Summary
نقدم هنا، بروتوكولا للمرحلة وتشريح وضع الأنسجة حاسة الشم من الأنواع المورفولوجية . تشريح الأنسجة يمكن استخدامها في وقت لاحق للتحليلات الجزيئية، مثل كمية RT-PCR (عكس النسخ-البلمرة المتسلسل) أو الحمض النووي الريبي التسلسل (رناسيق)، فضلا عن التحليلات في فيفو مثل إيمونوهيستوتشيميستري أو في الموقع التهجين.
Abstract
نظام حاسة الشم المورفولوجية نظام يستخدم على نطاق واسع في بيولوجيا الأعصاب التنموي ونظم علم الأعصاب، وكذلك العصبية والسلوك وتطور السلوكية. بيت المورفولوجية حاسة الشم أنسجة الخلايا العصبية مستقبلات الشم (أورنس) التي كشف الإشارات الكيميائية المتطايرة بالإضافة إلى الخلايا العصبية الحسية الطاقة المائية والحرارية. في هذا البروتوكول، يصف لنا التشريح لتطوير النسيج حاسة الشم الطرفية من الأنواع المورفولوجية الكبار. أولاً نحن تصف كيفية المرحلة واليرقات المورفولوجية ، متبوعاً بتشريح القرص باللوامس من المراحل المبكرة الخوادر، متبوعاً بالتشريح للهوائيات من مراحل منتصف الخوادر والكبار في السن. نعرض أيضا الأساليب التي يمكن أن تستخدم في الأعمال التحضيرية في التقنيات الجزيئية، مثل استخراج الحمض النووي الريبي لبكر قرة أو رناسيق أو إيمونوهيستوتشيميستري. يمكن أيضا تطبيق هذه الأساليب للأنواع المورفولوجية الأخرى بعد يتم تحديد أوقات التنمية الخوادر إبلاغها، وتحسب كل المراحل للشيخوخة المناسبة.
Introduction
نظام حاسة الشم المورفولوجية نظام يستخدم على نطاق واسع في بيولوجيا الأعصاب التنموي ونظم علم الأعصاب، وكذلك العصبية ودراسات السلوك وتطور السلوكية1،2،3، 4. البيت المورفولوجية حاسة الشم أنسجة الخلايا العصبية مستقبلات الشم (أورنس) التي كشف الإشارات الكيميائية المتقلبة بالإضافة إلى5،1،الخلايا العصبية الحسية الطاقة المائية والحرارية6. والهدف العام من هذه المخطوطة شرح كيفية المرحلة وتشريح وضع الأنسجة حاسة الشم الخوادر والكبار في الأنواع المورفولوجية . والأساس المنطقي لهذا الأسلوب لتوليد عينات من مختلف مراحل الخوادر للتحليلات الجزيئية والإنمائية نظام حاسة الشم الطرفية، مثل رناسيق والكمية الرايت-بكر، بالإضافة إلى ذلك في فيفو الأنسجة وسم تقنيات . يمكن أن يكون هذا الأسلوب مفيداً بشكل خاص لتحديد القوى المحركة للملامح النسخي في تطوير نظام حاسة الشم الكبار من الأنواع غيرmelanogaster المورفولوجية ، والتي لا تملك جميع الكواشف المحورة وراثيا لنوع معين من الخلايا التالي والتحليلات. في هذه المخطوطة، نظهر كيفية تشريح أقراص باللوامس وهوائيات من الأنواع المورفولوجية الخوادر والكبار. أولاً، نحن إظهار كيفية تحديد المورفولوجية ح 0 لتشكيل بوباريوم (الإدارة العامة الاتحادية، الخوادر بيضاء أو بريبوباي) لانطلاق التنمية والشيخوخة إبلاغها. وبعد ذلك، نعرض كيفية تشريح أقراص باللوامس والجزء الثالث باللوامس؛ على وجه التحديد، كيف أن ننأى بها عن القرص العين والجزء الثاني باللوامس لنقاء الأنسجة المطلوبة من أجل رناسيق أو RT-تقارير إتمام المشروعات. مراحل melanogaster دال- المبينة في هذا البروتوكول على نحو يتوافق مع القرص باللوامس منقوشة مسبقاً (بريبوباي)، اختيار السلائف من باللوامس القرص (ح 8 APF)، بداية التفريق بين الطرفي أورنس (ح 40 الاتحادية)، و هوائي الكبار. وأخيراً، نعطي أمثلة عن RT-PCR كمي من هوائيات الكبار معزولة باستخدام الأسلوب، و في فيفو إيمونوهيستوتشيميستري. يمكن استخدام هذا الأسلوب لتوليد عينات لتحليل الحمض النووي الريبي/الحمض النووي و immunohistochemistry على تطوير أنسجة حاسة الشم الطرفية من الأنواع المورفولوجية المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
البروتوكول التالي ينسجم مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية التي وضعتها "لجنة أخلاقيات البحوث جامعة ديوك".
