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Neuroscience

चूहों व्यवहार के हिप्पोकैम्पस में स्थानिक प्रतिबंधित दोलनों रिकॉर्डिंग

Published: July 1, 2018 doi: 10.3791/57714
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Physiology I, University of Freiburg

Summary

इस प्रोटोकॉल बहु-टांग रैखिक सिलिकॉन जांच के साथ स्थानीय क्षेत्र क्षमता की रिकॉर्डिंग का वर्णन । वर्तमान स्रोत घनत्व विश्लेषण का उपयोग कर संकेतों का रूपांतरण माउस हिप्पोकैम्पस में स्थानीय विद्युत गतिविधि के पुनर्निर्माण की अनुमति देता है । इस तकनीक के साथ, स्थानिक प्रतिबंधित मस्तिष्क दोलनों स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में अध्ययन किया जा सकता है ।

Abstract

स्थानीय क्षेत्र क्षमता (LFP) तंत्रिका झिल्ली के पार आयन आंदोलनों से उभर रहे हैं । LFP इलेक्ट्रोड द्वारा दर्ज वोल्टेज के बाद से मस्तिष्क के ऊतकों की एक बड़ी मात्रा के अभिव्यक्त बिजली के क्षेत्र को दर्शाता है, स्थानीय गतिविधि के बारे में जानकारी निकालने चुनौतीपूर्ण है. अध्ययन के न्यूरॉन microcircuits बहरहाल, वास्तव में स्थानीय घटनाओं और मात्रा के बीच एक विश्वसनीय अंतर की आवश्यकता है, सुदूर मस्तिष्क क्षेत्रों में उद्भव संकेतों का आयोजन किया. वर्तमान स्रोत घनत्व (CSD) विश्लेषण इलेक्ट्रोड के आसपास के क्षेत्र में वर्तमान सिंक और स्रोतों के बारे में जानकारी प्रदान करके इस समस्या के लिए एक समाधान प्रदान करता है । ऐसे हिप्पोकैम्पस के रूप में लामिना cytoarchitecture के साथ मस्तिष्क क्षेत्रों में, एक आयामी CSD LFP के दूसरे स्थानिक व्युत्पंन का आकलन करके प्राप्त किया जा सकता है । यहां, हम एक विधि का वर्णन multilaminar LFPs रैखिक सिलिकॉन पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में प्रत्यारोपित जांच का उपयोग कर रिकॉर्ड । CSD निशान जांच के व्यक्तिगत टांगों के साथ गणना कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल इस प्रकार एक प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए स्वतंत्र रूप से चलती चूहों के हिप्पोकैम्पस में विशेष रूप से प्रतिबंधित ंयूरॉंस नेटवर्क दोलनों का समाधान ।

Introduction

LFP में दोलनों महत्वपूर्ण रूप से न्यूरॉन सर्किट द्वारा सूचना प्रसंस्करण में शामिल हैं. वे तेजी से तरंग दोलनों (~ २०० हर्ट्ज)1करने के लिए धीमी तरंगों (~ 1 हर्ट्ज) से लेकर आवृत्तियों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम को कवर किया । अलग आवृत्ति बैंड स्मृति, भावनात्मक प्रसंस्करण, और नेविगेशन2,3,4,5,6,7सहित संज्ञानात्मक कार्यों के साथ जुड़े रहे हैं । ंयूरॉन झिल्ली के पार वर्तमान प्रवाह LFP8संकेत का सबसे बड़ा हिस्सा का गठन किया । Cations (जैसे glutamatergic उत्तेजक synapses के सक्रियण के माध्यम से) सेल में प्रवेश करने के लिए एक सक्रिय वर्तमान सिंक का प्रतिनिधित्व (प्रभारी के रूप में extracellular माध्यम से छोड़ देता है) । इसके विपरीत, extracellular माध्यम के लिए सकारात्मक प्रभार के शुद्ध प्रवाह, उदाहरण के लिए GABAergic निरोधात्मक synapses के सक्रियण द्वारा, उस स्थान पर एक सक्रिय वर्तमान स्रोत का चित्रण । न्यूरॉन dipoles में, वर्तमान सिंक निष्क्रिय स्रोतों के साथ युग्मित कर रहे हैं और दूर साइटों पर झिल्ली चार्ज को प्रभावित धाराओं क्षतिपूर्ति के कारण विपरीत.

बिजली के क्षेत्र में दूरदराज के तंत्रिका प्रक्रियाओं द्वारा उत्पादित भी एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड पर काफी वोल्टेज झुकाव में परिणाम कर सकते हैं और इस प्रकार झूठा एक स्थानीय घटना के रूप में माना जा सकता है. यह मात्रा आचरण LFP संकेतों की व्याख्या के लिए एक गंभीर चुनौती बन गया है । CSD विश्लेषण स्थानीय वर्तमान डूब और LFP संकेतों अंतर्निहित स्रोतों के बारे में जानकारी प्रदान करता है और इसलिए मात्रा कंडक्टर8के प्रभाव को कम करने के लिए एक साधन शामिल हैं । हिप्पोकैम्पस, एक आयामी CSD संकेतों की तरह फाड़ा संरचनाओं में equidistant इलेक्ट्रोड से दर्ज LFP के दूसरे स्थानिक व्युत्पंन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है लामिना9विमानों को सीधा करने की व्यवस्था की । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रैखिक सिलिकॉन जांच के आगमन के शोधकर्ताओं हिप्पोकैम्पस में स्थानीय दोलन गतिविधि के अध्ययन के लिए CSD विधि का उपयोग करने की अनुमति दी गई है । उदाहरण के लिए, यह प्रदर्शित किया गया है कि अलग गामा दोलनों CA1 क्षेत्र10में एक परत-विशिष्ट तरीके से उभरने । इसके अलावा, CSD विश्लेषण dentate गाइरस11के प्रमुख कोशिका परत में गामा गतिविधि के स्वतंत्र गर्म स्थानों की पहचान की है । महत्वपूर्ण बात यह है कि ये निष्कर्ष केवल स्थानीय CSD में ही स्पष्ट नहीं थे बल्कि LFP संकेतों में थे । CSD विश्लेषण इस प्रकार हिप्पोकैम्पस के microcircuit आपरेशनों में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है ।

