Summary
Dit protocol beschrijft de opname van het lokale veld potentieel met multi schacht lineaire silicon sondes. Conversie van de signalen met behulp van de huidige Bronanalyse dichtheid kan de wederopbouw van lokale elektrische activiteit in de hippocampus muis. Met deze techniek, kunnen ruimtelijk beperkte hersenen oscillaties in vrij bewegende muizen bestudeerd worden.
Abstract
Het lokale veld potentieel (LFP) blijkt uit ion bewegingen over neurale membranen. Aangezien de spanning opgenomen door LFP elektroden de opgeteld elektrisch veld van een groot volume van hersenweefsel weerspiegelt, is extraheren van informatie over lokale activiteit uitdagend. Bestuderen van neuronale micro schakelingen, vereist echter een betrouwbaar onderscheid tussen echt lokale evenementen en volume-uitgevoerd signalen van oorsprong uit verre hersengebieden. Huidige Bronanalyse dichtheid (CSD) biedt een oplossing voor dit probleem door het verstrekken van informatie over huidige wastafels en bronnen in de nabijheid van de elektroden. In de hersengebieden met laminaire cytoarchitecture zoals de hippocampus, kan eendimensionale CSD worden verkregen door de schatten van de tweede ruimtelijke afgeleide van de LFP. Hier beschrijven we een methode om record multilaminar LFPs met behulp van lineaire silicon sondes de dorsale hippocampus ingeplant. CSD sporen worden berekend langs individuele shanks van de sonde. Dit protocol beschrijft dus een procedure om het oplossen van ruimtelijk beperkte neuronale netwerk schommelingen in de hippocampus vrij verplaatsen van muizen.
Introduction
Trillingen in de LFP zijn kritisch betrokken bij informatieverwerking door neuronale circuits. Zij bestrijken een breed spectrum van frequenties, variërend van langzame golven (~ 1 Hz) tot snelle rimpel oscillaties (~ 200 Hz)1. Verschillende frequentiebanden worden geassocieerd met cognitieve functies, zoals geheugen, emotionele verwerking en navigatie2,3,4,5,6,7. Stroom over neuronale membranen vormt het grootste deel van de LFP signaal8. Caties invoeren van de cel (bijvoorbeeld via activatie van glutamaterge excitatory synapsen) vertegenwoordigen een actieve huidige wastafel (zoals gratis het extracellulaire medium verlaat). Netto stroom van positieve lading naar de extracellulaire medium, bijvoorbeeld door activering van GABAergic inhiberende synapsen, toont daarentegen een actieve stroombron op die locatie. In neuronale dipolen, zijn huidige putten gekoppeld met passieve bronnen en vice versa toe te schrijven aan de schadeloosstelling van de stromingen beïnvloeden membraan tenlastelegging op verre locaties.
Het elektrische veld geproduceerd door externe neurale processen kan ook leiden tot grote spanning verlegging op een opname-elektrode en aldus ten onrechte kan worden beschouwd als een lokaal evenement. Dit volume geleiding vormt een serieuze uitdaging voor de interpretatie van de LFP signalen. CSD analyse geeft informatie over lokale huidige wastafels en bronnen onderliggend LFP signalen en bestaat dus uit een middel om de impact van volume geleiding8te verminderen. In gelaagde structuren zoals de hippocampus, kunnen eendimensionale CSD signalen worden verkregen door de tweede ruimtelijke afgeleide van de LFP geregistreerd vanaf equidistante elektroden gerangschikt loodrecht naar de laminaire vliegtuigen9. De komst van verkrijgbare lineaire silicon sondes hebben onderzoekers gebruik maken van de CSD-methode voor de studie van lokale trilling activiteit in de hippocampus. Bijvoorbeeld, is gebleken dat verschillende gamma oscillaties naar voren in een laag-specifieke wijze in de CA1 gebied10 komt. Bovendien heeft CSD analyse onafhankelijke hot spots van gamma activiteit in de belangrijkste cellaag van de getand gyrus11vastgesteld. Deze bevindingen werden nog belangrijker is, alleen herkenbaar in lokale CSD maar niet in LFP signalen. CSD analyse biedt dus een krachtig hulpmiddel om inzicht in de activiteiten van de microcircuit van de hippocampus te krijgen.
