Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

विकर्ण विधि दवाओं के किसी भी संख्या के बीच तालमेल को मापने के लिए

doi: 10.3791/57713 Published: June 21, 2018

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम कैसे pairwise और तीन तरह के दवा संयोजनों के लिए Loewe additivity आधारित दवा बातचीत माप बनाने के लिए का वर्णन ।

Abstract

एक synergistic दवा संयोजन व्यक्तिगत दवाओं के प्रभाव की तुलना में एक उच्च प्रभावकारिता है । चेकरबोर्ड परख, जहां दवाओं कई खुराकों में संयुक्त कर रहे हैं, दवा बातचीत के संवेदनशील माप की अनुमति दें । हालांकि, इन परख महंगा है और कई दवाओं के बीच बातचीत को मापने के लिए अच्छी तरह से पैमाने पर नहीं है । कई हाल के अध्ययनों की रिपोर्ट है दवा संपर्क माप पारंपरिक चेकरबोर्ड परख के एक तिरछे नमूने का उपयोग कर । इस वैकल्पिक पद्धति बहुत दवा बातचीत प्रयोगों की लागत कम हो जाती है और कई दवाओं के साथ संयोजन के लिए बातचीत माप की अनुमति देता है. यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए तीन pairwise बातचीत और डुप्लिकेट में तीन एंटीबायोटिक दवाओं के बीच १ ३ तरह की बातचीत को मापने, पांच दिनों में, केवल ३ ९६-well microplates और मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग कर । हम मौजूद प्रतिनिधि परिणाम दिखा रहा है कि Levofloxacin के तीन एंटीबायोटिक संयोजन + Nalidixic एसिड + पेनिसिलिन जी synergistic है । हमारे प्रोटोकॉल को तराजू कई दवाओं के बीच बातचीत और अंय जैविक संदर्भों में उपाय, बहु के लिए कुशल स्क्रीन रोगजनकों और ट्यूमर के खिलाफ दवा सहयोग के लिए अनुमति देता है ।

Introduction

दवा संयोजन एक घटक दवाओं के प्रभाव दिया phenotype पर आश्चर्यजनक रूप से उच्च या कम प्रभाव प्रदर्शन कर सकते हैं, synergistic या विरोधी दवा बातचीत करने के लिए इसी, क्रमशः1,2,3. synergistic संयोजनों के उपयोग की अनुमति दे सकता है प्रभावकारिता वृद्धि और खुराक के लिए वृद्धि-पक्ष-प्रभाव राहत के लिए कमी. संयोजन उपचार भी सेलुलर मशीनरी के लिए कई असफलताओं लागू कर सकते हैं, जिससे प्रतिरोध4के लिए संभावित विकासवादी भागने तंत्र को अवरुद्ध । इसलिए, तीन या अधिक दवाओं के संयोजन नियमित रूप से रोगज़नक़ या कैंसर के उपचार में प्रयोग किया जाता है5

सिनर्जी और विरोध एक अपेक्षित व्यक्तिगत दवा प्रभाव को देखते हुए प्रभाव बनाम एक संयोजन के प्रभाव के बीच तुलना द्वारा परिभाषित कर रहे हैं । दवा बातचीत के लिए मॉडलों के अलावा, Loewe additivity सबसे कड़े है और एक अच्छी तरह से परिभाषित नल मॉडल (चित्रा 1)6है, और आस्थगित सिनर्जी/विरोध बातचीत दवा इस्तेमाल किया एकाग्रता के स्वतंत्र है 6 , 7. हालांकि, Loewe मॉडल एक pairwise बातचीत परीक्षण के लिए भी प्रयोग महंगा है । दवा बातचीत परख परंपरागत रूप से दवा एकाग्रता संयोजन (एक चेकरबोर्ड परख) (चित्रा 2)के एक 2d मैट्रिक्स के शामिल हैं । अगर 5 खुराकों प्रत्येक दवा के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, तो 25 संयोजनों की आवश्यकता है, एक microplate के एक आधे के लिए इसी अगर प्रयोग दोहराने में आयोजित की जाती हैं । इस दृष्टिकोण की लागत बहु दवा संयोजन (चित्रा 3)के लिए Loewe additivity मॉडल द्वारा सिनर्जी माप पर प्रतिबंध लगाता है । उदाहरण के लिए, एक 10 तरह की बातचीत का परीक्षण करने के लिए, पारंपरिक तरीकों से अधिक १००,००० microplates की आवश्यकता होगी, कड़े, अच्छी तरह से theorized और एकाग्रता-स्वतंत्र Loewe additivity मॉडल द्वारा उच्च क्रम के तालमेल के प्रायोगिक माप को छोडक़र 8.