इस प्रोटोकॉल में, हम सिलिकॉन जांच के साथ एक आयामी CSD संकेतों को प्राप्त करने के लिए एक व्यापक गाइड प्रदान करते हैं । इन पद्धतियों चूहों व्यवहार के हिप्पोकैम्पस में स्थानीयकृत दोलन घटनाओं की जांच करने के लिए उपयोगकर्ताओं को सक्षम हो जाएगा ।

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Protocol

सभी जीवित पशुओं को शामिल तरीके जर्मन पशु कल्याण अधिनियम के अनुसार Regierungspräsidium फ्रीबर्ग द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. तैयारी

  1. डिजाइन और आरोपण की प्रक्रिया के दौरान सिलिकॉन जांच और इलेक्ट्रोड संबंधक ले जाने के क्षणिक एक उपयुक्त प्रविष्टि उपकरण का निर्माण । एक उदाहरण कस्टम निर्मित सम्मिलन उपकरण के लिए चित्र 1 देखें.
  2. ध्यान से अपनी पैकेजिंग से सिलिकॉन जांच और इलेक्ट्रोड कनेक्टर जारी सिरेमिक-इत्तला दे दी संदंश का उपयोग कर ।
  3. कनेक्टर बोर्ड उठाएं और सुरक्षित रूप से इसे एक मगरमच्छ के साथ एक स्टैंड से जुड़ी क्लैंप के साथ ठीक करें ।
  4. एक stereoscope का प्रयोग, सिरेमिक-इत्तला दे दी संदंश के साथ सम्मिलन उपकरण के साथ जांच संरेखित करें । लागू एक ~ आयल मोम के 2 मिमी परत एक cauterizer के साथ पिघल के लिए संमिलन उपकरण के लिए जांच गोंद । इस प्रक्रिया के दौरान जांच टांगों को छूने के लिए नहीं ध्यान रखना ।
  5. मानक चिपकने वाला टेप का उपयोग कर सम्मिलन उपकरण के शाफ्ट के लिए इलेक्ट्रोड कनेक्टर ठीक करें. ध्यान दें कि निर्माता के आधार पर, जमीन के तारों को इलेक्ट्रोड संबंधक बोर्ड को प्रत्यारोपित करने से पहले टांके लगाने की आवश्यकता हो सकती है । एक टांका लोहे (४०० डिग्री सेल्सियस) के साथ लागू टिन-मिलाप का उपयोग कर वार्निश-अछूता तांबे के तार के दो छोटे टुकड़ों से इंसुलेशन निकालें । इलेक्ट्रोड कनेक्टर बोर्ड में उपयुक्त स्लॉट के लिए जमीन तारों मिलाप.
  6. तांबे के तार के दो अतिरिक्त टुकड़े के इंसुलेशन निकालें । प्रत्येक नंगे तांबे के तार एक स्टेनलेस स्टील स्क्रू (1 मिमी व्यास, 2 मिमी लंबाई) के आसपास तीन बार लपेटें । लागू फ्लक्स टांका लगाने की स्टील के लिए उपयुक्त है और पेंच टोपी के नीचे करने के लिए तांबे के तार मिलाप । सुनिश्चित करें कि पेंच धागे के नीचे आधा टिन-मिलाप से मुक्त रहता है ।
  7. तार और पेंच के बीच विद्युत संपर्क के लिए जांच करने के लिए एक मानक मीटर का उपयोग करें ।
  8. सिलिकॉन जांच और ७०% इथेनॉल (10 एस) में विसर्जन द्वारा जमीन शिकंजा के टांगों को संक्रमित ।
  9. आधे में एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के सिर काट कर जांच प्रत्यारोपण के लिए एक सुरक्षात्मक आवरण तैयार करें ।

