
- לפזר 20 מ ג של אנטיביוטיקה, לב, NAL ו- PNG ב- 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) כל אחד. לדלל לב פתרון 100 x 0.2 µg/mL על ידי ערבוב µL 10 של פתרון לב עם 990 µL של דימתיל סולפוקסיד. השתמש 0.2 מ"ג/מ"ל לב, 20 מ"ג/מ"ל NAL ו- PNG בשלבים בהליך.
- Aliquot 50 µL של כל אנטיביוטיקה ל 1.5 mL microcentrifuge צינורות, הקפאת ב-20 ° C.
- Aliquot µL לקחת 150 אחד של e. coli מ-80 מעלות צלזיוס. הפשרה.
- להוסיף 100 µL של e. coli גליצרול מניות ב 5 מ ל LB מדיה בשפופרת תרבות 14 מ.
- לרעוד הצינורות 37 ° C חממה בן לילה-200 סל ד.
2. טורי דילול ניסוי מנה-תגובה
- קח את אחד aliquot של סמים לב, NAL ו- PNG מ-20 ° C, להשאיר אותם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. להפשיר ולהתכונן דילולים טורי של תרופות אלו.
- להכין 1100 µL של סול LB - 10% על ידי ערבוב 990 µL של התקשורת LB µL 110 של הממס (דימתיל סולפוקסיד).
- להכין µL 500 של לב LB - 10% על ידי ערבוב µL 450 של מדיה LB µL 50 של לב.
- מערבולת סול LB - 10% עבור 5 s ב ההגדרה הגבוהה ביותר. הוסף 20 µL של סול LB - 10% העליון ארבע השורות של בורות מים microplate 96-ובכן.
- מערבולת לב LB - 10% עבור 5 s ב ההגדרה הגבוהה ביותר. להוסיף 20 µL של LB - 10% לב הבאר הראשונה בשורה א
- היכונו דילול טורי כפולה לב LB - 10% על ידי לקיחת 20 µL מן הבאר הראשונה, הוספת הבאר השנייה, pipetting לאורך חמש פעמים. חזור על הפעולה עבור כל בארות ברצף עד ה-11 טוב, אשר בסופו עם 40 µL (איור 7 א).
- להסיר ולמחוק 20 µL של התוכן של ה-11, שימוש של micropipette.
- חזור על הצעדים 2.3-2.7 הסמים NAL ו- PNG באמצעות לשורות microplate, השני והשלישי בהתאמה.
- חזור על הצעדים 2.3-2.7 התרופה לב שוב על השורה הרביעית כפקד של חיובי פנימי.
- שימוש ספקטרופוטומטרים, למדוד את יתר600 של 1:10 דילול של התרבות (שלבים 1.5-1.7).
- לדלל את התאים ב 5 מ של מדיה ליברות יתר600 של 0.01. שופכים לתוך מאגר.
- שימוש של micropipette רב-ערוצי, להוסיף µL 80 של התאים מדולל דילולים טורי סמים מוכנה בשלב 2.4-2.9. ריכוז התרופה האחרונה היטב כל מוצג איור 7 א. חותם את הצלחת כדי למנוע התאיידות.
- דגירה את הצלחת. בשביל h 16 ב 37 º C.
- מתחילים תרבות חדשה חיידקי לשימוש בשלב 3 (חזור על צעדים 1.5-1.7).
3. ליניארי דילול ניסוי מנה-תגובה
- למדוד את ספיגת600 OD לצלחת מנה-תגובה דילול טורי משלב 2 שימוש בקורא צלחת (איור 7 א נכון) ולפרש את התוצאות בהתבסס על השלבים הבאים.
- לנרמל את הצמיחה על ידי חלוקת הגידול בכל טוב עם הגידול בפקד סמים אין עבור כל שורה ולחישוב אחוזי הצמיחה על ידי נרמול OD600למצב ללא סמים.
- לכל סם, אתר הבארות שיש עיכוב גדילה ~ 50% (IC50), שמוצג כתום איור 7 א נכון. הקצה את הריכוז בבארות האלה כמו "IC50 טורי" לכל סם.