In dit protocol bieden wij een uitgebreide gids voor eendimensionale CSD signalen met silicium sondes. Deze methoden kunnen gebruikers gelokaliseerde trilling gebeurtenissen in de hippocampus van gedragend muizen onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden waarbij levende dieren zijn goedgekeurd door het Regierungspräsidium Freiburg overeenkomstig de German Animal Welfare Act.
1. voorbereiding
- Ontwerpen en bouwen van een instrument van de passende invoeging Transient de silicium-sonde en de elektrode-connector uitvoering tijdens het proces van de innesteling. Zie afbeelding 1 voor een voorbeeld van aangepaste gebouwde invoeging tool.
- Zorgvuldig laat de silicon sonde en elektrode connector van de verpakking met behulp van keramiek-tipped pincet.
- Til de verbindingslijn bestuur en veilig repareren met een krokodil klem gekoppeld aan een stand.
- Met behulp van een stereoscoop, afgestemd op de sonde met de invoegpositie gereedschap keramiek-tipped pincet. Het toepassen van een ~ 2 mm laag van paraffine gesmolten met een cauterizer te lijmen van de sonde naar de invoegpositie tool. Wees voorzichtig niet te raken van de sonde Schenkels tijdens deze procedure.
- Vaststellen van de elektrode-connector aan de schacht van de tool van de invoegpositie met behulp van standaard plakband. Merk op dat afhankelijk van de fabrikant, draden moet mogelijk worden vastgesoldeerd aan de aansluiting van het bestuur van de elektrode vóór. Verwijder de isolatie uit twee korte stukken van vernis-geïsoleerde koperdraad met behulp van tin-soldeer toegepast met een soldeerbout (400 ° C). Soldeer de draden aan de juiste sleuven in de elektrode connector bestuur.
- Verwijder de isolatie van twee extra stukken van koperdraad. Wikkel elke kale koperdraad driemaal rond een RVS schroef (1 mm diameter, 2 mm-lengte). Toepassing van flux geschikt voor het solderen van staal en soldeer de koperen draad aan de onderkant van de schroefdop. Zorg ervoor dat de onderste helft van de schroefdraad blijft vrij van tin-soldeer.
- Gebruik een standaard multimeter om elektrisch contact tussen draad en schroef te controleren.
- Desinfecteren van de schenkels van de silicium-sonde en de grond schroeven door onderdompeling in 70% ethanol (10 s).
- Een beschermhoes voorbereiden door de sonde implantaat door het hoofd van een plastic pipet van Pasteur doormidden snijden.
2. implantatie chirurgie
- Steriliseren chirurgische instrumenten (boete-tipped pincet, schaar, chirurgische klemmen) met een sterilisator hete kraal. Veeg alle oppervlakken met 70% ethanol.
- Induceren anesthesie met 3% Isofluraan in zuurstof afgeleverd op ~ 1 L/min.
- Voor onderhoud, gebruikt u 1-1,5% Isofluraan. Merk op dat de concentratie van de Isofluraan vereist om chirurgische tolerantie van dier op dier variëren kan.
- Stabiele chirurgische tolerantie wordt bereikt wanneer het dier niet reageert op de teen-knijpen. Het ademhalingstarief van de muis controleren en aanpassen van de concentratie van Isofluraan indien nodig.
- Zalf toepassen door de ogen van het dier te voorkomen uitdroogt.
- Monteer de muis in een stereotaxic frame oor bars voorzichtig in de gehoorgang invoegt. Zodra het hoofd van de muis wordt gestabiliseerd door de tralies oor, plaatst u een mondstuk op de snuit voor continue Isofluraan levering. Plaatst u de muisaanwijzer op de handdoek of pad op een verwarming pad en buprenorfine subcutaan injecteren (0.05 - 0.1 mg/kg lichaamsgewicht) om postoperatieve analgesie.