वर्तमान नैदानिक उपचार केवल संभव दवा संयोजन का एक अंश का उपयोग । उदाहरण के लिए, सक्रिय तपेदिक के मानक उपचार तीन एंटीबायोटिक दवाओं का एक संयोजन है । वहाँ लगभग 20 माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी) उपचार में इस्तेमाल एंटीबायोटिक दवाओं रहे हैं । वहां ११४० संभव 3 तरह संयोजन 20 दवाओं, एमटीबीके खिलाफ एक मजबूत तालमेल की क्षमता के साथ प्रत्येक के बीच कर रहे हैं । के रूप में वहां कोई कीमत प्रभावी विधि कई दवाओं के बीच दवा बातचीत को मापने के लिए किया गया है, संभावित जीवन रक्षक synergistic संयोजन untested रहते हैं ।

यहां, हम एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए pairwise और तीन तरह के एक चेकरबोर्ड परख (चित्रा 4 और चित्रा 5)के केवल विकर्ण नमूना द्वारा दवा बातचीत उपाय । एक चेकरबोर्ड प्रयोग के विकर्ण नमूना की अंतर्निहित अवधारणा १९७८9में अपने प्राथमिक काम में Berenbaum द्वारा theorized था । फिर भी, यह दृष्टिकोण ही हाल ही में दवा सिनर्जी स्क्रीन10,11,12पर लागू किया गया है । हम ई कोलाई (ई. कोलाई) और विकास phenotype के साथ हमारे प्रोटोकॉल उपस्थित । तथापि, हम ध्यान दें कि प्रोटोकॉल जैविक प्रजातियों और ब्याज की phenotype से स्वतंत्र है, और इसलिए अंय जैविक संदर्भों में उच्च आदेश दवा तालमेल की माप के लिए लागू किया जा सकता है ।

Protocol

नोट: किसी भी छोटे अणु कि रोकता ई. कोलाई बैक्टीरिया विकास विकर्ण विधि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, levofloxacin (लेव), nalidixic एसिड (NAL), और पेनिसिलिन जी (PNG) एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा, क्योंकि इन दवाओं एक प्रमुख तीन तरह का तालमेल दिखा । इस प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो आरेख 6के रूप में दिखाया गया है । कमरे के तापमान पर सभी कदम उठाने । बैक्टीरिया और दवाओं के ताजा aliquots प्रत्येक दिन का उपयोग करें । ई. कोलाईके लिए उपयुक्त सुरक्षा के स्तर के तहत प्रयोग करते हैं ।

1. तैयारी कदम

  1. आसुत जल और मिश्रण के 1 एल के लिए £ शोरबा के 25 जी जोड़कर Luria-Bertani (पौंड) मीडिया तैयार करते हैं । 15 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव और कमरे के तापमान पर autoclaved मीडिया की दुकान ।
  2. बाँझ ५०% ग्लिसरॉल और बैक्टीरियल कोशिकाओं के बराबर मात्रा में मिश्रण से ई. कोलाई ग्लिसरॉल स्टॉक्स तैयार करें६०० = 1 पौंड शोरबा और फ्रीज में १५० µ l aliquots में १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में-८० डिग्री सेल्सियस ।
  3. dimethyl sulfoxide (DMSO) प्रत्येक की 1 मिलीलीटर में एंटीबायोटिक्स, लेव, NAL और PNG के 20 मिलीग्राम भंग । पतला लेव हल 100x को ०.२ µ g/मब को मिलाकर 10 µ l म लेव हल के साथ ९९० µ l के DMSO. का प्रयोग करें ०.२ मिलीग्राम/एमएल लेव्, और 20 मिलीग्राम/एमएल NAL और PNG कार्यवाही चरणों में ।
  4. Aliquot ५० µ एल प्रत्येक एंटीबायोटिक के लिए १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों और फ्रीज पर-20 ° c ।
  5. लो-८० ° c से ई. कोलाई के १ १५० µ l aliquot. गल.
  6. एक 14 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूब में पौंड मीडिया के 5 मिलीलीटर में ई. कोलाई ग्लिसरॉल शेयर के १०० µ एल जोड़ें ।
  7. एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में ट्यूबों २०० rpm पर रात भर हिला ।

2. धारावाहिक कमजोर पड़ने खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोग

  1. -20 डिग्री सेल्सियस से ड्रग्स लेव, NAL और PNG के एक aliquot ले लो, उंहें कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए गल छोड़ दो और इन दवाओं के धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए तैयार ।
  2. पौंड मीडिया के ९९० µ एल और विलायक (DMSO) के ११० µ एल के मिश्रण से £ 10% सोल के ११०० µ एल तैयार करें ।
  3. के ५०० µ l को तैयार करके पौंड-10% लेव े को मिलाकर ४५० µ l का £ मीडिया और ५० µ l का लेव े ।
  4. भंवर पौंड-10% सोल के लिए सबसे अधिक सेटिंग में 5 एस । एक ९६-अच्छी तरह से microplate में कुओं के शीर्ष चार पंक्तियों के लिए पौंड-10% सोल के 20 µ एल जोड़ें ।
  5. भंवर पौंड-10% लेव के लिए उच्चतम सेटिंग में 5 एस । एक पंक्ति में पहली अच्छी तरह से £ 10% लेव के 20 µ एल जोड़ें
  6. पौंड के लिए दो गुना सीरियल कमजोर पड़ने तैयार-10% लेव पहले अच्छी तरह से 20 µ एल लेने से, दूसरी अच्छी तरह से जोड़ने, ऊपर और नीचे पांच बार pipetting । यह सभी कुओं के लिए क्रमिक रूप से 11 वीं अच्छी तरह से दोहराएं, जो ४० µ एल (चित्रा 7A) के साथ समाप्त होता है ।
  7. एक micropipette का उपयोग करके 11 अच्छी तरह से सामग्री के 20 µ l को निकालें और छोड़ें ।
  8. दोहराएँ कदम 2.3-2.7 ड्रग्स NAL और microplate, क्रमशः की दूसरी और तीसरी पंक्तियों का उपयोग कर PNG के लिए.
  9. दोहराएं चरण 2.3-2.7 ड्रग लेव के लिए एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में फिर से चौथी पंक्ति पर ।
  10. एक spectrophotometer का प्रयोग, संस्कृति के 1:10 कमजोर पड़ने के आयुध डिपो६०० उपाय (1.5-1.7 कदम) ।
  11. पौंड मीडिया के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पतला ०.०१ के एक आयुध डिपो६०० के लिए । एक जलाशय में डालो ।
  12. एक मल्टीचैनल micropipette का प्रयोग, ८० µ एल जोड़ें दवा धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए पतला कोशिकाओं के चरण 2.4-2.9 में तैयार । एक अच्छी तरह से अंतिम दवा सांद्रता चित्रा 7Aमें दिखाया गया है । वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्लेट सील ।
  13. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए थाली मशीन ।
  14. चरण 3 में उपयोग करने के लिए एक नया बैक्टीरियल कल्चर प्रारंभ करें (दोहराएं चरण 1.5-1.7) ।

3. रैखिक कमजोर पड़ने खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोग

  1. सीरियल कमजोर पड़ने खुराक के लिए आयुध डिपो६०० अवशोषित-चरण 2 से प्रतिक्रिया प्लेट एक प्लेट रीडर (चित्रा 7A सही) का उपयोग और निम्न चरणों के आधार पर परिणामों की व्याख्या.
  2. प्रत्येक पंक्ति के लिए कोई दवा नियंत्रण में वृद्धि के साथ एक अच्छी तरह से वृद्धि को विभाजित करके विकास को सामान्य और कोई दवा की हालत के लिए६००ओडी सामान्य करके प्रतिशत वृद्धि की गणना.
  3. प्रत्येक दवा के लिए, कि कुओं का पता लगाने ~ ५०% विकास निषेध (IC50), चित्र 7A सहीमें नारंगी में दिखाया गया है । प्रत्येक दवा के लिए "धारावाहिक IC50" के रूप में इन कुओं में एकाग्रता निरुपित ।
  4. गल ताजी दवा aliquots, पौंड मीडिया और विलायक (DMSO) एक 9:1 अनुपात में और पौंड मीडिया और दवा एक 9:1 अनुपात में, जहां दवा की एकाग्रता है 100x एक दवा के धारावाहिक IC50 का मिश्रण करके पौंड मीडिया को जोड़ने के द्वारा lb-10% सोल की 1 मिलीलीटर तैयार , के रूप में ३.३ कदम पर चुना है ।
  5. रैखिक मात्रा में ड्रग्स लेव, NAL और PNG 11 सांद्रता में, पौंड-10% दवा और पौंड-10% सोल में चित्रा 7Bमें दिखाया गया वॉल्यूम में मिश्रण से तैयार करें ।
  6. चौथी पंक्ति पर एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में लेव की रैखिकता बढ़ती खुराक तैयार करते हैं ।
  7. मापने६०० संस्कृति के 1:10 कमजोर पड़ने के आयुध डिपो २.१४ चरण में शुरू कर दिया ।
  8. पौंड मीडिया के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पतला ०.०१ के एक आयुध डिपो६०० के लिए । एक जलाशय में डालो ।
  9. एक मल्टीचैनल micropipette का उपयोग ३.६ चरण में तैयार दवा रैखिक कमजोर पड़ने के लिए पर पतला कोशिकाओं के ८० µ एल जोड़ें. एक अच्छी तरह से अंतिम दवा सांद्रता चित्रा 7Bमें दिखाया गया है ।
    नोट: मध्य अच्छी तरह से खुराक में-प्रतिक्रिया इस दवा के लिए धारावाहिक IC50 प्राप्त होगा. सील प्लेट वाष्पीकरण को रोकने के लिए ।
  10. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए थाली मशीन ।
  11. शुरू दो ताजा बैक्टीरियल संस्कृतियों चरण 4 में उपयोग करने के लिए (दोहराएं कदम 1.5-1.7) ।