- הפשרת סמים טרי aliquots, להכין 1 מ"ל של סול LB - 10% על ידי ערבוב LB ומדיה הממס (דימתיל סולפוקסיד) 9:1 יחס, סמים LB - 10% על ידי ערבוב LB ומדיה סמים על יחס 9:1, הריכוז של התרופה איפה x 100 של IC50 סדרתי של כל תרופה לפני הוספת התקשורת ליברות , כפי שבחרת בשלב 3.3.
- להכין מנות באופן ליניארי הגוברת של סמים לב, NAL ו- PNG בריכוזים 11, על ידי ערבוב LB - 10% sol כרכים שמוצג באיור 7 בוהסמים LB - 10%.
- להכין מנות באופן ליניארי הגוברת של לב על השורה הרביעית כפקד של חיובי פנימי.
- למדוד את יתר600 של ה-1:10 דילול של התרבות התחיל בשלב 2.14.
- לדלל את התאים ב 5 מ של מדיה ליברות יתר600 של 0.01. שופכים לתוך מאגר.
- מוסיפים 80 µL של התאים מדולל על דילולים ליניארי סמים מוכנה בשלב 3.6 באמצעות micropipette רב-ערוצי. ריכוז התרופה האחרונה היטב כל מוצג באיור 7.
הערה: באמצע גם המנה-תגובה יקבלו את IC50 סדרתי של הסם. חותם צלחת כדי למנוע התאיידות. - דגירה את הצלחת. בשביל h 16 ב 37 º C.
- התחל שתי תרבויות חיידקי טריים לשימוש בשלב 4 (חזור על צעדים 1.5-1.7).
4. אלכסוני סמים אינטראקציה ניסוי
- למדוד את ספיגת600 יתר על דילול ליניארי מנה-תגובה מ שלב 3 (איור 7 ב).
- לכל סם, לבחור הריכוז, גרמו IC50, להכין סמים לב, NAL ו- PNG בריכוזים x IC50 100.
- הפשרת סמים טריים, היכונו 100 x IC50 עבור כל הסמים ולהכין תערובות 1:1 סמים לפי נפח של לב + NAL, לב + PNG ו- NAL + PNG ו- 1:1:1 סמים תערובת לפי נפח של לב + NAL + PNG.
- להכין שתי צלחות לניסויים אינטראקציה סמים כמוצג באיור8.
- למדוד את יתר600 של ה-1:10 דילול של התרבויות התחיל בשלב 3.11.
- להכין OD600 = 0.01 דילולים של שתי תרבויות ב שני 10 מ ל LB מדיה.
- מוסיפים 80 µL של התאים מתרבות 1 ו- 2 על צלחות 1 ו- 2, בהתאמה. חותם את הצלחות כדי למנוע התאיידות. דגירה הלוחות עבור h 16 ב 37 º C.
5. אלכסוני סמים אינטראקציה עם ציונים
- למדוד ספיגת600 יתר לאינטראקציה סמים אלכסוני הניסוי צלחות משלב 4.
- לנרמל את הצמיחה על ידי חלוקת הגידול בכל טוב עם הגידול בפקד סמים לא טוב עבור כל שורה.
- עבור כל שורה, אתר את העמודה בעלת הצמיחה עיכוב הקרוב ביותר IC50, שמוצג כתום באיור 8 צודק. הקצה IC50 מבוסס על הריכוז היחסי של סמים בתוך הבאר הזו.
- לב + NAL, לב + PNG של מינון-תגובות NAL + PNG ולב + NAL + PNG, לחשב IC50 הצפוי על ידי חישוב ממוצע של IC50 של התרופות יחיד בכל שילוב. שימו לב כי בממוצע הערכה פשוטה לחישוב IC50 הצפוי המדויק כפי שתואר לפני12.
- לחשב ריכוז מעכבות החלקי (FIC) ציונים על-ידי חלוקת את IC50 נצפתה על ידי IC50 הצפוי בכל שילוב.