- Scheren van het hoofd met een standaard scheerapparaat en desinfecteren van de huid met 70% ethanol. Met behulp van chirurgische scharen, maken van een incisie in de huid langs de middellijn van de schedel en open de huid met behulp van chirurgische klemmen.
- Hiermee lijnt u de kop van het dier met de hulp van een stereotaxic uitlijning tool om niveau bregma en lambda. Er moet minder dan 50 µm van hoogte verschuiving tussen bregma en lambda. Bovendien gedefinieerd niveau het hoofd langs de as van de mediolateral door het meten van de diepte van bregma op de schedel oppervlakte op afstanden links en rechts (bijvoorbeeld 1 mm links en rechts van de bregma). Pas de kantelen van het hoofd indien nodig.
- Schoon het hoofd met 3% waterstofperoxide en veeg droog met steriele katoen doekjes.
- Bepaal de locatie van de craniotomy ten opzichte van bregma met behulp van een geschikte stereotaxic atlas12.
- Met behulp van een 0,9 mm boorkop, boorgaten twee schroef in het been over het cerebellum te plaatsen van de grond en verwijzing schroeven. Bovendien, zijn 1-3 gaten voor verankering schroeven wenselijk om het implantaat te stabiliseren. De locatie van anker schroeven zal afhangen van de locatie van de craniotomy. Voor implantatie in de hippocampus, plaatst u anker schroeven op de contralaterale pariëtale en ipsilaterale frontale cortex. Plaats de schroeven in het bot met behulp van een geschikte schroevendraaier. Wees voorzichtig niet te doordringen in de hersenen.
- Uitvoeren van de craniotomy door langzaam het uitdunnen van de schedel met de boor in een rechthoekig gebied rond de innesteling kant. Vaak Bevochtig de bone met gesteriliseerde fosfaatbuffer (PB). De resterende verdunde schedel kan voorzichtig worden doorboord en verwijderd met behulp van een fijne (27G) injectie naald en een paar pincet.
- Zorgvuldig de dura mater te doorboren met een dunne (27G) injectie naald. Vormen een kleine haak door het buigen van de punt van de naald met een pincet en trek de dura voor verwijdering. Toepassing PB om te voorkomen dat de hersenen oppervlak uitdrogen.
- Monteren van de elektrode inbrengen tool op de houder van een stereotaxic, nul van de sonde op bregma en beweeg de sonde naar de coördinaten van de stereotaxic over de craniotomy. Penetreren langzaam de hersenen oppervlak. Zorg ervoor dat de sonde schachten niet knikken. Voorkomen implanteren via bloedvaten.
- Langzaam lager de sonde tot ~ 200 µm boven de gewenste diepte. Dekking van de craniotomy en de schenkels van de sonde van de silicium met gesteriliseerde Vaseline voor bescherming. Toepassing tandheelkundige cement om op te lossen van de basis van de sonde naar de verankerende schroef in de schedel.
- Direct na toepassing van cement, de sonde langzaam naar de doeldiepte verplaatsen. Het bevorderen van de laatst ~ 200 µm na toepassing van het cement vermindert de zijdelingse beweging van de sonde en zorgt voor een minimale weefselschade in het doelgebied. Bedenk dat de uithardingstijd van het cement gebruikt deze stap van het protocol kan beïnvloeden. Met snel uithardend cement, weglaten deze stap en direct de sonde naar de doeldiepte implantaat om te voorkomen dat schade aan de silicium-sonde.
- Nadat de cement is uitgehard, laat de sonde van de invoegpositie tool door het smelten van de was met een cauterizer.
- Vrijgeven van het bestuur van de aansluiting van het apparaat van de invoegpositie en plaats deze op een geschikte plaats op de schedel met behulp van een krokodil klem gekoppeld aan het handvat van de invoegpositie. In het geval van de implantatie van de sonde in de hippocampus, het bestuur van de connector op het contralaterale pariëtale bot te plaatsen. Het bestuur van de connector op de schedel met tandheelkundige cement vast te stellen.