4. कर्ण ड्रग इंटरेक्शन प्रयोग

  1. चरण 3 (चित्रा 7B) से प्रतिक्रिया-रैखिक कमजोर पड़ने खुराक के लिए आयुध डिपो६०० अवशोषक को मापने ।
  2. प्रत्येक दवा के लिए, IC50 में हुई एकाग्रता का चयन करें और 100x IC50 सांद्रता में ड्रग लेव, NAL और PNG तैयार करें ।
  3. गल ताजी दवाइयां, प्रत्येक दवा के लिए 100x IC50 तैयार करें और लेव + NAL, लेव + png और NAL + png और 1:1:1 औषध मिश्रण की मात्रा द्वारा 1:1 औषध मिश्रण तैयार कर लेव + NAL + png ।
  4. चित्र 8में दिखाए गए अनुसार दवा इंटरैक्शन प्रयोगों के लिए दो प्लेट तैयार करें.
  5. मापने६०० संस्कृतियों के 1:10 कमजोर पड़ने के आयुध डिपो ३.११ चरण में शुरू कर दिया ।
  6. तैयार आयुध डिपो६०० = ०.०१ पौंड मीडिया के २ १० मिलीलीटर में दो संस्कृतियों के कमजोर पड़ने ।
  7. 1 और 2, क्रमशः प्लेटों पर संस्कृति 1 और 2 से कोशिकाओं के ८० µ एल जोड़ें । प्लेटों को सील वाष्पीकरण को रोकने के लिए । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए प्लेटें मशीन ।

5. कर्ण ड्रग इंटरेक्शन स्कोर

  1. विकर्ण दवा बातचीत प्रयोग प्लेटों के लिए आयुध डिपो६०० अवशोषक चरण 4 से उपाय ।
  2. प्रत्येक पंक्ति के लिए अच्छी तरह से कोई दवा नियंत्रण में वृद्धि के साथ एक अच्छी तरह से वृद्धि में विभाजित करके विकास को सामान्य.
  3. प्रत्येक पंक्ति के लिए, स्तंभ है कि विकास के निकटतम IC50, चित्र 8 सही में नारंगी में दिखाया गया है पता लगाएँ । इस कुआं में दवा के सापेक्ष एकाग्रता के आधार पर IC50 निरुपित ।
  4. के लिए लेव + NAL, लेव + png और NAL + png और लेव + NAL + png खुराक-प्रतिक्रियाएं, प्रत्येक संयोजन में एकल दवाओं के IC50 औसत द्वारा अपेक्षित IC50 की गणना । ध्यान दें कि औसत सटीक अपेक्षित IC50 गणना के लिए एक सरल सन्निकटन के रूप में12से पहले वर्णित है ।
  5. प्रत्येक संयोजन में अपेक्षित IC50 द्वारा मनाया IC50 विभाजित करके आंशिक निरोधात्मक एकाग्रता (FIC) स्कोर की गणना.

Representative Results

पहले, हम तीन दवाओं के बीच pairwise बातचीत की सूचना दी है: लेव, NAL और PNG लघुकृत चेकरबोर्ड परख, में परीक्षण के आधार पर जहां दो दवाओं एक 4 x 4 मैट्रिक्स13,14में संयुक्त थे । जबकि NAL और लेव synergistic थे, PNG दोनों लेव और NAL13,14के साथ विरोधी होने की सूचना दी थी । यहां, हम इन pairwise बातचीत की पुष्टि की और इन तीन एक तिरछी परख का उपयोग दवाओं के बीच तीन तरह की बातचीत मापा । हमारे परिणाम प्रदर्शित करता है कि लेव + NAL + PNG एक synergistic 3 तरह एंटीबायोटिक संयोजन है । व्यक्तिगत प्रयोगात्मक प्रक्रिया वर्गों के परिणामों के लिए योजनाबद्ध अभ्यावेदन चित्रा 7 और चित्रा 8के दाईं ओर पर दिए गए थे. यहां, हम वर्तमान और तीन प्लेट रीडिंग, जो चित्र 9में दिए गए है से प्रतिनिधि कच्चे परिणामों की व्याख्या । शीर्ष प्लेट रीडिंग चरण 2 और 3 में आयोजित धारावाहिक और रैखिक कमजोर पड़ने वाले प्रयोगों से मेल खाती है । नीचे दो प्लेट रीडिंग चरण 4 में संचालित डुप्लिकेट संपर्क प्लेटें हैं ।