1-إعداد الأنسجة والتدريج التنموية لعذراء melanogaster المورفولوجية
- أولاً، تحديد كم عدد الذباب سيكون ضروريا للتشريح. RT-PCR ورناسيق، جمع 100-200 أقراص باللوامس وهوائيات من الأفراد التي ضرورية في مراحل بريبوبال، ح 8 الإدارة العامة الاتحادية، ح 40 الإدارة العامة الاتحادية، والكبار. ل immunohistochemistry، تشريح الفرد 10-20.
- تنظيف جميع المواد، بما في ذلك منصات التشريح والملقط، استخدام مناديل مع 70% EtOH. إذا كانت المواد تشريح لاستخدامها لاستخراج الحمض النووي الريبي وتنظيف كل شيء مع نيوتراليزيرس رناسي وجعل جميع الحلول باستخدام أما نوكلاس خالية أو ثنائي إثيل بيروكاربوناتي (ديبك) المياه المعالجة.
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول منصات تشريح السيليكون بدلاً من الزجاج لتشريح. منصات السيليكون الودية إلى الملقط غرامة فائقة وتشجيع تشريح سريعة وعالية الجودة. - جمع عذراء في ح 0 المرحلة APF/بريبوبال.
- لضمان تنظيم الأكثر دقة، رصد اليرقات في 30 دقيقة لفترات ح 1.
ملاحظة: سوف يرجح أن بوبات تجول اليرقات الطور الثالث في زجاجة متوسطة مزدحمة في غضون ساعات قليلة. - متى اليرقات تصبح غير متحرك ومحاطة بقضية الخوادر ملونة (أبيض تقريبا) خفيفة جداً، تحويلها إلى صغيرة 2-في طبق بتري مع ورقة رطبة بالتصفية.
- تستمر ح 1-2، أحياناً رصد وتحديد ونقل بريبوباي.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، مسح زجاجة الخوادر لكل والسماح لليرقات إلى وضع من أجل ح 2. الخوادر لكل تجمع بعد ح 2 سوف تكون داخل نطاق الإدارة العامة الاتحادية ح 2 0.
- لضمان تنظيم الأكثر دقة، رصد اليرقات في 30 دقيقة لفترات ح 1.
- فورا الانتقال إلى الخطوة 3.1 تشريح القرص باللوامس بريبوبال لمرحلة APF ح 0. إذا كان بريبوبا يحتاج إلى أن يكون الذين تتراوح أعمارهم بين، جمع لهم في طبق وتغطي الطبق ومكان فيلم بارافين حول الحواف تمنع جفاف ومكان طبق بيتري عند 25 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن أن يكون عمر الخوادر الآن إلى اكلوسيون. - الخوادر التي تم جمعها في مجموعة ح 2، عمر بريبوباي ح 2 أقل من العمر المطلوب لبغية ضمان أن الخوادر لا الفائض.
- استخدام الملقط فائقة غرامة (دومون 55) كما الأنسجة صغيرة جداً وهشة.
2-الأنسجة إعداد والتدريج التنموية من عذراء من الأنواع المورفولوجية الأخرى
- لتحديد طول تطور الخوادر في الأنواع المورفولوجية الأخرى، وضع العينات في درجة الحرارة المثلى، وتسجيل التواريخ عندما يلاحظ بريبوباي وفرزها في قنينة جديدة وتسجيل عدد الأيام من بريبوبا إلى مرحلة البلوغ.