- Soldeer de draden van het grond- en referentie van het bestuur van de verbindingslijn aan de draden aangesloten op de twee schroeven over het cerebellum.
- Trim de beschermhoes naar de juiste hoogte en plaats deze over de silicium-sonde. Bevestig de cover aan de verbindingslijn bestuur en schedel met tandheelkundige cement, het vermijden van de huid rond de blootgestelde schedel. Wordt de huid rond de implantatie-site is meestal niet vereist.
3. herstel na de operatie
- Toepassing van passende pijnstillende behandeling gedurende ten minste 2 dagen (bijvoorbeeld subcutane injecties van buprenorfine elke 6 uur overdag en in het drinkwater 's nachts gecombineerd met carprofen (4-5 mg/kg lichaamsgewicht) subcutaan elke 24 h). Single-behuizing wordt aanbevolen ter voorkoming van schade aan het implantaat.
- Toestaan ten minste een week voor herstel. Overleg met lokale dierenwelzijn richtsnoeren.
4. data-acquisitie
- Record LFPs vrij bewegen muizen met behulp van een geschikte data-acquisitiesysteem verbonden door middel van een commutator. Gebruiken om te krijgen LFPs, een sampling-frequentie van 1-5 kHz. Hogere samplingfrequenties (20-30 kHz) zijn vereist als single-eenheid lozingen daarvan samen met de LFP worden geregistreerd.
- Het opslaan van opnamebestanden van de raw van de afzonderlijke kanalen voor off line analyse.
5. histologie
- Na voltooiing van de opname, anesthetize diep het dier (bv 2 g/kg lichaam gewicht urethaan geïnjecteerd intraperitoneally). Bevestig de verdoving staat door gebrek aan respons tot teen knijpen.
- Perfuse de transcardially van de muis met ijskoude-fosfaatgebufferde zoutoplossing (~ 1 min) gevolgd door 4% paraformaldehyde (~ 10 min) met behulp van standaard intracardial perfusie methoden13. Voordat perfusie, misschien elektrolytische lesioning van de opname-sites door uitgevoerd (bijvoorbeeld door het toepassen van 10-20 V van constante spanning voor maximaal 1 s). Als alternatief, fluorescente kleurstoffen toegepast op de schacht tips voordat implantatie kan worden gebruikt voor het bijhouden van identificatie. Testen van de verschillende methoden voor de identificatie van de elektrode posities om optimale resultaten te verkrijgen met verschillende soorten silicium sondes wordt aanbevolen.
- Knip hersenen secties (~ 100 µm) en vlekken van de plakjes met 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1 µg/mL) gevolgd door drie wassen stappen in PB (elke 10 min bij kamertemperatuur).
- Plaats van de secties op een microscoopglaasje, een druppel medium te embedding toepassen en dekking van de sectie met een cover slip. Laat het 's nachts insluiten middellange droog, bij kamertemperatuur.
- Gebruik een epifluorescence of confocale laser scanning microscoop om vast te stellen de locatie van de sites van de opname.
- Om het repareren van de silicium-sonde voor verder gebruik, houd de sonde met een krokodil klem en laat de sonde van de scull door zorgvuldig smelten de tandheelkundige cement met een soldeerbout (400 ° C). Wees voorzichtig niet te raken van de sonde Schenkels tijdens deze procedure!
- Wassen van de sonde in hete gedestilleerd water (~ 80 ° C, 15 min) gevolgd door enzymatische oplossing (1% Tergazyme in gedistilleerd water, 30 minuten bij kamertemperatuur) en een andere wassen stap in gedistilleerd water (15 min). Merk op dat het succestarief van sonde herstel laag is.