2. प्रत्यारोपण सर्जरी

  1. एक गर्म मनका नसबंदी के साथ सर्जिकल उपकरणों (कैंची, ठीक इत्तला दे दी संदंश, सर्जिकल clamps) निष्फल । ७०% इथेनॉल के साथ सभी सतहों पोंछ ।
  2. ~ 1 L/मिनट पर दिया ऑक्सीजन में 3% isoflurane के साथ संज्ञाहरण प्रेरित ।
    1. रखरखाव के लिए, 1-१.५% isoflurane का उपयोग करें । ध्यान दें कि शल्य सहिष्णुता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक isoflurane एकाग्रता जानवर से जानवर के लिए भिन्न हो सकते हैं ।
    2. पशु पैर की अंगुली-चुटकी का जवाब करने के लिए विफल रहता है जब स्थिर शल्य सहिष्णुता हासिल की है । माउस की श्वास दर की निगरानी और यदि आवश्यक हो तो isoflurane की एकाग्रता समायोजित करें ।
    3. जानवरों की आंखों के लिए मरहम लागू करने के लिए बाहर सुखाने को रोकने के ।
  3. धीरे कान नहर में कान सलाखों डालने के द्वारा एक stereotaxic फ्रेम में माउस माउंट । एक बार माउस के सिर कान सलाखों के द्वारा स्थिर है, निरंतर isoflurane वितरण के लिए थूथन पर एक मुंह टुकड़ा जगह है । एक हीटिंग पैड पर तौलिया या पैड पर माउस प्लेस और बाद में analgesia सुनिश्चित करने के लिए buprenorphine चमड़े के नीचे (०.०५-०.१ मिलीग्राम/
  4. एक मानक शेविंग के साथ सिर दाढ़ी और ७०% इथेनॉल के साथ त्वचा को संक्रमित । सर्जिकल कैंची का प्रयोग, खोपड़ी के midline के साथ त्वचा में एक चीरा बनाने के लिए और शल्य चिकित्सा clamps का उपयोग कर त्वचा को खोलने ।
  5. bregma और लैंब्डा स्तर के लिए एक stereotaxic संरेखण उपकरण की सहायता से पशु के सिर संरेखित करें । bregma और लैंब्डा के बीच ऑफसेट ऊंचाई के ५० µm से कम होना चाहिए । इसके अलावा, परिभाषित दूरी पर खोपड़ी की सतह पर bregma से गहराई को मापने के द्वारा mediolateral अक्ष के साथ सिर स्तर छोड़ दिया और सही (जैसे, 1 मिमी छोड़ दिया और bregma के अधिकार) । यदि आवश्यक हो तो सिर के झुकाव को समायोजित करें ।
  6. 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ सिर साफ और बाँझ कपास पोंछे के साथ सूखी पोंछ ।
  7. एक उपयुक्त stereotaxic एटलस12का उपयोग कर bregma के सापेक्ष craniotomy का स्थान निर्धारित करें ।
  8. एक ०.९ mm ड्रिल सिर का प्रयोग, सेरिबैलम पर हड्डी में दो पेंच छेद ड्रिल जमीन और संदर्भ शिकंजा जगह है । इसके अतिरिक्त, शिकंजा लंगर लगाने के लिए 1-3 छेद प्रत्यारोपण को स्थिर करने के लिए वांछनीय हैं । लंगर शिकंजा के स्थान craniotomy के स्थान पर निर्भर करेगा । हिप्पोकैम्पस में आरोपण के लिए, contralateral पार्श्विका और ipsilateral ललाट प्रांतस्था पर जगह लंगर शिकंजा । एक उपयुक्त पेचकश का उपयोग कर हड्डी में शिकंजा डालें । ध्यान रखना मस्तिष्क में घुसना नहीं है ।
  9. धीरे प्रत्यारोपण पक्ष के आसपास एक आयताकार क्षेत्र में ड्रिल के साथ खोपड़ी thinning द्वारा craniotomy प्रदर्शन करते हैं । अक्सर निष्फल फॉस्फेट बफर (पंजाब) के साथ हड्डी गीला । शेष thinned खोपड़ी धीरे से छेदा जा सकता है और एक ठीक (27G) इंजेक्शन सुई और चिमटी की एक जोड़ी की सहायता से हटा दिया ।
  10. ध्यान से एक पतली (27G) इंजेक्शन सुई के साथ बाडी मेटर पियर्स । चिमटी की एक जोड़ी के साथ सुई की नोक झुका द्वारा एक छोटा सा हुक फार्म और बाडी हटाने के लिए खींच । लागू पंजाब के बाहर सुखाने से मस्तिष्क की सतह को रोकने के लिए ।
  11. एक stereotaxic धारक पर इलेक्ट्रोड सम्मिलन उपकरण माउंट, bregma पर जांच शून्य, और craniotomy पर stereotaxic निर्देशांक करने के लिए जांच ले जाएँ. धीरे दिमाग की सतह घुसना । सुनिश्चित करें कि जांच शाफ्ट झुकना नहीं है । रक्त वाहिकाओं के माध्यम से प्रत्यारोपण से बचें ।
  12. धीरे से जांच कम जब तक ~ २०० वांछित गहराई से ऊपर µm । सुरक्षा के लिए निष्फल वैसलीन के साथ सिलिकॉन जांच के craniotomy और टांगों को ढक कर रखें । खोपड़ी में लंगर लगाने वाले पेंच को जांच के आधार पर ठीक करने के लिए डेंटल सीमेंट लागू करें ।
  13. सही सीमेंट आवेदन के बाद, धीरे लक्ष्य गहराई के लिए जांच करने के लिए कदम । सीमेंट के आवेदन के बाद पिछले ~ २०० µm आगे बढ़ जांच के पार्श्व आंदोलन को कम कर देता है और लक्ष्य क्षेत्र में ंयूनतम ऊतक क्षति सुनिश्चित करता है । ध्यान दें कि उपयोग सीमेंट के इलाज के समय प्रोटोकॉल के इस कदम को प्रभावित कर सकते हैं । जल्दी से सीमेंट के इलाज के साथ, इस कदम छोड़ और सीधे लक्ष्य गहराई करने के लिए जांच प्रत्यारोपण क्रम में सिलिकॉन जांच को नुकसान से बचने के लिए ।
  14. सीमेंट ठीक हो जाने के बाद, एक cauterizer के साथ मोम पिघलने से सम्मिलन उपकरण से जांच जारी.
  15. सम्मिलन डिवाइस से कनेक्टर बोर्ड छोड़ें और सम्मिलन हैंडल से अनुलग्न एक मगरमच्छ दबाना का उपयोग करके खोपड़ी पर एक उपयुक्त स्थान पर रखें. हिप्पोकैम्पस में जांच आरोपण के मामले में, contralateral पार्श्विका हड्डी पर संबंधक बोर्ड जगह है । दंत सीमेंट का उपयोग कर खोपड़ी के लिए कनेक्टर बोर्ड को ठीक करें ।
  16. मिलाप सेरिबैलम पर दो शिकंजा करने के लिए संलग्न तारों को कनेक्टर बोर्ड के जमीन और संदर्भ तारों.
  17. सही ऊंचाई के लिए सुरक्षात्मक कवर ट्रिम कर दीजिए और यह सिलिकॉन जांच पर जगह है । कनेक्टर बोर्ड और खोपड़ी के लिए कवर ठीक दंत सीमेंट का उपयोग कर, उजागर खोपड़ी के आसपास त्वचा से परहेज । Suturing प्रत्यारोपण साइट के आसपास त्वचा आमतौर पर आवश्यक नहीं है ।