- سجل نسبة الوقت للتنمية الخوادر للأنواع غيرميلانوجاستير و ميلانوجاستير. مضاعفة نسبة الوقت التنموية بعدد الساعات المستخدمة لتنظيم ميلانوجاستير للحصول على عدد الساعات الأنواع غيرميلانوجاستير في السن.
3-تشريح "القرص باللوامس الخوادر" melanogaster دال
ملاحظة: جميع الأوقات الشيخوخة والبروتوكولات تشريح موصوفة ل melanogaster المورفولوجية. إدخال تعديل على البروتوكول الشيخوخة استناداً إلى النقاط الزمنية الإنمائية إبلاغها لجميع الأنواع الأخرى، سوف تكون المطلوبة، كما هو موضح أعلاه.
- لتشريح القرص باللوامس الخوادر، جمع 50-100 0-2 h أو h 6-8 الخوادر القديمة باستخدام ملعقة ووضعها على لوح تشريح.
- "الماصة؛" 150 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي العزلة الحل في رناسي الحرة 1.5 مل [ميكروفوج] الأنبوبة باستخدام ماصة 200 ميليلتر ووضع الأنبوب على الجليد.
- تشريح الخوادر في 150-200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x (الفوسفات مخزنة المالحة، خالية من نوكلاس). ضع عدة قطرات من برنامج تلفزيوني (150-200 ميليلتر كل قطره) على لوح التشريح.
- على لوح التشريح، ضع 0-ح 2 أو 6-8 ح سن الخوادر (عذراء واحدة كل قطره ماء) أن تشريح في واحدة من 1 × قطرات PBS. استخدام الملقط في يد واحدة لتحقيق الاستقرار في الجسم.
- 0-ح 2 سن الخوادر، استخدام الملقط في ناحية أخرى، عقد في الجزء الأمامي الأكثر (هوكس الفم) من بريبوبا وسحب لفضح العقول وأقراص إيماجينال شاسيه الخوادر الأمامي.
- الخوادر APF ح 8، أولاً بلطف قشر خارج القضية الخوادر من الربع الأمامي أكثر من عذراء، تعريض رأسه داخل كيس الغشاء الذي يحيط الجسم.
ملاحظة: الجسم، وفي هذه المرحلة، تبدو مثل يرقة تردي. - إزالة الرأس في الرقبة المشتركة.
ملاحظة: وهذا ما يضمن أن أقراص باللوامس لن تكون فقدت، في هذه المرحلة ترتبط أساسا بالفصوص البصري للدماغ. - نقل الأنسجة مع العقول وأقراص إيماجينال إلى آخر 1 × الحبرية PBS باستخدام الملقط أو ماصة 20-ميليلتر.
- تحديد القرص العين باللوامس متصل بالدماغ في الفصوص البصرية. استخدام الملقط، قطع اتصال القرص باللوامس العين من الدماغ، وقضية الخوادر. أنه نقل إلى 1 جديدة x الحبرية PBS باستخدام الملقط أو ماصة 20-ميليلتر.
ملاحظة: القرص العين باللوامس بريبوبال نسيج مسطح. ومع ذلك، قبل الخوادر ح 8، أقراص العين يتم استدارة الحجامة أقراص باللوامس، الذي يجلس عرفت الدماغ المركزي. - باستخدام الملقط، قطع الأنسجة في موقع اتصال بين العين والقرص باللوامس. استخدام ماصة 20-ميليلتر نقل تشريح الأنسجة بلطف إلى الكاشف الحل عزل الحمض النووي الريبي. تقليل كمية السائل نقل بواسطة بيبيتينج مبلغاً صغيراً قدر الإمكان.
- كرر حتى قد تم تشريح جميع الخوادر.
4-تشريح melanogaster دال- منتصف-الخوادر و "هوائيات الكبار"
ملاحظة: قبل 40 ح الإدارة العامة الاتحادية، أغلبية التحول الكامل، وهياكل الكبار أصبحت واضحة، ولكن لا تزال بيضاء ولا يوصف. عند هذه النقطة من الوقت التنموية، الهوائي الكبار قد اتخذت شكلها النهائي حتى الآن لا يزال يتسم بالشفافية والغالبية مستقبلات الشم، باستثناء عدد قليل، لم تكن قد بدأت التعبير.