6. CSD analyse
- Met behulp van een geschikte analyse omgeving (bijvoorbeeld Python) converteren LFP gegevens van een individuele Schenkel aan CSD door onderlinge aanpassing van de tweede ruimtelijke afgeleide langs de schacht als
LFPn, t is de LFP-signaal op de electrodeth nop tijdstip t waarbij Δz is de afstand tussen elektrode. Merk op dat als gevolg van de n-1 en n+ 1 acties, de CSD van de elektroden van de eerste en de laatste van de schacht kan niet worden geschat, die genomen moet worden overwogen tijdens de plaatsing van de sonde. De formule van de onderlinge aanpassing met behulp van een korte segment van code die de CSD-signaal voor elke elektrode berekent terwijl doorlopen na verloop van tijd (Zie aanvullende codebestand) implementeren. - Het verkregen CSD signaal voor verdere analyse (bijvoorbeeld, het bestuderen van specifieke frequentiebanden van hersenen oscillaties door band pass filters toe te passen) gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 illustreert de invoeging-instrument dat wordt gebruikt voor de inplanting van silicium sondes. Opnames van chronisch geïmplanteerde silicium probes gericht op de CA1-gebied en de submodule cellaag van de getand gyrus zijn afgebeeld in Figuur 2. We LFPs van de sonde Schenkels opgenomen tijdens vrije verkeer in de homecage. Om te minimaliseren van het effect van volume geleiding, werden de verkregen signalen omgebouwd tot CSD langs elke schacht van de sonde (figuur 2BD). In het eerste voorbeeld in figuur 2B, een enkele sharp-Golf ripple gebeurtenis leidt tot een prominente huidige wastafel in stratum radiatum van CA1. In het tweede voorbeeld weergegeven in figuur 2C-E, geregistreerd we vanaf twee verschillende locaties in de submodule cellaag van de getand gyrus (zijdelingse afstand 400 µm). De hoge-gamma-band werd geïsoleerd door een 60-80 Hz bandfilter filter toepassen op de CSD-signaal, onthullen de lokale gamma uitbarstingen op één van de twee sites van de opname in de submodule cellaag (figuur 2D; rode opname site) gelegen. Merk op dat de lokale gamma trilling activiteit kan alleen worden gedetecteerd na conversie van de opgenomen signalen naar CSD (figuur 2D, rechts). Figuur 2E toont afzonderlijke perioden van de dezelfde opname, tijdens die gamma oscillaties op beide sites opnemen in hun fase (figuur 2E, links) of amplitude (figuur 2E, Midden verschillen). De meest rechtse voorbeeld verschijnt een tijdperk van gesynchroniseerde gamma activiteit op beide sites opnemen. Deze voorbeelden illustreren dat CSD analyse geschikt is voor het isoleren van de lokale activiteiten niet alleen in de dimensie van de analyse, maar ook in loodrechte richtingen. Ter verdere illustratie van dit centraal concept, gemodelleerd we een experiment met een silicium sonde bestaande uit twee shanks (I en II) met vijf opname sites, elk analoog aan de resultaten afgebeeld in Figuur 2. In ons model, is de sonde geïmplanteerd in de getand gyrus met een trilling van de lokale gamma opkomende in de submodule cellaag naast opname site 4 van schacht I (Figuur 3). Ervan uitgaande dat homogene volume geleiding in het weefsel, zal de lokale trilling worden opgenomen in de LFP op alle andere sites voor opname in een amplitude-gefilterd versie (Figuur 3 c). Uitvoeren van analyses van de CSD langs beide shanks isoleert echter duidelijk de locus van gamma generatie (figuur 3D). Bovendien, hoe kleiner de afstand tussen opname sites op dezelfde Schenkel, hoe kleiner de Overspraak tussen CSD signalen op naburige shanks (figuur 3EF).