9 चित्रा में कच्चे डेटा से पता चलता है कि शीर्ष विकास ०.५५ के आसपास है, लेकिन वहां मीडिया ही एक ०.०५ ऑप्टिकल घनत्व है, के रूप में उच्च दवा सांद्रता के आयुध डिपो६०० में देखा जहां कोई वृद्धि नहीं है । इसलिए, हम IC50 के रूप में परिभाषित (0.55-0.05)/2 = ०.२५ । प्रत्येक खुराक के लिए-प्रतिक्रिया, इस मान के निकटतम स्थित कुओं नारंगी के साथ दिखाए जाते हैं ।

चित्रा 9A के ऊपरी आधे चरण 2, सीरियल खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोग से परिणाम से पता चलता है. लेव IC50 के लिए वेल्स दो में कॉलम 10 में है प्रतिकृति है, जो 4 के अनुरूप एनजी/ NAL और पीएनजी के लिए IC50 क्रमशः 3 µ g/ml और 25 µ g/ इन सांद्रता आंकड़ा 7Bमें दिखाया 1x एकाग्रता के अनुरूप है । चित्रा 9B के निचले आधे चरण 3, रैखिक खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोगों से परिणाम से पता चलता है. लेव, NAL और PNG के IC50 क्रमशः 0.4 x, 0.8 x और 1.2 x पर पाए जाते हैं । इन सांद्रता चरण 4 के लिए 1x IC50 के रूप में असाइन किए जाते हैं ।

दो के लिए इसी दो प्लेट दोहराने प्रयोगों चित्रा 9B, जहां IC50 कुओं नारंगी के साथ दिखाए जाते है में दिखाए जाते हैं । 1 प्लेट में, सभी एकल दवाओं 1x एकाग्रता पर अपने IC50 है । pairwise या तीन तरह के संयोजन के लिए अपेक्षित IC50 घटक दवाओं के अंकगणित माध्य द्वारा परिकलित किया जाता है, सभी युग्म भी 1x एकाग्रता के लिए अपेक्षित IC50 बनाने. 2 प्लेट में, लेव और PNG 1x एकाग्रता पर अपने IC50 है, लेकिन NAL IC50 1.2 x पर है । प्रत्येक संयोजन के लिए अपेक्षित IC50 इन IC50 मानों का अंकगणित साधन का उपयोग कर परिभाषित किया गया है । उदाहरण के लिए, लेव + NAL और NAL + PNG के लिए अपेक्षित IC50 1.1 x है । प्रत्येक संयोजन के लिए दवा इंटरेक्शन स्कोर (FIC) के रूप में प्लेटों के दाईं ओर दिखाया गया है, उम्मीद IC50 के साथ मनाया IC50 विभाजित करके गणना की है. दो प्लेटों के FIC स्कोर का निरीक्षण यह दर्शाता है कि लेव + NAL और लेव + NAL + png synergistic हैं, जबकि लेव + png और NAL + png विरोधी हैं । दो प्लेटों में प्राप्त FIC स्कोर समझौते में हैं, प्रोटोकॉल की विश्वसनीयता का समर्थन ।