- لتشريح باللوامس الخوادر، جمع 50-100 بريبوباي كما هو موضح في الخطوة 1 ومنهم لسن 40 ح عند 25 درجة مئوية.
- بيبيت 150 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي العزلة الحل في ميكروسينتريفوجي 1.5 مل رناسي حرة الأنبوبة باستخدام بيبيت 200 ميليلتر ووضع الأنبوب على الجليد.
- على لوح التشريح، ضع عذراء أن تشريح إلى واحد (1) x قطرات PBS. استخدام الملقط في يد واحدة لتحقيق الاستقرار في الجسم. استخدام الملقط في ناحية أخرى، بلطف تقشر القضية الخوادر من الربع الأمامي أكثر من عذراء، تعريض رأسه داخل كيس الغشاء الذي يحيط الجسم.
- استخدام الملقط، بعناية قطع الرأس عن باقي الجسم الخوادر بالضغط بالجسم مع مجموعة واحدة من الملقط وتمزيق الرأس في الرقبة مشتركة مع مجموعة أخرى من الملقط. بلطف نقل الرأس إلى آخر 1 × الحبرية PBS باستخدام الملقط. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً لتنظيف محتويات الرأس (الدماغ، إلخ) للحصول على غشاء واضحة التي استخدمت لتطويق الرأس المورفولوجية النامي.
ملاحظة: في 40-50 ح الإدارة العامة الاتحادية، ترتبط الهوائيات للقسم الأمامي معظم الغشاء. وسوف تصبح الظاهر لتشريح عندما يتم مسح محتويات الرأس مع بيبيتينج. - استخدام الملقط، قطع هوائيات الخوادر من الغشاء. قم بفصل الجزء 2nd الهوائي من 3rd استخدام الملقط لشريحة القطاعي المشترك، كما سيضم فقط الجزء 3rd الخلايا العصبية مستقبلات الشم.
- استخدام ماصة 20-ميليلتر نقل تشريح الأنسجة بلطف إلى الكاشف الحل عزل الحمض النووي الريبي. تقليل كمية السائل نقل بواسطة بيبيتينج مبلغاً صغيراً قدر الإمكان. كرر حتى قد تم تشريح جميع الخوادر.
- لتشريح باللوامس الكبار، جمع ما يقرب من 50 البالغين ومنهم لسن اكلوسيون بعد أسبوع.
ملاحظة: التعبير عن الجينات مستقبلات الشم وجينات أخرى ذروة أسبوع بعد اكلوسيون. تتراوح أعمارهم بين الكبار لمدة أسبوع للتأكد من الجينات ذات الصلة بيولوجيا مع النصوص وفرة منخفضة الارتفاع فوق عتبة الكشف. - لاستخراج الحمض النووي الريبي، تشريح الذباب في حين أنهم ما زالوا أحياء على لوح2 CO. التعامل مع لوحة المفاتيح2 CO مع مثبطات رناسي. لتصوير [كنفوكل]، تشريح الذباب على لوح تشريح في 1 × برنامج تلفزيوني أو برنامج تلفزيوني + 0.2% تريتون.
- أولاً، وضع الكبار على النوم على لوح محطة2 CO تحت نطاق التشريح. على منصة محطة2 أول أكسيد الكربون، باستخدام الملقط في يد واحدة لتحقيق الاستقرار في الجسم، واستخدام الملقط في اليد الأخرى بلطف سحب/رشة خارج باللوامس الجزء الثالث من الدورة الثانية.
- نقل الهوائيات في حل عزل الحمض النووي الريبي، استخدام الملقط لوضع الهوائيات مباشرة في السائل. كرر حتى قد تم تشريح جميع البالغين.
ملاحظة: تأكد من أن الهوائيات مغمورة في محلول عزل الحمض النووي الريبي. قد تصبح عالقاً الهوائيات على جانب الأنبوب. هذا سوف يتسبب تدهور المتزايد للجيش الملكي النيبالي، الحد من كمية ونوعية الجيش الملكي النيبالي. - مباشرة الشروع في استخراج الحمض النووي الريبي أو وضع الأنبوب في-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
5-الجيش الملكي النيبالي في معزل عن تشريح الأنسجة
- إزالة جميع العينات من التخزين-80 درجة مئوية وذوبان الجليد لهم على الجليد.