3. सर्जरी के बाद रिकवरी

  1. के लिए उचित एनाल्जेसिक उपचार लागू करें (buprenorphine के चमड़े के नीचे इंजेक्शन हर दिन के दौरान 6 घंटे और पीने के पानी में carprofen के साथ संयुक्त रात के दौरान (4-5 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) चमड़े के नीचे हर 24 ज) । एकल आवास प्रत्यारोपण को नुकसान को रोकने के लिए सिफारिश की है ।
  2. वसूली के लिए कम से एक सप्ताह की अनुमति दें । स्थानीय पशु कल्याण संबंधी दिशानिर्देशों से परामर्श करें ।

4. डाटा अधिग्रहण

  1. एक कंयूटेटर के माध्यम से जुड़ा एक उपयुक्त डेटा अधिग्रहण प्रणाली का उपयोग कर स्वतंत्र रूप से चलती चूहों से रिकॉर्ड LFPs. LFPs प्राप्त करने के लिए, 1-5 kHz के एक नमूना आवृत्ति का उपयोग करें. LFP के साथ दर्ज किया जा करने के लिए एक इकाई निर्वहन कर रहे हैं, तो उच्च नमूना दरों (20-30 kHz) की आवश्यकता है.
  2. ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत चैनलों की रॉ रिकॉर्डिंग फ़ाइलें स्टोर ।

5. प्रोटोकॉल

  1. रिकॉर्डिंग के पूरा होने के बाद, गहराई से पशु anesthetize (जैसे 2 ग्राम/किलोग्राम शरीर का वजन urethane इंजेक्शन intraperitoneally) । पैर की अंगुली चुटकी के जवाब की कमी से संवेदनाहारी राज्य की पुष्टि करें ।
  2. Perfuse बर्फ ठंडा फॉस्फेट के साथ माउस transcardially-बफर खारा (~ 1 मिनट) 4% paraformaldehyde (~ 10 मिनट) मानक intracardial छिड़काव तरीकों13का उपयोग करके पीछा किया । छिड़काव से पहले, रिकॉर्डिंग साइटों की इलेक्ट्रोलाइटिक घावों प्रदर्शन द्वारा (उदाहरण के लिए 1 एस के लिए लगातार वोल्टेज की 10-20 वी लागू करने के द्वारा) हो सकता है । वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंट रंजक प्रत्यारोपण से पहले टांग सुझावों के लिए लागू पहचान ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सिलिकॉन जांच के विभिंन प्रकार के साथ इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए इलेक्ट्रोड पदों की पहचान के लिए विभिंन तरीकों का परीक्षण की सिफारिश की है ।
  3. मस्तिष्क वर्गों में कटौती (~ १०० µm) और 4 ' -6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1 µ g/एमएल) के साथ स्लाइस दाग पंजाब में तीन धुलाई कदम (प्रत्येक 10 मिनट के कमरे के तापमान पर) के बाद ।
  4. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों प्लेस, embedding मध्यम की एक बूंद लागू करते हैं और एक कवर पर्ची के साथ अनुभाग कवर. एंबेडिंग मध्यम शुष्क कमरे के तापमान पर रातोंरात चलो ।
  5. एक epifluorescence या फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, रिकॉर्डिंग साइटों के स्थान की पहचान ।
  6. आगे उपयोग के लिए सिलिकॉन जांच की वसूली का प्रयास करने के लिए, एक मगरमच्छ दबाना के साथ जांच पकड़ और ध्यान से एक टांका लोहे (४०० डिग्री सेल्सियस) के साथ दंत सीमेंट पिघलने से खेना से जांच जारी । इस प्रक्रिया के दौरान जांच टांगों को छूने के लिए नहीं ध्यान रखना!
  7. गर्म आसुत जल में जांच धो (~ ८० ° c, 15 min) एंजाइमी समाधान द्वारा पीछा किया (आसुत जल में 1% Tergazyme, कमरे के तापमान पर 30 मिनट) और आसुत जल में एक और धुलाई कदम (15 मिनट) । ध्यान दें कि जांच वसूली की सफलता दर कम है ।