Figuur 1: afbeelding van het hulpprogramma invoeging. De sonde silicium is gekoppeld aan een insect pins gelijmd aan de basis van een krokodil klem. De schacht van de houder kan worden ingevoegd in een stereotaxic micro manipulator voor innesteling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: representatieve resultaten van CSD analyse van in de hippocampus. A: een elektrodenserie, bestaande uit een vier-Schenkel silicium-sonde (schacht afstand 400 µm, elektrode afstand 100 µm, 8 elektroden/schacht) werd ingeplant in het gebied cornu ammonis 1 (CA1). Shanks-A-C traverse stratum oriens (o), stratum pyramidale (p) en stratum radiatum (r). HF: hippocampal horizontalis. DG: getand gyrus. B: LFP (zwarte sporen) en CSD (vergelijkende) van de drie Schenkels in CA1 tijdens een tijdperk van de 200 ms met een spontane sharp-Golf rimpel gebeurtenis. Opmerking de prominente huidige gootsteen in stratum radiatum. LFP schaal bar: 2 mV. C: voorbeeld van een sonde van de silicon opnemen van de DG. Shanks A en B doordringen de DG. CA3: cornu ammonis gebied 3. Elektrolytische laesies werden uitgevoerd na de opname op het etiket van de elektrode tracks. D: tekening van de elektrode Schenkels ten opzichte van de hippocampal anatomie. LFP opname uit twee ruimtelijk gescheiden sites in de submodule cellaag (rood en blauw site opnemen) suggereert dat gamma oscillaties (60-80 Hz) worden gesynchroniseerd tussen beide sites (links). Echter, CSD signalen van de dezelfde tijdsinterval onthullen een focale gamma 'hot spot' beperkt tot de rode opname site (rechts). CSD signalen van beide sites van de opname worden op dezelfde schaal getekend. E: CSD maar niet LFP signalen identificeren perioden van fase (links) en de amplitude asynchrony (midden) tussen beide sites opnemen. Het tijdperk aan de rechterkant ziet u een korte tijdperk van gesynchroniseerde gamma activiteit. Sporen op de bodem illustreren fase verschil (Δ-fase in radialen) en de amplitude verschil index (Ampl.-index, gedefinieerd als de amplitude-verschil tussen beide locaties van de opname gedeeld door de som van de amplitudes op elk punt van de tijd met een bereik van -1 tot 1) voor LFP (grijs) en CSD zwarte () sporen. Alle drie de voorbeelden zijn 30 ms lang en heeft plaatsgevonden binnen 400 ms. panelen C en D worden aangepast van Strüber et al. 201711 onder Creative Commons (https://creativecommons.org/Licenses/by/4.0/). CSD signalen van beide sites opname worden getekend op dezelfde schaal in elke afzonderlijke deelvenster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Model experiment met gesimuleerde focal 40 Hz trilling in de getand gyrus submodule cellaag. A: een model silicon sonde met twee shanks op een afstand van Dschacht = 400 µm en vijf opname sites gelegen op afstanden van Delektrode = 100 µm wordt geplaatst in het getand gyrus. B: naast opname site 4 van schacht ik, een focale 40 Hz trilling is gesimuleerde als een sinusoïdale stroom plus Gaussiaanse ruis. Op alle andere sites, wordt alleen ruis veroorzaakt. Parameters: gamma amplitude: 1 mV; standaarddeviatie van lawaai: 0.05 mV; temporele resolutie: 10 kHz. C: We het effect van amplitude-filteren van volume geleiding via de extracellulaire ruimte gemodelleerd op een vereenvoudigde manier als een negatieve exponentiële afname van gamma amplitudes met een constante ruimte weefsel van 500 µm. De exacte parameters goed beschrijven de laterale verspreiding van LFP signalen zijn hoogst controversiële14. Echter, onze raming past goed om gegevens van een neocortical gamma trilling samenhang studie15. In de resulterende LFP omvat de oorspronkelijk focal trilling verschillende sites van de opname. D: na het uitvoeren van de analyse van de CSD langs de individuele assen met behulp van de gegeven vergelijking van de CSD, de trilling is alleen zichtbaar op de oorspronkelijke locatie. E: Macht spectrale dichtheid analyse van LFP (links, rood) en CSD sporen (rechts, blauw) voor het opnemen van sites 4 op schacht ik (gestippelde lijn) en II (doorlopende lijn). Merk op dat CSD analyse correct isoleert de lokale 40 Hz trilling op de schacht die ik terwijl de LFP signaal bevat aanzienlijk volume-gevoerd-interstadiaal activiteit op schacht II. PSD-analyse werd uitgevoerd met behulp van MATLAB de pwelch functie. F: Het vergroten van de afstand tussen de opnamen sites op individuele shanks 400 µm resultaten in een verminderd vermogen van CSD analyse te isoleren van focale activiteit. Simulatie en analyse werd uitgevoerd met behulp van MATLAB 7.10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Toenemende bewijzen duiden dat hersenen oscillaties in hippocampal neuronale schakelingen in discrete ruimtelijke domeinen10,11,16 voorkomen. CSD analyse vermindert drastisch de invloed van volume geleiding, een cruciale voorwaarde voor de studie van lokale trilling gebeurtenissen. Met deze video bieden wij een gids voor het implanteren van siliconen sondes in de hippocampus muis voor de analyse van de CSD-gegevens. Representatieve voorbeelden van CSD signalen van sharp-Golf ripples tonen we in CA1 en van gelokaliseerde gamma oscillaties in de getand gyrus. Dit protocol kan echter ook worden gebruikt om te bestuderen van andere hippocampal oscillerende activiteit patronen, zoals theta of ademhaling-gerelateerde netwerk oscillaties17.