- باختصار تدور (5-6 ق، ~ 6,000 س ز) كل عينة لجمع المواد في الجزء السفلي من الأنبوب.
- طحن كل عينة باستخدام مدقة بلاستيك يعقم ومحرك كهربائي لمدة 10 ق على الجليد.
- كرر الخطوات 5-2 و 5.3 4.
- القيام باستخراج الحمض النووي الريبي استخدام مجموعات المتاحة تجارياً وعقب بروتوكولات الشركة المصنعة لعائد أمثل.
- أداء qRT-PCR باستخدام الكواشف المتوفرة تجارياً والإشعال محددة ضد الجينات من اهتمام وعقب البروتوكولات الخاص بالشركة المصنعة.
- الاضطلاع بجميع ردود الفعل بكر استخدام الشروط التالية: تمسخ 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها دورات 40 من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 s، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ق.
ملاحظة: أزواج التمهيدي للجينات وتراجع و الديمقراطية هي المدرجة في الجدول 1، ويتم سرد كبسولة تفجير للجينات مستقبلات الشم في هيوستن CE et al. 8.
- الاضطلاع بجميع ردود الفعل بكر استخدام الشروط التالية: تمسخ 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها دورات 40 من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 s، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ق.
6-تثبيت الأقراص باللوامس الخوادر وهوائيات إيمونوهيستوتشيميستري
ملاحظة: إصلاح الأنسجة في دفعات من 10-20 الأفراد لضمان الأنسجة ثابتة لنفس المقدار من الوقت. تصغير مقدار الوقت العينات البقاء في PBT (برنامج تلفزيوني مع المنظفات) قبل نقلهم إلى مثبت تحقيق أقصى قدر من السلامة للأنسجة.
- جمع أقراص باللوامس تشريح أو هوائيات الخوادر في أنبوب بكر 200 ميليلتر تحتوي على 200 ميليلتر من 0.2% PBT على الجليد للمحافظة على سلامة الأنسجة، وتجنب العينة من الالتصاق بالجدار من بكر 200 ميليلتر الأنابيب التي ستؤدي إلى تثبيت غير مكتملة.
ملاحظة: هوائيات الخوادر وأقراص باللوامس يمكن أن يكون صعباً أن نرى أنها شفافة تماما. من المستحسن استخدام نطاق تشريح لجميع خطوات الغسيل للحيلولة دون فقدان أي من الأنسجة. بدلاً من ذلك، قد تكون لوحات تيرازاكي 96-جيدا المصبوغة لتعقب أفضل الأنسجة ويستخدم لتثبيت البرنامج. - إصلاح القرص باللوامس تشريح وعينات باللوامس الخوادر في حوالي 200 ميليلتر من 4 في المائة من منهاج عمل بيجين (بارافورمالدهيد) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لهذا وبعد ذلك تبقى الخطوات، الأنابيب مع العينات على نوتاتور لخلط العينات في الحل بشكل صحيح. التقدم إلى الخطوة 6.7.
- للهوائي الكبار، وتشريح الرأس كله أولاً وإصلاحه في حوالي 200 ميليلتر من 4% (بارافورمالدهيد) من منهاج عمل بيجين ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- أغسل x 3 مع 200 ميليلتر من 0.2% PBT لمدة 10 دقائق. تبقى العينات على نوتاتور خلال الاحتضان.
- أن نعود إلى مجهر تشريح لتشريح أدق الجزء الثاني المتعلق باللوامس من الرؤساء الثابتة. استخدام الملقط لتحقيق الاستقرار في الرأس، بلطف سحب/رشة خارج باللوامس الجزء الثالث من الدورة الثانية.
- نقل قطاعات باللوامس الثالث تشريح إلى حوالي 200 ميليلتر من 4% منهاج العمل (بارافورمالدهيد) وإصلاحها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- أغسل x 3 مع 200 ميليلتر من 0.2% PBT لمدة 10 دقائق. تبقى العينات على نوتاتور خلال الاحتضان.
- تخزين العينات في 4 درجات مئوية أو تواصل مباشرة مع كامل جبل إيمونوهيستوتشيميستري.