6. CSD विश्लेषण

  1. एक उपयुक्त विश्लेषण पर्यावरण (जैसे पायथन) का उपयोग करना, एक व्यक्ति टांग के LFP डेटा परिवर्तित करने के लिए CSD के रूप में टांग के साथ दूसरे स्थानिक व्युत्पंन approximating द्वारा
    Equation
    जहां LFPn, t है LFP संकेत पर nth इलेक्ट्रोड समय t और Δz अंतर-इलेक्ट्रोड रिक्ति है । ध्यान दें कि n-1 और n+ 1 के संचालन के कारण, पिंडली के प्रथम और अंतिम इलेक्ट्रोड के CSD का अनुमान नहीं लगाया जा सकता है, जिसे जांच प्लेसमेंट के दौरान विचाराधीन रखा जाना चाहिए । संनिकटन सूत्र कोड के एक छोटे खंड का उपयोग कर लागू करें जो प्रत्येक इलेक्ट्रोड के लिए CSD संकेत की गणना करते समय पर चलना (पूरक कोड फ़ाइल देखें) ।
  2. आगे विश्लेषण के लिए प्राप्त CSD संकेत का प्रयोग करें (जैसे, बैंड पास फिल्टर लगाने के द्वारा मस्तिष्क दोलनों के विशिष्ट आवृत्ति बैंड का अध्ययन).

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Representative Results

चित्र 1 प्रविष्टि सिलिकॉन जांच के आरोपण के लिए इस्तेमाल उपकरण दिखाता है । लंबे समय से प्रत्यारोपित सिलिकॉन CA1 क्षेत्र और dentate गाइरस के दाना कोशिका परत को लक्षित जांच से रिकॉर्डिंग चित्रा 2में दिखाया गया है । हम homecage में मुक्त आंदोलन के दौरान जांच टांगों से LFPs दर्ज की गई । मात्रा के संचालन के प्रभाव को कम करने के लिए, प्राप्त संकेतों जांच के प्रत्येक टांग के साथ CSD में परिवर्तित कर रहे थे (चित्रा बीसी, डी) । पहली चित्र बीमें दिखाया उदाहरण में, एक तेज लहर तरंग घटना CA1 की परत radiatum में एक प्रमुख वर्तमान सिंक की ओर जाता है । चित्रा 2cईमें प्रदर्शित दूसरे उदाहरण में, हम dentate गाइरस (पार्श्व दूरी ४०० µm) के दाना सेल परत में दो अलग साइटों से दर्ज की गई । हाई-गामा बैंड एक ६०-८० हर्ट्ज bandpass फ़िल्टर CSD संकेत करने के लिए लागू करने से अलग किया गया था, दो रिकॉर्डिंग में से एक पर स्थानीय गामा फटने पता चलता है दाना सेल परत (चित्रा 2d; लाल रिकॉर्डिंग साइट) में स्थित साइटों । ध्यान दें कि स्थानीय गामा दोलन गतिविधि केवल रिकॉर्ड किए गए संकेतों के रूपांतरण के बाद CSD करने के लिए पता लगाया जा सकता (चित्रा 2d, सही). चित्रा 2E एक ही रिकॉर्डिंग, जिसके दौरान दोनों रिकॉर्डिंग साइटों पर गामा दोलनों उनके चरण (चित्रा 2E, बाएँ) या आयाम (चित्रा 2E, मध्य) में अलग अलग समय अवधि से पता चलता है. rightmost उदाहरण दोनों रिकॉर्डिंग साइटों पर सिंक्रनाइज़ गामा गतिविधि का एक युग प्रदर्शित करता है । ये उदाहरण वर्णन करते है कि CSD विश्लेषण स्थानीय गतिविधि को न केवल विश्लेषण के आयाम में बल्कि सीधा दिशाओं में अलग करने में सक्षम है । आगे इस केंद्रीय अवधारणा को समझाने के लिए, हम एक सिलिकॉन दो टांगों से मिलकर जांच (मैं और द्वितीय) पांच रिकॉर्डिंग साइटों के साथ एक प्रयोग मॉडलिंग की, सादृश्य में प्रत्येक चित्र 2में दिखाए गए परिणामों के लिए । हमारे मॉडल में, जांच एक स्थानीय गामा दाना मैं (चित्रा 3) की साइट 4 रिकॉर्डिंग के बगल में परत में उभर दोलन के साथ dentate गाइरस में प्रत्यारोपित है । ऊतक भर में सजातीय मात्रा चालन संभालने, स्थानीय दोलन LFP में एक आयाम फ़िल्टर संस्करण में सभी अन्य रिकॉर्डिंग साइटों पर दर्ज किया जाएगा (चित्रा 3सी). हालांकि, दोनों टांगों के साथ CSD विश्लेषण प्रदर्शन स्पष्ट रूप से गामा पीढ़ी (चित्रा 3 डी) के लोकस अलग । इसके अलावा, छोटे एक ही टांग पर रिकॉर्डिंग साइटों के बीच दूरी, छोटे पड़ोसी टांगों पर CSD संकेतों के बीच crosstalk (चित्रा 3E, एफ) ।