Succes van de innesteling afhangt van de goede uitlijning van het hoofd van het dier in het stereotaxic frame. We gebruiken een injectie naald geklemd in een stereotaxic houder voor het meten van de afwijking van het hoofd in de richtingen zoals anterioposterior en mediolateral. Opeenvolgend gaan we de naald te raken bregma en lambda en compensatie van eventuele verschuiving tussen de hoogten van beide punten door het kantelen van het stereotaxic frame. Het meten van de hoogte op 1 mm links en rechts van de bregma geeft ook een verschuiving van de mediolateral, die kan worden aangepast door het kantelen van het frame links of rechts. Deze methode verschuift < 50 µm worden aanbevolen voor de beste resultaten van implantatie.
Keuze van de sonde ontwerp is een ander essentieel aspect. Onze simulaties geven aan dat de mogelijkheid om te isoleren van lokale evenementen met toenemende elektrode afstand afwijst. We hebben met succes geïsoleerd gelokaliseerde gamma trilling gebeurtenissen met behulp van silicium sondes met 25 en 100 µm elektrode afstand en 250 en 400 µm schacht afstand11. Deze statistieken vormen dus een goed uitgangspunt voor sonde ontwerp.
Gezien de hoge kosten van silicium sondes, is herbruikbaarheid van de opname-sondes momenteel een beperkende factor. De hier beschreven methoden toestaan in principe voor herstel van de sonde. Echter wij alleen met vrucht verhaal halen de sonde na de opname in één exemplaar, die aangeeft dat het slagingspercentage van deze procedure zeer laag is. Toekomstige verbetering van het protocol, bijvoorbeeld het gebruik van micro-stations bedoeld om sonde herstel18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij zijn Karin Winterhalter en Kerstin Semmler dankbaar voor technische bijstand. Dit werk werd gesteund door het cluster van excellence BrainLinks - BrainTools (UITM 1086) van de Duitse Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crocodile clamp with stand | Reichelt Elektronik | HALTER ZD-10D | |
| Silicon probe | Cambridge Neurotech | P-series 32 | |
| Stereoscope | Olympus | SZ51 | |
| Varnish-insulated copper wire | Bürklin Elektronik | 89 F 232 | |
| Ground screws | Screws & More GmbH (screwsandmore.de) | DIN 84 A2 M1x2 | |
| Flux | Stannol | 114018 | |
| Ceramic-tipped forceps | Fine Science Tools | 11210-60 | |
| Paraffine Wax | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Soldering iron | Kurtz Ersa | OIC1300 | |
| Multimeter | Uni-T | UT61C | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.1 | |
| Pasteur pipettes | Carl Roth | EA65.1 | |
| Heat sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Stereotaxic frame | David Kopf | Model 1900 | |
| Stereotaxic electrode holder | David Kopf | Model 1900 | |
| Isoflurane | Abbvie | B506 | |
| Oxygen concentrator | Respironix | 1020007 | |
| Buprenorphine | Indivior UK Limited | ||
| Electrical shaver | Tondeo | Eco-XS | |
| Heating pad | Thermolux | 463265/-67 | |
| Surgical clamps | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Sterile cotton wipes | Carl Roth | EH12.1 | |
| Drill | Proxxon | Micromot 230/E | |
| 21G injection needle | B. Braun | 4657527 | |
| Phosphate buffer/phosphate buffered saline | |||
| Stereotaxic atlas | Elsevier | 9.78012E+12 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Surgical forceps | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| 27G injection needles | B. Braun | 4657705 | |
| Vaseline | |||
| Dental cement | Sun Medical | SuperBond T&M | |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50mg/ml | |
| Recording amplifier | Intan Technologies | C3323 | |
| USB acquisition board | Intan Technologies | C3004 | |
| Recording cables | Intan Technologies | C3216 | |
| Electrical commutator | Doric lenses | HRJ-OE_FC_12_HARW | |
| Acquisition software | OpenEphys (www.open-ephys.org) | GUI | allows platform-independent data acquisition |
| Computer for data acquisition | |||
| Analysis environment | Python (www.python.org) | allows platform-independent data analysis | |
| Urethane | Sigma-Aldrich | ||
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Microscope slides | Carl Roth | H868.1 | |
| Cover slips | Carl Roth | H878.2 | |
| Embedding medium | Sigma-Aldrich | 81381-50G | |
| Distilled water | Millipore | Milli Q | Table-top machine for the production of distilled water |
| Tergazyme | Alconox | Tergazyme |
References
- Buzsáki, G., Draguhn, A. Neuronal oscillations in cortical networks. Science. 304 (5679), 1926-1929 (2004).
- Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
- Benchenane, K., et al. Coherent theta oscillations and reorganization of spike timing in the hippocampal-prefrontal network upon learning. Neuron. 66 (6), 921-936 (2010).
- Jadhav, S. P., Kemere, C., German, P. W., Frank, L. M. Awake hippocampal sharp-wave ripples support spatial memory. Science. 336 (6087), 1454-1458 (2012).
- Yamamoto, J., Suh, J., Takeuchi, D., Tonegawa, S. Successful execution of working memory linked to synchronized high-frequency gamma oscillations. Cell. 157 (4), 845-857 (2014).
- Karalis, N., et al. 4-Hz oscillations synchronize prefrontal-amygdala circuits during fear behavior. Nature Neuroscience. 19 (4), 605-612 (2016).
- Khodagholy, D., Gelinas, J. N., Buzsáki, G. Learning-enhanced coupling between ripple oscillations in association cortices and hippocampus. Science. 358 (6361), 369-372 (2017).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Mitzdorf, U. Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomena. Physiological Reviews. 65 (1), 37-100 (1985).
- Lasztóczi, B., Klausberger, T. Layer-specific GABAergic control of distinct gamma oscillations in the CA1 hippocampus. Neuron. 81 (5), 1126-1139 (2014).
- Strüber, M., Sauer, J. -F., Jonas, P., Bartos, M. Distance-dependent inhibition facilitates focality of gamma oscillations in the dentate gyrus. Nature Communications. 8 (1), 758 (2017).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press, Elsevier. (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kajikawa, Y., Schroeder, C. E. How local is the local field potential? Neuron. 72 (5), 847-858 (2011).
- Berens, P., Keliris, G. A., Ecker, A. S., Logothetis, N. K., Tolias, A. S. Feature selectivity of the gamma-band of the local field potential in primate primary visual cortex. Frontiers in Neuroscience. 2 (2), 199-207 (2008).
- Lastóczi, B., Klausberger, T. Distinct gamma oscillations in the distal dendritic field of the dentate gyrus and the CA1 area of mouse hippocampus. Brain Structure and Function. 222 (7), 3355-3365 (2017).
- Nguyen Chi, V., Müller, C., Wolfenstetter, T., Yanovsky, Y., Draguhn, A., Tort, A. B. L., Brankačk, J. Hippocampal respiration-driven rhythm distinct from theta oscillations in awake mice. Journal of Neuroscience. 36 (1), 162-177 (2016).
- Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes. Scientific Reports. 7 (1), 2773 (2017).