Figure 1
चित्रा 1: Loewe additivity दवा बातचीत मॉडल के लिए नल मॉडल परिभाषा । एक microplate पर दो 5 x 5 मैट्रिक्स, जहां दवा एक रैखिक एक धुरी में वृद्धि हुई है के रूप में छोड़ दिया पर दिखाया गया है, और दवा के एक शीर्ष एकाग्रता रोकता है एक quantifiable phenotype (ऊपर सही) । इन मैट्रिक्स के अलावा बीच में दिखाया गया है, जहां equipotent दवा प्रत्येक एकल दवा में एक सांद्रता जोड़ने लाइनों एक ही एकाग्रता के रूप में दवा है. जब कोशिकाओं दवा एकाग्रता संयोजन के इस "चेकरबोर्ड" पर जोड़ रहे हैं, यह उम्मीद है कि इस लाइन पर दर्ज phenotype कुओं यह जोड़ता के लिए समकक्ष हो जाएगा. इस आत्म दवा बातचीत प्रयोग में, एक phenotype चित्रण isobole (एक डैश्ड ग्रीन लाइन के साथ दिखाया गया है) के लिए रैखिक होने की उंमीद है, additivity नल मॉडल को परिभाषित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Loewe additivity ड्रग इंटरेक्शन मॉडल के अनुसार Pairwise दवा बातचीत. जब दो दवाओं 1 चित्रामें के रूप में एक चेकरबोर्ड परख में संयुक्त कर रहे हैं, मनाया isophenotypic समोच्च सीधे हो सकता है, उत्तल या गुफा । सही में, संभव isophenotypic आकृति (हरी लाइनें धराशायी) चेकरबोर्ड परख पर आरोपित हैं । सीधे isophenotypic आकृति के साथ दवा संयोजन Loewe-additive रहे हैं, के रूप में आकृति एक आत्म आत्म दवा बातचीत है, जो Loewe परिभाषा से additive है से अलग नहीं हैं । जब isophenotypic समोच्च काफी गुफा या उत्तल है, संयोजन synergistic या विरोधी, क्रमशः है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: Loewe additivity ड्रग इंटरेक्शन मॉडल के अनुसार तीन तरह की दवा बातचीत. pairwise बातचीत के लिए चेकरबोर्ड परख के समान, तीन दवाओं एक 3 डी ग्रिड में संयुक्त कर रहे है (एक "checkercube"), जहां प्रत्येक दवा रैखिक एक धुरी में वृद्धि हुई है । यदि तीन दवाओं समान थे, isophenotypic सतह फ्लैट होने की उंमीद है, तीन दवा संयोजन के लिए additivity परिभाषित । सतह इस Loewe-additive नल मॉडल की तुलना में अधिक गुफा या उत्तल है, तो दवा संयोजन क्रमशः synergistic या विरोधी हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: विकर्ण विधि pairwise दवा बातचीत को मापने के लिए । प्रत्येक चेकरबोर्ड परख के लिए, केवल रानी आयतों में दिखाया क्षेत्रों मापा जाता है । मैं और द्वितीय रेखीय एकल दवा सांद्रता में वृद्धि कर रहे हैं । iii दो दवाओं का एक 1:1 मिश्रण बनाने और रैखिक titrating इस मिश्रण के रूप में अगर यह एक ही दवा थी द्वारा मूल्यांकन किया है । FIC दो एकल दवाओं की उंमीद IC50 द्वारा विभाजित संयोजन में मनाया IC50 के बराबर है । Loewe additivity मॉडल के लिए, अपेक्षित IC50 दो एकल दवाओं के औसत IC50 द्वारा अनुमानित है । FIC मान Loewe-additive जोड़ों के लिए 1 है और synergistic या विरोधी जोड़े के लिए 1 से कम या अधिक है, क्रमशः2,12. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: विकर्ण विधि तीन तरह की दवा बातचीत को मापने के लिए । प्रत्येक checkercube परख के लिए, केवल दिखाया क्षेत्रों मापा जाता है । मैं, द्वितीय और तृतीय रेखीय एकल दवा सांद्रता में वृद्धि कर रहे हैं । iv तीन औषधों का 1:1:1 मिश्रण बनाकर मापा जाता है और रेखीय रूप से इस मिश्रण को titrating के रूप में यदि यह एक औषधि थी. आंशिक निरोधात्मक एकाग्रता मनाया आईसी५० अपेक्षित IC50 द्वारा विभाजित संयोजन में तीन एकल दवाओं के बराबर है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6: विकर्ण विधि प्रोटोकॉल के लिए कार्यप्रवाह यहां वर्णित है और प्रत्येक microplate के लिए सेटअप विवरण । 4 दिन में दिखाई थाली डुप्लिकेट में आयोजित किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: धारावाहिक और रैखिक कमजोर पड़ने खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोगों । (क) धारावाहिक कमजोर पड़ने खुराक की तैयारी-एक दवा और इसी अंतिम दवा सांद्रता के लिए प्रतिक्रिया. ई. कोलाई कोशिकाओं थाली में जोड़ रहे हैं; विकास के बाद दर्ज किया गया है 16 ज. धारावाहिक IC50, ऑरेंज में दिखाया गया है, के लिए प्रत्येक दवा के लिए चयनित है निम्नलिखित दिन रैखिक कमजोर पड़ने खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोगों में उपयोग. (ख) रैखिक कमजोर पड़ने खुराक की तैयारी-एक दवा और इसी अंतिम दवा सांद्रता के लिए प्रतिक्रिया. ई. कोलाई कोशिकाओं थाली में जोड़ रहे हैं; 16 ज के बाद विकास दर्ज है । प्रत्येक दवा के लिए, चयनित IC50s है कि अगले दिन दवा बातचीत प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाएगा नारंगी में दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: दवा बातचीत प्रयोगों. बातचीत प्रयोगों की तैयारी एकल दवा रैखिक खुराक के समान है-प्रतिक्रियाओं, सिवाय इसके कि एक 1:1 या 1:1:1 दवाओं का मिश्रण दो या तीन दवा खुराक के लिए इस्तेमाल किया जाता है-प्रतिक्रियाओं, क्रमशः. प्रत्येक खुराक के लिए मनाया IC50s-प्रतिक्रिया, नारंगी में चित्रित, FIC स्कोर की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9: प्रतिनिधि प्रयोग परिणाम । वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम मुख्य पाठ में दिए गए विवरणों के साथ दिखाए जाते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