Representative Results
בעבר דיווחנו את האינטראקציות pairwise בין שלושה סוגי סמים: לב, NAL ו- PNG מבוסס על בדיקות מבחני ולמחקר לוח שחמט, שבו שתי התרופות היו בשילוב13,מטריצה 4 x 414. בעוד NAL ולא לב היו סינרגטי, PNG דווח להיות עוינת עם13,לב והן NAL14. כאן, אנחנו אומת אינטראקציות pairwise אלה נמדד אינטראקציה משולשת בין תרופות אלו שלושה שימוש assay אלכסוני של. התוצאות שלנו להפגין כי לב + NAL + PNG היא שילוב סינרגטי של אנטיביוטיקה 3-way. ייצוג סכמטי עבור התוצאות של סעיפים בודדים ניתוח ניסיוני ניתנו בצד ימין של איור 7 ו איור 8. כאן, אנו מציגים לפרש תוצאות raw נציג שלוש קריאות צלחת, הניתנות באיור9. הקריאה הפלטה מקביל דילול טורי וארוך ניסויים שנערכו שלבים 2 ו- 3. התחתון שני בצלחת הקריאות צלחות אינטראקציה כפולים שנערך בשלב 4.
הנתונים הגולמיים באיור 9 מראה כי הצמיחה העליונה היא סביב 0.55, אבל יש צפיפות אופטית 0.05 של התקשורת עצמה, כפי שנצפתה ה OD600 של ריכוז גבוה סמים שבה אין צמיחה. לכן, אנו מגדירים IC50 כמו (0.55-0.05)/2 = 0.25. עבור כל מנה-תגובה, הבארות ממוקם קרוב לערך זה מוצגים עם כתום.
החצי העליון של איור 9A מציגה את התוצאות של שלב 2, טורי מנה-תגובה ניסוי. בארות IC50 לב הוא עמודה 10 עובדים בשני משכפל, אשר תואמות את 4 ng/mL. IC50 עבור NAL ו- PNG נמצאים 3 µg/mL 25 µg/mL, בהתאמה. ריכוזים אלה תואמים ריכוז 1 x שמוצג באיור 7. החצי התחתון של איור 9B מציגה את התוצאות של שלב 3, ניסויים של מנה-תגובה לינארית. לב, NAL, IC50 של PNG נמצאים 0.4 x, 0.8 x ו- 1.2 x, בהתאמה. ריכוזים אלה מוקצות כמו ה 1 X IC50 שלב 4.
שתי צלחות המתאים שכפול שני ניסויים מוצגות באיור איור 9B, איפה IC50 בארות מוצגים עם כתום. בצלחת 1, כל התרופות יחיד יש IC50 שלהם 1 x ריכוז. IC50 הצפוי עבור שילוב pairwise או משולשת מחושב לפי הממוצע החשבוני של סמים המרכיבים אותה, שהופך IC50 הצפוי עבור כל שילובי גם 1 x ריכוז. בצלחת 2, לב ו- PNG יש IC50 שלהם-ריכוז 1 x, אך NAL IC50 ב 1.2 x. IC50 הצפוי עבור כל שילוב מוגדר באמצעות אמצעי האריתמטיקה של ערכים אלה IC50. לדוגמה, IC50 הצפוי עבור לב + NAL ו- NAL + PNG היא 1.1 x. האינטראקציה סמים ניקוד (FIC) עבור כל צירוף הוא מחושב על ידי חלוקת נצפתה IC50 עם IC50 הצפוי, כפי שמוצג על הצד הימני של הלוחות. בדיקה של עשרות FIC שתי צלחות מדגים לב + NAL ולא לב + NAL + PNG הם סינרגטי, ואילו לב + PNG ו- NAL + PNG הם אויבת. FIC ציוניהם ב שתי צלחות הם מסכימים, המשנה את המהימנות של הפרוטוקול.
איור 1: Null ההגדרה המודל עבור לואי additivity סמים אינטראקציה דגם- 5 x 5 שתי מטריצות על microplate, שבו סמים A באופן ליניארי גדל בציר אחד כפי שמוצג בחלק השמאלי, ריכוז העליון של התרופה מעכב הפנוטיפ לכימות (למעלה מימין). התוספת של מטריצות אלה מוצג באמצע, שבו הקווים המחברים equipotent סמים ריכוזים של כל תרופה יחידה יש ריכוז זהה כמו סמים א כאשר תאים נוספים על "בשביל" של שילובים תרופתיים ריכוז, צפוי כי פנוטיפ מוקלט על הקו הזה יהיה שווה בשביל הבארות שהיא מתחברת. בניסוי זה האינטראקציה האני-עצמי בסמים, isobole המתארים את הפנוטיפ (מוצג עם קו ירוק מקווקו) צפוי להיות ליניארי, הגדרת המודל additivity null. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: תרופתיות Pairwise לפי מודל האינטראקציה של סמים additivity Loewe. כאשר שתי תרופות משולבות ב- assay לוח שחמט כמו באיור 1, קווי המתאר isophenotypic נצפתה עשוי להיות ישר, קמורה או קעורה. בצד ימין, קווי המתאר isophenotypic אפשרי (קווים ירוק מקווקו) הם יונחו על מבחני לוח שחמט. שילובים תרופתיים עם קווי מתאר isophenotypic ישר הן לאו-תוסף, קווי המתאר אינם שונים בכשל תרופתי האני-עצמי, אשר הוא לואי-תוסף לפי ההגדרה. כאשר קווי המתאר isophenotypic באופן משמעותי קעורים או קמורים, השילוב הוא סינרגטי או עוינת, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: 3 חלקים תרופתיות לפי מודל האינטראקציה של סמים additivity Loewe. בדומה וזמינותו לוח שחמט עבור אינטראקציות pairwise, שלוש-סמים משולבים ברשת תלת-ממד ("checkercube"), שבו כל תרופה הוא גדל באופן ליניארי בציר אחד. אם הסמים שלושה היו זהים, פני השטח isophenotypic צפוי להיות שטוח, מגדיר את additivity עבור שלושה שילובים תרופתיים. אם השטח יותר קעורים או קמורים יותר מודל null זה לאו-תוסף, שילובים תרופתיים הם סינרגטי או עוינת, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: שיטת באלכסון כדי למדוד תרופתיות pairwise. עבור כל לוח שחמט assay, נמדדים רק את האזורים המוצגים מלבנים בצבע ארגמן. i ו- ii הם ליניארי סמים בכול ריכוזים. השלישי הוא מוערך על ידי תערובת 1:1 של שתי תרופות ו באופן ליניארי titrating תערובת זו כאילו היא תרופה בודדת. FIC שווה IC50 נצפתה בשילוב מחולק את IC50 הצפויה של שתי תרופות יחיד. עבור המודל additivity לאו, IC50 הצפוי נאמדת באמצעות IC50 הממוצע של התרופות שני יחיד. ערך FIC 1 עבור זוגות לואי-תוסף והיא נמוכה או גבוהה מ- 1 עבור זוגות סינרגטי או עוינת, בהתאמה2,12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: שיטת באלכסון כדי למדוד-כיוונית תרופתיות. עבור כל checkercube assay, נמדדים רק את האזורים המוצגים. i, ii ו- iii נמצאים ליניארי סמים בכול ריכוזים. iv נמדד על ידי ביצוע של 1:1:1 תערובת של שלושת התרופות באופן ליניארי titrating תערובת זו כאילו היה תרופה בודדת. הריכוז המעכב החלקי שווה ה IC שנצפה50 בשילוב מחולק את IC50 הצפוי מקבלים שלוש תרופות יחיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: זרימת עבודה עבור הפרוטוקול בשיטה אלכסונית המתוארים בזאת ואת פרטי ההתקנה עבור כל microplate. הצלחת באיור 4 יום מתבצע תוך שכפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: דילול טורי וארוך מנה-תגובה ניסויים. (א) הכנה של דילול טורי מנה-תגובה סמים וריכוזי סמים הסופית המתאימה. E. coli תאים נוספים לצלחת; צמיחה נרשם לאחר ה 16 IC50 טורי, שמוצג כתום, נבחרה עבור כל סם טעם למחרת של ליניארי דילול מנה-תגובה ניסויים. (B) הכנה של דילול ליניארי מנה-תגובה סמים וריכוזי סמים הסופית המתאימה. E. coli תאים נוספים לצלחת; צמיחה נרשם לאחר 16 שעות. לכל סם, IC50s שנבחר אשר ישמש בליום סמים אינטראקציה ניסויים מוצגים ב orange. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: סמים אינטראקציה ניסויים. הכנת ניסויים האינטראקציה הוא דומה יחיד סמים ליניארי מינון-תגובות, למעט 1:1 או 1:1:1 תערובת של תרופות משמש לשניים או שלוש תרופות במינון-תגובות, בהתאמה. נצפתה IC50s עבור כל מנה-תגובה, מתואר ב orange, משמשים לחישוב FIC ציונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9: נציג ניסוי תוצאות. נציג התוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול המתואר מוצגים, עם פרטי ההתקשרות לטקסט הראשי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
השימוש של שילובים תרופתיים נגד פתוגנים או גידולים הוא פרוספקט אטרקטיבי, במיוחד בנסיבות של הצינור לאנטיביוטיקה ייבוש. עם זאת, פוטנציאל זה היא הקשו על ידי לפחות שני קשיים. הקושי הראשון הוא מספר אסטרונומי של צירופים אפשריים. לדוגמה, ישנם 4950 pairwise. צירופים אפשריים בין 100 אנטיביוטיקה. כל השילובים האפשריים בין 100 אנטיביוטיקה (2100) נמצא באותו סדר גודל הצפוי עם המספר של חיידקים על פני כדור הארץ (~ 1030). כיצד לחזות שילובים חריפה סינרגטי בין האפשרויות הללו כבר את הנושא של מחקרים רבים חישובית. הקושי השני הוא המדד של אינטראקציות בסמים גבוהים. קח בחשבון כי פלטפורמה חישובית יכול להציע כי שילוב 10-סמים מסוימים הוא סינרגטי בחריפות נגד חיידקים מסוימים. שיטות מסורתיות כדי לבדוק אינטראקציות בסמים הוא יקר מדי לאמת או להפריך השערה זו, ולכן המחקר של סינרגיה בין תרופות רבות כבר מחוץ לגבולות של חקירה מדעית. שיטת אלכסוני, אשר הועלתה לראשונה לפני כמעט 30 שנה והיה בשימוש מספר מסכי סינרגיה האחרונה מספקים בסיס חזק הבעיה הראשונה, בכך שהוא מאפשר בדיקה של האינטראקציה בין זוגות רבים. הוא פותר את הבעיה השנייה על ידי הדגימה אינפורמטיבי של מבחני המסורתי ומאפשר לימוד גבוהים תרופתיות.
חשוב לציין נציין כי הפרוטוקול שלנו משתמשת מינון לינאריים למדידות אינטראקציה עם סמים, כדי לספק את הרגישות לגילוי אפילו אינטראקציות חלשות. הקמת טווח ריכוז נכון עבור מינון לינאריים הוא משימה מאתגרת. מאת הראשון מבצע לדילול טורי, לנו לקבל החלטה מושכלת לגבי שטח החיפוש עבור מינון לינאריים. עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות שונה לשימוש קיפול כפול או דילולים טורי גבוה יותר עבור סמים בדיקות האינטראקציה. שינוי כזה לקצר את זמן הניסוי ולאפשר בדיקה של אינטראקציות יותר; ואולם זה אין רגישות כדי לזהות אינטראקציות רק בחום סינרגטי או עוינת.
פרוטוקול שהסברנו מציג את המדידה של אינטראקציות pairwise או משולשת. היבט חשוב של הפרוטוקול הוא אחד הסוכנים באותה צלחת כמו השילוב, כדי לצמצם הטיה בשל הבדלים צלחת. לכן, ניתן להתאים את הפרוטוקול כדי למדוד את האינטראקציות עד 7-הדרך שילובים על-ידי שינויים טריוויאלי. שילובים של תרופות יותר מ-7 ידרוש יותר מפעם אחת microplate 96-ובכן, שיקולים נוספים יש לנקוט כדי להבטיח שילוב הנתונים הנכונים, כגון משכפל הבין-plate.
מגבלה הבולטים של השיטה אלכסונית היא ההגבלה כי כל תרופה וזמינותו חייב לעכב את פנוטיפ של עניין. לכן, השיטה אלכסוני אינו שימושי להבנת את האינטראקציות בין סוכנים פעילים וחיסונים adjuvants אינרטי. אינטראקציות 'שמגדיל יכולתו' כזה עשויים להילמד תחת מודלים חלופיים כגון מודלים אושר או סוכן יחיד הגבוהה ביותר.