ملاحظة: قد تتغير كفاءة تلطيخ عندما يتم استخدامه الضد. ينبغي أن يكون هذا الأسلوب الأجسام المضادة المناسبة لأقل علامات البروتين وفيرة أو الأضعف. ومع ذلك، في بعض الأحيان، قد يتطلب الأمثل للبروتوكول (الهوية أو مقدار مثبت أو وقت التثبيت).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تشريح الأنسجة حاسة الشم النامية يمكن استخدامها لاستخراج الحمض النووي الريبي تليها RT-PCR لتقييم التعبير الجيني أو يمكن اتخاذها من خلال بروتوكولات immunohistochemistry لتحديد نمط التعبير، والتعريب الخلوية الفرعية من جينات الفائدة. في هذا القسم، نقدم نتائج تمثيلية من أما بروتوكول. الشكل رقم 1 هو الممثل الكمية RT-PCR عرض النسخ من مستقبلات سطح الخلية والجينات مستقبلات الشم في البرية من نوع هوائيات الكبار. ويبين الشكل 2 ح 6-8 والذباب 12 h الإدارة العامة الاتحادية القرص باللوامس ستينينجس على Rn-اجفب المعدلة وراثيا باستخدام مكافحة-التجارة والنقل (1: 1000) والأجسام المضادة لمين (1: 100) (الشكل 2ألف و 2 باء). Rn-اجفب تسميات مناطق معينة داخل القرص باللوامس خلال المراحل المبكرة الخوادر. كما نعرض ح 40 APF مكافحة باللوامس الخوادر-بروتينات فلورية خضراء تلطيخ جسم الذباب وراثيا UAS Or67d-GAL4-CD8GFP ، وتلطيخ جسم مكافحة باللوامس الكبار-الصفحة (1: 100) من أورنس (الشكل 2). يمكن أيضا الاطلاع على أمثلة أخرى في الأدب7،،من89،10.
الشكل 1 . الكمية RT-PCR من عينات الحمض النووي الريبي باللوامس الكبار البرية من نوع لجينات مختلفة. هذه اللوحات إظهار النتائج RT-PCR الكمي (A) DIP-ألفا، تراجع-إيتا، dpr5، dpr8، كوج، بيتيييب (للتمهيدي أزواج انظر الجدول 1)، و (ب) حاسة الشم ومستقبلات إيونوتروبيك (أو/الأشعة تحت الحمراء) الجينات من الكبار عينات الحمض النووي الريبي باللوامس. وتظهر أشرطة الخطأ خطأ معياري يعني (SEM). أو/الأشعة تحت الحمراء الجينات هي وفرة منخفضة الكشف لا يزال يمكن الكشف عنها بواسطة PCR قرت. وقد تم تحليل التعبير عن كل الجينات في ثلاث نسخ. استخدمت قيم التصوير المقطعي لحساب عوامل إضعاف لكل الجينات استناداً إلى المنحنيات القياسية التي تم إنشاؤها لكل الجينات. ثم تم تطبيع عوامل إضعاف لكل الجينات متوسط في التعبير عن جميع الجينات قياسها كما هو موضح قبل8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . إيمونوهيستوتشيميستري باستخدام الأجسام المضادة المختلفة في تطوير أنسجة حاسة الشم. إظهار هذه الألواح المضادة-التجارة والنقل (الأخضر) ومكافحة لمين (الأحمر) ستينينجس جسم على أقراص باللوامس الخوادر (A) ح 6 الإدارة العامة الاتحادية و (ب) 12 h الإدارة العامة الاتحادية أقراص باللوامس الخوادر. (ج) هذا الفريق يظهر ح 40 APF الهوائي من Or67d GAL4 UAS-CD8GFP الوراثي ملطخة بأرنب الأجسام المضادة-التجارة والنقل (أخضر). (د) يظهر هذا الفريق الكبار هوائيات ملطخة بالأجسام المضادة-CD2، الذي تسمية أورنس Or47b-CD2 الإيجابية (أرجواني). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| التمهيدي إلى الأمام | عكس التمهيدي | طول |
| كجاجاجاجتاتجاجكا | جاجتجكاكاكتاجكجت | 143 |
| كجكجاتكجتجتجتكاجتا | تجتكجاتاجكجتجاككتجا | 129 |
| أجاجتجاكجتجاجتاكا | كاتكاتجتككتكجتجاككج | 146 |
| تاجاجتككجاجكاجكاجاتج | جتكاجاتكجاجتجتككجك | 104 |
| جكجكتاجتاجكاجاكج | جككاجتكتجتتجتجاج | 215 |
| تاجاكككتاجكجكككتكت | أججاجاتجكجكتتجاجاك | 129 |
الجدول 1. قائمة من [بكر] كبسولة تفجير المستخدمة في قرة-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول مورد مفيد لمختبرات المهتمة في تحديد البرامج الوراثية والنسخي العاملة في تطوير أنسجة حاسة الشم المورفولوجية ، فضلا عن إجراء تحليل مقارن لهذه البرامج عبر المورفولوجية الأنواع. أنها مفيدة بشكل خاص إذا كانت هناك حاجة ملامح نظم المستوى النسخي من مراحل إنمائية مختلفة تمهيدي للدراسات المستقبلية. البروتوكول هو موضح هنا يوضح كيفية المرحلة وعزل الأنسجة حاسة الشم من المورفولوجية للحصول على عينات من أربع مراحل رئيسية لتطوير نظام حاسة الشم من قبل الزخرفة للتفريق بين طرفية، لاستخدامها في تطوير الدراسات الجزيئية والمناعية النسيجي. تشريح المورفولوجية أقراص باللوامس والهوائيات في مراحل مختلفة من مراحل الخوادر يمكن أن يستخدمها لتحديد ملامح التعبير الجيني أثناء تطوير نظام حاسة الشم على مستوى النظم بتسلسل الحمض النووي الريبي، أو على مستوى الجينات الفردية RT-PCR الكمي. يمكن أيضا استخدام عينات التهجين إيمونوهيستوتشيميستري و في الموقع لتحديد أنماط في فيفو التعبير الجيني الأنسجة على حدة. ميزة إضافية لهذا البروتوكول أنه يمكن كذلك عينات تشريح ينتابها استخدام الأساليب القياسية، وفرز القوات المسلحة الكونغولية للحصول على عدد سكان خلوية المنقي (أو خلايا مفردة) للخلية المحددة بنوع التحليلات الجزيئية، مثل الكمية RT-PCR أو رناسيق.
على الرغم من أن البروتوكول يوضح تشريح أقراص باللوامس وهوائيات من الخوادر (الساعة 0 h/بريبوبا وح 8 و 40 ح APF) ومراحل الكبار، يمكن تكييفها لنقاط الخوادر مرة أخرى. كما تجدر الإشارة إلى أن تعلم تشريح هذه تستغرق وقتاً والممارسة. ينبغي أن يتمكن خبير تشريح عينات 50 ساعة. من المهم أن لا التغطية الخوادر. ولذلك، ساعة قبل البدء بتشريح، تكفل لا الخوادر كبار السن المطلوب. تشريح يمكن أن يستغرق وقتاً لتعلم، حتى فترة الممارسة لكل مرحلة مطلوب قبل البدء بالتجارب. تشريح تصبح أكثر صعوبة من 9-12 ح الاتحادية بسبب التغييرات الشكلية. فمن الممكن لفرز الخوادر حسب العمر عند جمع بريبوباي (بلون الجسم، مع الألوان الداكنة يجري كبار السن). الفرز في البداية بريبوباي يسمح للتشريح من أجل منع أوفيراجينج من العمر.
يمكن تطبيق البروتوكول الموصوفة أعلاه إلى غيرها من الأنواع المورفولوجية . التوقيت لتشريح الخوادر من الأنواع الأخرى يمكن أن تعتمد على نسبة تطور الخوادر من نوع معين عند 25 درجة مئوية إلى ميلانوجاستير د وعلى الملاحظات المقارنة هوائيات/باللوامس القرص مورفولوجيا أثناء تشريح، مع إعطاء الأولوية للاعتبارات الشكلية تكون متطابقة قدر الإمكان. melanogaster المورفولوجية، يأخذ مرحلة الخوادر حوالي 4 أيام. سيتشيليا دال و دال-قائمة التدريج الإنمائية الخوادر يشبه melanogaster دال؛ بيد أن التنمية الخوادر فيريليس دال- هو 1.3 × أطول11،12. عندما يتم إعداد الأنواع الأخرى للتشريح، التدريج ينبغي أن تستند كل توقيت فترة الخوادر والملاحظات المقارنة للهوائيات الخاصة بمرحلة باللوامس القرص مورفولوجيا، مع تشابه المورفولوجية يجري أعلى أولوية. أولاً، تحديد الأمثل في التعامل مع درجة الحرارة للأنواع التي تهمك. العديد من الأنواع التي تنمو جيدا عند 25 درجة مئوية، ولكن يمكن الحصول على معلومات مفصلة عن ظروف الصيانة من مركز "جامعة كاليفورنيا سان دييغو" المورفولوجية أنواع الأسهم.
الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول هي بالتدريج الصحيح والسليم تشريح الأنسجة للاهتمام بإعداد كافية من مختلف الأنواع. مرة هذه في المكان، هذا البروتوكول يوفر طريقة فعالة لجمع الأنسجة لهذه التحليلات ويمكن تكييفه عمليا أي أنسجة القرص imaginal النامية خلال المراحل الخوادر في أي الأنواع المورفولوجية .
واحد الحد من هذا البروتوكول أنه لا يوفر العينات الخاصة بنوع الخلية. ويتطلب فهم أكثر تفصيلاً لوظيفة الخلوية ومورفولوجيا خلية التنميط للنسخ على مستوى نظم، بالإضافة إلى الإجراءات الجزيئية القياسية مثل RT-PCR الكمي أو إيمونوهيستوتشيميستري نوع معين. التنميط الخلية المحددة بنوع كان صعباً، لا سيما نظراً لعدم وجود خلية نوع معين مراسل الوراثي في الأنواع غيرميلانوجاستير . مع التقدم الحالي في التنميط الخلوية، الوراثي، وكريسبر-Cas9 بوساطة الجينوم التحرير في الأنواع غيرميلانوجاستير ، ومن الممكن الآن تسمية وفرز الخلايا المفردة التي تهم الشخصية النسخ13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة بمنحه من "مؤسسة العلوم الوطنية" إلى Pelin جيم فولكان (ديب-1457690).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate-buffered Saline | Gibco | 70011-044 | Dilute to 1X in RNase free water |
| CO2 tank | Air Gas | CD R200 | |
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA isolation solutions |
| Dissecting Microscope | |||
| Small bucket with ice | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| 1.7 mL Microfuge tubes | Purchase nuclease free for best results | ||
| 0.2 mL PCR tubes | |||
| Paraformaldehyde powder | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS |
| 2" petri dishes | |||
| 55mm filter paper | Whatman | 1001-055 | Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist |
| 25 C incubator | |||
| deionized H2O | Purchase nuclease free or treat with DEPC | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers. | |
| MicroWell Mini Trays with lids | Nunc | 438733 | Lids can be used to make silicone dissection pads |
| Rabbit anti-GFP antibody | MBL international corpor | PM005 | primary antibody |
| Mouse anti RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | primary antibody |
| ADL195 (anti lamin, mouse) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | primary antibody |
| Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Secondary antibody |
| Cy3 Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | Secondary antibody |
| Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | CALBIOCHEM | 648463 | detergent |
| Lab Rotator | Thermo scientific | Rotator | |
| Nuclease Free Water | Growcells.com | NUPW-0125 | Water |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | For cleaning dissection supplies |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | Reverse Transcriptase |
| QIAshredder (50) | RNA extraction | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) | RNA extraction | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | qPCR | NEB | M0541S |
References
- Barish, S., Volkan, P. C. Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).
- Pan, J. W., Volkan, P. C. Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system. Cell and Developmental Biology. 2, 130 (2013).
- Ramdya, P., Benton, R. Evolving olfactory systems on the fly. Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Knecht, Z. A., et al. Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila. eLife. 5, 44-60 (2016).
- Enjin, A., et al. Humidity sensing in Drosophila. Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).
- Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).
- Hueston, C. E., et al. Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons. PLoS Biology. 14 (4), 1002443 (2016).
- Li, Q., et al. Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity. Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).
- Li, Q., et al. A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity. PLoS Genetics. 12 (1), 1005780 (2016).
- Pan, J. W., et al. Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species. Scientific Reports. 7 (1), 8804 (2017).
- Pan, J. W., et al. Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila. Fly. 11 (4), 239-252 (2017).
- Stern, D. L., et al. Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).