रोगज़नक़ों या ट्यूमर के खिलाफ दवा संयोजनों का उपयोग एक आकर्षक संभावना है, विशेष रूप से सुखाने एंटीबायोटिक पाइप लाइन की परिस्थितियों में । हालांकि, इस क्षमता को कम दो कठिनाइयों से प्रभावित है । पहली कठिनाई संभव संयोजनों की खगोलीय संख्या है । वहां रहे हैं, उदाहरण के लिए, १०० एंटीबायोटिक दवाओं के बीच ४९५० संभव pairwise संयोजन । १०० एंटीबायोटिक (2१००) के बीच सभी संभव संयोजन पृथ्वी पर बैक्टीरिया की संख्या के साथ परिमाण के एक ही आदेश पर है (~ 1030) । कैसे इन संभावनाओं के बीच दृढ़ता से synergistic संयोजन की भविष्यवाणी करने के लिए कई गणना अध्ययन का विषय रहा है । दूसरी कठिनाई उच्च आदेश दवा बातचीत का माप है । विचार है कि एक गणना मंच का सुझाव है कि एक निश्चित 10 दवा संयोजन दृढ़ता से एक निश्चित रोगज़नक़ के खिलाफ synergistic है हो सकता है । दवा बातचीत का परीक्षण करने के लिए परंपरागत तरीकों को सत्यापित करना या इस परिकल्पना का खंडन करना भी महँगा पड़ता है, इसलिए कई दवाओं के बीच तालमेल का अध्ययन वैज्ञानिक जाँच की सीमाओं से बाहर रहा है. विकर्ण विधि है, जो पहले लगभग 30 साल पहले का प्रस्ताव किया गया था और कुछ हाल ही में तालमेल स्क्रीन में इस्तेमाल पहली समस्या के लिए एक मजबूत आधार प्रदान करते हैं, कई जोड़े के बीच बातचीत के परीक्षण की अनुमति देकर । यह पारंपरिक परख के एक जानकारीपूर्ण नमूना द्वारा दूसरी समस्या हल करती है और उच्च आदेश दवा बातचीत के अध्ययन की अनुमति देता है ।

हम महत्वपूर्ण बात ध्यान दें कि हमारे प्रोटोकॉल दवा बातचीत माप के लिए एक रैखिक खुराक का उपयोग करता है, भी कमजोर बातचीत का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता प्रदान करने के लिए. रैखिक खुराक के लिए सही एकाग्रता रेंज की स्थापना एक चुनौतीपूर्ण काम है । पहले एक धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करके, हम रैखिक खुराक के लिए खोज अंतरिक्ष के बारे में एक सूचित निर्णय करते हैं । हालांकि, प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए संशोधित किया जा सकता 2-गुना या उच्चतर सीरियल कमजोर पड़ने दवा बातचीत परीक्षण के लिए. इस तरह के एक संशोधन प्रयोग समय को कम करने और अधिक बातचीत के परीक्षण की अनुमति होगी; हालांकि, यह केवल दृढ़ता से synergistic या विरोधी बातचीत का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता होगी ।

प्रोटोकॉल हम वर्णित pairwise या तीन तरह की बातचीत का माप दिखाता है । प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि एकल एजेंट संयोजन के रूप में एक ही थाली पर हैं, थाली विविधताओं के कारण पूर्वाग्रह को कम करने के लिए । इसलिए, प्रोटोकॉल को बातचीत के उपाय करने के लिए समायोजित किया जा सकता 7-तुच्छ संशोधनों द्वारा तरह संयोजनों । 7 से अधिक दवाओं के संयोजन की आवश्यकता होगी अधिक से अधिक १ ९६-अच्छी तरह से microplate और अतिरिक्त विचार सही डेटा एकीकरण सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए, जैसे इंटर प्लेट प्रतिकृति.

विकर्ण विधि की एक उल्लेखनीय सीमा प्रतिबंध है कि परख में प्रत्येक दवा ब्याज की phenotype को बाधित करना चाहिए है । इसलिए, विकर्ण विधि सक्रिय एजेंटों और निष्क्रिय adjuvants के बीच बातचीत को समझने के लिए उपयोगी नहीं है । इस तरह के ' potentiating ' बातचीत आनंद या उच्चतम एकल एजेंट मॉडल के रूप में वैकल्पिक मॉडल के तहत अध्ययन किया जा सकता है ।