Figure 1
चित्र 1: सम्मिलन उपकरण की छवि. सिलिकॉन जांच एक कीट एक मगरमच्छ दबाना के आधार से चिपके पिन से जुड़ा हुआ है । धारक के शाफ्ट आरोपण के लिए एक stereotaxic माइक्रो जोड़तोड़ में डाला जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: में हिप्पोकैम्पस के CSD विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम । एक: एक इलेक्ट्रोड चार टांग सिलिकॉन जांच से मिलकर सरणी (टांग रिक्ति ४०० µm, इलेक्ट्रोड रिक्ति १०० µm, 8 इलेक्ट्रोड/टांग) cornu ammonis 1 (CA1) क्षेत्र में प्रत्यारोपित किया गया । टांग एक-सी ओलांडून परत oriens (ण), परत pyramidale (प), और परत radiatum (r). HF: हिप्पोकैम्पस विदर. DG: dentate गाइरस. ख: LFP (काले निशान) और CSD (रंग कोडित) CA1 में तीन टांगों की एक २०० ms एक सहज तेज लहर तरंग घटना से युक्त युग के दौरान । परत radiatum में प्रमुख वर्तमान सिंक ध्यान दें । LFP स्केल बार: 2 एमवी । C: एक सिलिकॉन जांच डीजी से रिकॉर्डिंग का उदाहरण । टांगो ए और बी घुसना डीजी. CA3: cornu ammonis area 3. इलेक्ट्रोड पटरियों लेबल करने के लिए रिकॉर्डिंग के बाद इलेक्ट्रोलाइटिक घावों का प्रदर्शन किया गया. डी: हिप्पोकैम्पस शरीर रचना विज्ञान के संबंध में इलेक्ट्रोड टांगों की ड्राइंग । दाना सेल परत (लाल और नीले रंग की रिकॉर्डिंग साइट) में दो स्थानिकी अलग साइटों से LFP रिकॉर्डिंग पता चलता है कि गामा दोलनों (६०-८० हर्ट्ज) दोनों साइटों (बाएँ) के बीच सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं. हालांकि, एक ही समय अंतराल के CSD संकेतों लाल रिकॉर्डिंग साइट (दाएँ) के लिए प्रतिबंधित एक फोकल गामा ' हॉट स्पॉट ' प्रकट करते हैं । दोनों रिकॉर्डिंग साइटों से CSD संकेतों को एक ही पैमाने पर तैयार कर रहे हैं । ई: CSD लेकिन नहीं LFP संकेत चरण (बाएं) और आयाम asynchrony दोनों रिकॉर्डिंग साइटों के बीच (मध्य) की अवधि की पहचान । सही पर युग सिंक्रनाइज़ गामा गतिविधि का एक संक्षिप्त युग से पता चलता है । नीचे पर निशान चरण अंतर (Δ-रेडियंस में चरण) और आयाम अंतर सूचकांक (Ampl. index, दोनों रिकॉर्डिंग साइटों से एक सीमा के साथ प्रत्येक समय बिंदु पर आयाम का योग द्वारा विभाजित के बीच आयाम अंतर के रूप में परिभाषित किया गया है-1 से 1) के लिए LFP (ग्रे) और CSD (काले) निशान । सभी तीन उदाहरण 30 ms लंबे होते है और ४०० ms. पैनलों के भीतर हुई सी और डी क्रिएटिव कॉमंस (https://creativecommons.org/Licenses/by/4.0/) के अंतर्गत Strüber एट अल. २०१७11 से अनुकूलित कर रहे हैं । दोनों रिकॉर्डिंग साइटों से CSD संकेतों प्रत्येक व्यक्ति पैनल में एक ही पैमाने पर तैयार कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: dentate गाइरस दाना सेल परत में नकली फोकल ४० हर्ट्ज दोलन के साथ मॉडल प्रयोग । एक: एक मॉडल सिलिकॉन जांच डीपिंडली की दूरी पर दो टांगों के साथ = ४०० µm और पांच रिकॉर्डिंग डीइलेक्ट्रोड की दूरी पर स्थित साइटों = १०० µm dentate गाइरस में रखा गया है । बी: पिंडली मैं, एक फोकल ४० हर्ट्ज दोलन की 4 साइट के लिए अगले एक sinusoidal तरंग प्लस गाऊसी सफेद शोर के रूप में अनुकरणीय है । अंय सभी साइटों पर, केवल शोर प्रेरित है । पैरामीटर: गामा आयाम: 1 एमवी; शोर के मानक विचलन: ०.०५ एमवी; लौकिक संकल्प: 10 kHz । सी: हम ५०० µm के एक ऊतक अंतरिक्ष लगातार के साथ गामा आयाम के एक नकारात्मक घातीय क्षय के रूप में एक सरलीकृत तरीके से extracellular अंतरिक्ष के माध्यम से मात्रा के संचालन के आयाम को छानने के प्रभाव को मॉडलिंग की । सटीक ठीक पैरामीटर LFP संकेतों के पार्श्व प्रसार का वर्णन अत्यधिक विवादास्पद14हैं । हालांकि, हमारे अनुमान एक neocortical गामा दोलन जुटना अध्ययन15से डेटा के लिए अच्छी तरह से फिट बैठता है । परिणामस्वरूप LFP में, मूल फोकल दोलन कई रिकॉर्डिंग साइटों शामिल हैं । डी: दिया CSD समीकरण का उपयोग व्यक्ति शाफ्ट के साथ CSD विश्लेषण प्रदर्शन करने के बाद, दोलन मूल स्थान पर ही दिखाई दे रहा है. ई: LFP की शक्ति वर्णक्रमीय घनत्व विश्लेषण (बाएं, लाल) और CSD निशान (सही, नीला) की रिकॉर्डिंग 4 टांग पर मैं (बिंदीदार रेखा) और द्वितीय (सतत रेखा) । ध्यान दें कि CSD विश्लेषण सही ढंग से अलग स्थानीय ४० हर्ट्ज पिंडली पर मैं जबकि LFP संकेत पर्याप्त मात्रा-पिंडली द्वितीय पर आयोजित दोलन गतिविधि शामिल हैं । PSD विश्लेषण है MATLAB pwelch समारोह का उपयोग किया गया । च: व्यक्तिगत टांगों पर रिकॉर्डिंग साइटों के बीच दूरी बढ़ाने के लिए CSD विश्लेषण की एक कम क्षमता में ४०० µm परिणाम फोकल गतिविधि को अलग करने के लिए । सिमुलेशन और विश्लेषण MATLAB ७.१० का उपयोग किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

बढ़ती सबूतों से संकेत मिलता है कि मस्तिष्क दोलनों हिप्पोकैम्पस में न्यूरॉनल सर्किट असतत स्थानिक डोमेन में होते हैं10,11,16. CSD विश्लेषण काफी मात्रा के संचालन, स्थानीय दोलन घटनाओं के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त के प्रभाव को कम कर देता है । इस वीडियो के साथ, हम CSD डेटा के विश्लेषण के लिए माउस हिप्पोकैम्पस में सिलिकॉन जांच प्रत्यारोपित करने के लिए एक गाइड प्रदान करते हैं । हम CA1 में तीव्र तरंग तरंगें और dentate गाइरस में स्थानीयकृत गामा दोलनों के CSD संकेतों के प्रतिनिधि उदाहरण दिखाते हैं । हालांकि, इस प्रोटोकॉल भी थीटा या श्वसन से संबंधित नेटवर्क दोलनों के रूप में अन्य हिप्पोकैम्पस थरथरानवाला गतिविधि पैटर्न, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है17.

आरोपण की सफलता stereotaxic फ्रेम में जानवर के सिर के उचित संरेखण पर महत्वपूर्ण रूप से निर्भर करता है । हम एक इंजेक्शन सुई anterioposterior और mediolateral दिशाओं में सिर के विचलन को मापने के लिए एक stereotaxic धारक में clamped का उपयोग करें । हम क्रमिक रूप से bregma और लैंब्डा को छूने और stereotaxic फ्रेम झुकाव से दोनों बिंदुओं की ऊंचाइयों के बीच किसी भी भरपाई भरपाई करने के लिए सुई चाल । इसी तरह, 1 मिमी पर ऊंचाई को मापने के बाएँ और दाएँ bregma के किसी भी mediolateral ऑफसेट इंगित करेगा, जो फ्रेम छोड़ दिया है या सही झुका द्वारा समायोजित किया जा सकता है. श्रेष्ठ आरोपण परिणामों के लिए ऑफ़सेट < 50 µm अनुशंसित हैं ।

जांच डिजाइन के विकल्प एक और महत्वपूर्ण पहलू है । हमारे सिमुलेशन इंगित करते हैं कि स्थानीय घटनाओं को अलग करने की क्षमता में वृद्धि इलेक्ट्रोड रिक्ति के साथ अस्वीकृत कर देता है । हम सफलतापूर्वक स्थानीयकृत गामा दोलन 25 और १०० µm इलेक्ट्रोड रिक्ति और २५० और ४०० µm टांग रिक्ति11के साथ सिलिकॉन जांच का उपयोग कर घटनाओं अलग है । इन मैट्रिक्स इस प्रकार जांच डिजाइन के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु प्रदान करते हैं ।

सिलिकॉन जांच की उच्च लागत को देखते हुए, रिकॉर्डिंग जांच के पुनः प्रयोज्य वर्तमान में एक सीमित कारक है । यहां बताए गए तरीके जांच वसूली के लिए प्रधानाचार्य में अनुमति देते हैं । लेकिन, हम केवल सफलतापूर्वक एक उदाहरण में रिकॉर्डिंग के बाद जांच बरामद, यह दर्शाता है कि प्रक्रिया की सफलता की दर बहुत कम है । प्रोटोकॉल के भविष्य में सुधार माइक्रो का उपयोग शामिल हो सकता है, जांच वसूली18की सुविधा के लिए डिजाइन ड्राइव ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

तकनीकी सहायता के लिए हम करीन Winterhalter और Kerstin Semmler के आभारी हैं. यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन के क्लस्टर ऑफ एक्सीलेंस BrainLinks-BrainTools (EXC १०८६) के सहयोग से किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crocodile clamp with stand Reichelt Elektronik HALTER ZD-10D
Silicon probe Cambridge Neurotech P-series 32
Stereoscope Olympus SZ51
Varnish-insulated copper wire Bürklin Elektronik 89 F 232
Ground screws Screws & More GmbH (screwsandmore.de) DIN 84 A2 M1x2
Flux Stannol 114018
Ceramic-tipped forceps Fine Science Tools 11210-60
Paraffine Wax Sigma-Aldrich 327204
Cauterizer Fine Science Tools 18010-00
Soldering iron Kurtz Ersa OIC1300
Multimeter Uni-T UT61C
Ethanol Carl Roth 9065.1
Pasteur pipettes Carl Roth EA65.1
Heat sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Stereotaxic frame David Kopf Model 1900
Stereotaxic electrode holder David Kopf Model 1900
Isoflurane Abbvie B506
Oxygen concentrator Respironix 1020007
Buprenorphine Indivior UK Limited
Electrical shaver Tondeo Eco-XS
Heating pad Thermolux 463265/-67
Surgical clamps Fine Science Tools 18050-28
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009
Sterile cotton wipes Carl Roth EH12.1
Drill Proxxon Micromot 230/E
21G injection needle B. Braun 4657527
Phosphate buffer/phosphate buffered saline
Stereotaxic atlas Elsevier 9.78012E+12
Surgical scissors Fine Science Tools 14094-11
Surgical forceps Fine Science Tools 11272-40
27G injection needles B. Braun 4657705
Vaseline
Dental cement Sun Medical SuperBond T&M
Carprofen Zoetis Rimadyl 50mg/ml
Recording amplifier Intan Technologies C3323
USB acquisition board Intan Technologies C3004
Recording cables Intan Technologies C3216
Electrical commutator Doric lenses HRJ-OE_FC_12_HARW
Acquisition software OpenEphys (www.open-ephys.org) GUI allows platform-independent data acquisition
Computer for data acquisition
Analysis environment Python (www.python.org) allows platform-independent data analysis
Urethane Sigma-Aldrich
Vibratome Leica VT1000
Microscope slides Carl Roth H868.1
Cover slips Carl Roth H878.2
Embedding medium Sigma-Aldrich 81381-50G
Distilled water Millipore Milli Q Table-top machine for the production of distilled water
Tergazyme Alconox Tergazyme

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References

  1. Buzsáki, G., Draguhn, A. Neuronal oscillations in cortical networks. Science. 304 (5679), 1926-1929 (2004).
  2. Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
  3. Benchenane, K., et al. Coherent theta oscillations and reorganization of spike timing in the hippocampal-prefrontal network upon learning. Neuron. 66 (6), 921-936 (2010).
  4. Jadhav, S. P., Kemere, C., German, P. W., Frank, L. M. Awake hippocampal sharp-wave ripples support spatial memory. Science. 336 (6087), 1454-1458 (2012).
  5. Yamamoto, J., Suh, J., Takeuchi, D., Tonegawa, S. Successful execution of working memory linked to synchronized high-frequency gamma oscillations. Cell. 157 (4), 845-857 (2014).
  6. Karalis, N., et al. 4-Hz oscillations synchronize prefrontal-amygdala circuits during fear behavior. Nature Neuroscience. 19 (4), 605-612 (2016).
  7. Khodagholy, D., Gelinas, J. N., Buzsáki, G. Learning-enhanced coupling between ripple oscillations in association cortices and hippocampus. Science. 358 (6361), 369-372 (2017).
  8. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
  9. Mitzdorf, U. Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomena. Physiological Reviews. 65 (1), 37-100 (1985).
  10. Lasztóczi, B., Klausberger, T. Layer-specific GABAergic control of distinct gamma oscillations in the CA1 hippocampus. Neuron. 81 (5), 1126-1139 (2014).
  11. Strüber, M., Sauer, J. -F., Jonas, P., Bartos, M. Distance-dependent inhibition facilitates focality of gamma oscillations in the dentate gyrus. Nature Communications. 8 (1), 758 (2017).
  12. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press, Elsevier. (2007).
  13. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  14. Kajikawa, Y., Schroeder, C. E. How local is the local field potential? Neuron. 72 (5), 847-858 (2011).
  15. Berens, P., Keliris, G. A., Ecker, A. S., Logothetis, N. K., Tolias, A. S. Feature selectivity of the gamma-band of the local field potential in primate primary visual cortex. Frontiers in Neuroscience. 2 (2), 199-207 (2008).
  16. Lastóczi, B., Klausberger, T. Distinct gamma oscillations in the distal dendritic field of the dentate gyrus and the CA1 area of mouse hippocampus. Brain Structure and Function. 222 (7), 3355-3365 (2017).
  17. Nguyen Chi, V., Müller, C., Wolfenstetter, T., Yanovsky, Y., Draguhn, A., Tort, A. B. L., Brankačk, J. Hippocampal respiration-driven rhythm distinct from theta oscillations in awake mice. Journal of Neuroscience. 36 (1), 162-177 (2016).
  18. Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes. Scientific Reports. 7 (1), 2773 (2017).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक १३७ स्थानीय क्षेत्र क्षमता वर्तमान स्रोत घनत्व विश्लेषण dentate गाइरस हिप्पोकैम्पस गामा दोलनों सूचना संसाधन GABAergic ंयूरॉन
चूहों व्यवहार के हिप्पोकैम्पस में स्थानिक प्रतिबंधित दोलनों रिकॉर्डिंग
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Sauer, J. F., Strüber, M.,… More

Sauer, J. F., Strüber, M., Bartos, M. Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice. J. Vis. Exp. (137), e57714, doi:10.3791/57714 (2018).

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