שיקול חשוב לניתוח של אינטראקציות בסמים גבוהים הוא הבחירה null מודל "מצופה IC50." כאשר שתי תרופות משולבות, האפקט של השילוב בלבד ניתן להשוות את ההשפעות התרופה יחיד. כאשר שלושת התרופות משולבות, ניתן להשוות האפקט של השילוב אפקטים בודדים או אפקטים pairwise. לדוגמה, אם כל השילובים pairwise של שלושת התרופות סינרגטי, ואז זה יש לצפות כי תרופות אלו יראה סינרגיה-כיוונית. הסטייה של אינטראקציה משולשת מה צפוי של אינטראקציות pairwise לאחרונה שכונה "אינטראקציה מתהווים"16,17. פשטות, פרוטוקול שלנו מתאר את המדידה של 3 חלקים של שילוב "נטו אינטראקציה," אשר מגדיר את המודל null השפעות סמים בכול. עם זאת, הנתונים המתקבל מהגדרת הפרוטוקול עשוי לשמש גם כדי לחשב את האינטראקציה מתהווה של השילוב-כיוונית. בניתוח שלנו, אנו מגדירים את IC50 הצפויה של השילוב-כיוונית כממוצע של הסם יחיד IC50s. לחלופין, IC50 צפויה יכולה להיות מוגדרת כממוצע של IC50s של שילובים pairwise (~1.1-1.2). כאשר IC50 נצפתה מחולק ב- IC50 הצפוי חלופית זו, FIC שהושג מספק את FIC מתהווים השילוב-כיוונית, כמו שתואר לעיל12. שיקול זה מגלה כי לב + NAL + PNG הוא סינרגטי יותר מאשר מה מצופה מכל האינטראקציות pairwise בין שלושת התרופות, הוכחת כי לב + NAL + PNG יש סינרגיה מתהווה.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומן על ידי גרנט NIGMS P50GM107618. המחברים תודה זהר B. וינשטיין להערות תובנה של הצעות על כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Semi Micro Cuvette | VWR | 97000-586 | |
| 1.5 mL Eppendorf Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 4036-3204 | |
| 1000 µL Tips | Geneseesci | 24830 | |
| 14 mL Breathable Cell Culture Tube | VWR | 60819-761 | |
| 20 µL Tips | Geneseesci | 24804 | |
| 200 µL Tips | Geneseesci | 24815 | |
| 37 °C Incubator | Panasonic | MIR-262-PA | |
| 37 °C Shaker Incubator | Thermo Scientific | SHKE8000 | |
| 5 mL Cell Culture Serological Pipette | VWR | 53300-421 | |
| 96-well Microplates | VWR | 15705-066 | |
| Breathable Sealing Film | USA Scientific | 2920-0010 | |
| DMSO | Sigma | 41647 | |
| Escherichia coli | ATCC | 700926 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| LB Broth Powder | RPI | L24065 | |
| Levofloxacin | Sigma | 28266 | |
| Micropipette | GILSON | PIPETMAN Classic | |
| Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | |
| Multichannel micropipette | VistaLab | 1060 | |
| Nalidixic acid | Sigma | N8878 | |
| Penicillin G | Sigma | P3032 | |
| Pipette Pump | Drummond | 4-000-501 | |
| Reagent Reservoir | VWR | 89094-658 | |
| Spectrophotometer | BIO-RAD | 1702525 | |
| Vortex Mixer | Fisher Scientific | 10-320-807 |
References
- Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts. Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).
- Berenbaum, M. C. What is synergy? Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).
- Cokol, M. Drugs and their interactions. Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).
- Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance. Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).
- Lehár, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. High-order combination effects and biological robustness. Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).
- Loewe, S. The problem of synergism and antagonism of combined drugs. Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).
- Foucquier, J., Guedj, M. Analysis of drug combinations: current methodological landscape. Pharmacology Research & Perspectives. 3 (3), (2015).
- Wood, K. B. Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).
- Berenbaum, M. C. A method for testing for synergy with any number of agents. Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).
- Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis. Scientific Reports. 7, 42644 (2017).
- Horn, T., et al. High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells. Cancer Research. 76 (23), 6950-6963 (2016).
- Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis. Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).
- Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).
- Mason, D. J., et al. Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).
- Yilancioglu, K., et al. Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity. Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).
- Beppler, C., et al. Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors. Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).
- Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs. Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).