उच्च आदेश दवा बातचीत के विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण विचार के लिए नल मॉडल पसंद है "अपेक्षित IC50." जब दो दवाओं संयुक्त कर रहे हैं, संयोजन के प्रभाव केवल एक दवा प्रभाव की तुलना में किया जा सकता है । जब तीन दवाओं संयुक्त कर रहे हैं, संयोजन प्रभाव एकल प्रभाव या pairwise प्रभाव की तुलना में किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, यदि तीन औषधियों के सभी pairwise युग्म synergistic हैं, तो आशा की जा सकती है कि इन औषधियों में तीन तरह का तालमेल दिखाई देगा. क्या pairwise बातचीत से उंमीद है कि तीन तरह से है बातचीत विचलन हाल ही में डब किया गया है "आपात बातचीत"16,17। सादगी के लिए, हमारे प्रोटोकॉल तीन तरह संयोजन की "नेट बातचीत," जो एकल दवा प्रभाव के रूप में नल मॉडल को परिभाषित करता है की माप का वर्णन । हालांकि, डेटा प्रोटोकॉल से प्राप्त की है कि तीन तरह के संयोजन के आकस्मिक बातचीत की गणना करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है । हमारे विश्लेषण में, हम तीन तरह के संयोजन की उंमीद IC50 एकल दवा IC50s के औसत के रूप में परिभाषित किया । वैकल्पिक रूप से, अपेक्षित IC50 pairwise संयोजनों (~ 1.1-1.2) के IC50s के औसत के रूप में परिभाषित किया जा सकता है । जब मनाया IC50 इस विकल्प की उंमीद IC50 द्वारा विभाजित है, प्राप्त FIC तीन तरह के संयोजन के लिए आपात FIC प्रदान करता है, के रूप में पहले12वर्णित है । इस विचार से पता चलता है कि लेव + NAL + png क्या तीन दवाओं के बीच pairwise बातचीत से उंमीद की जाएगी से अधिक synergistic है, का प्रदर्शन है कि लेव + NAL + png आपात तालमेल है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम NIGMS ग्रांट P50GM107618 द्वारा वित्त पोषित किया गया । लेखकों ने पांडुलिपि पर व्यावहारिक टिप्पणियों और सुझावों के लिए सोहर बी Weinstein का शुक्रिया अदा किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Semi Micro Cuvette  VWR 97000-586
1.5 mL  Eppendorf Microcentrifuge Tubes USA Scientific 4036-3204
1000 µL Tips Geneseesci 24830
14 mL Breathable Cell Culture Tube VWR 60819-761
20 µL Tips Geneseesci 24804
200 µL Tips Geneseesci 24815
37 °C Incubator Panasonic MIR-262-PA
37 °C Shaker Incubator Thermo Scientific SHKE8000
5 mL Cell Culture Serological Pipette VWR 53300-421
96-well Microplates VWR 15705-066
Breathable Sealing Film USA Scientific 2920-0010
DMSO Sigma 41647
Escherichia coli ATCC 700926
Glycerol Sigma G9012
LB Broth Powder RPI L24065
Levofloxacin Sigma 28266
Micropipette GILSON PIPETMAN Classic
Microplate reader BioTek Synergy H1
Multichannel micropipette VistaLab 1060
Nalidixic acid Sigma N8878
Penicillin G Sigma P3032
Pipette Pump Drummond  4-000-501
Reagent Reservoir VWR 89094-658
Spectrophotometer BIO-RAD 1702525
Vortex Mixer Fisher Scientific 10-320-807

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts. Drug Discovery Today. 12, (1), 34-42 (2007).
  2. Berenbaum, M. C. What is synergy? Pharmacological Reviews. 41, (2), 93-141 (1989).
  3. Cokol, M. Drugs and their interactions. Current Drug Discovery Technologies. 10, (2), 106-113 (2013).
  4. Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance. Nature Reviews Microbiology. 7, (6), 460-466 (2009).
  5. Lehár, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. High-order combination effects and biological robustness. Molecular Systems Biology. 4, (1), 215 (2008).
  6. Loewe, S. The problem of synergism and antagonism of combined drugs. Arzneimittelforschung. 3, (6), 285-290 (1953).
  7. Foucquier, J., Guedj, M. Analysis of drug combinations: current methodological landscape. Pharmacology Research & Perspectives. 3, (3), (2015).
  8. Wood, K. B. Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, (37), 10231-10233 (2016).
  9. Berenbaum, M. C. A method for testing for synergy with any number of agents. Journal of Infectious Diseases. 137, (2), 122-130 (1978).
  10. Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis. Scientific Reports. 7, 42644 (2017).
  11. Horn, T., et al. High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells. Cancer Research. 76, (23), 6950-6963 (2016).
  12. Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis. Science Advances. 3, (10), e1701881 (2017).
  13. Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Molecular Systems Biology. 12, (5), 872 (2016).
  14. Mason, D. J., et al. Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure. Journal of Medicinal Chemistry. 60, (9), 3902-3912 (2017).
  15. Yilancioglu, K., et al. Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity. Journal of Chemical Information and Modeling. 54, (8), 2286-2293 (2014).
  16. Beppler, C., et al. Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors. Journal of the Royal Society Interface. 13, (125), 20160800 (2016).
  17. Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs. Journal of The Royal Society Interface. 13, (119), 20160332 (2016).
विकर्ण विधि दवाओं के किसी भी संख्या के बीच तालमेल को मापने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cokol-Cakmak, M., Bakan, F., Cetiner, S., Cokol, M. Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs. J. Vis. Exp. (136), e57713, doi:10.3791/57713 (2018).More

Cokol-Cakmak, M., Bakan, F., Cetiner, S., Cokol, M. Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs. J. Vis. Exp. (136), e57713, doi:10.3791/57713 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter