Summary
الفلورسنت النهج القائم على البروتين لرصد المستجيبة التي تفرزها البكتيريا داخل الخلايا المضيفة صعبة. وهذا بسبب عدم التوافق بين نظام إفراز النوع الثالث والبروتينات الفلورية. وهنا، يستخدم نظام تقسيم أمثل للتجارة والنقل سوبيرفولدير للتصور المستجيبة التي تفرزها البكتيريا داخل الخلية النباتية المضيف.
Abstract
تفرز البكتيريا، واحدة من أهم وكلاء المسببة للأمراض النباتية المختلفة، مجموعة من البروتينات المستجيب في الخلية النباتية المضيف لتخريب مصنع الجهاز المناعي. أثناء الإصابة بتسليم هيولى المستجيبة إلى سيتوسول المضيف عن طريق نوع نظام إفراز الثالث (T3SS). بعد الولادة في الخلية النباتية، يستهدف effector(s) compartment(s) محددة لتعديل عمليات الخلية المضيفة للبقاء على قيد الحياة والنسخ المتماثل لمسببات المرض. على الرغم من أن هناك بعض الأبحاث في التعريب سوبسيلولار المستجيب البروتينات في الخلايا المضيفة لفهم وظيفتها في القدرة الإمراضية باستخدام البروتينات الفلورية، التحقيق في ديناميات المستجيبة حقن مباشرة من البكتيريا وقد تم الطعن نظراً لعدم التوافق بين T3SS والبروتينات الفلورية.
هنا، يمكننا وصف أسلوبنا الأخيرة سوبيرفولدير الأمثل تقسيم نظام البروتينات الفلورية الخضراء (سفجفبالأراضي الفلسطينية المحتلة) لتصور توطين المستجيبة تسليمها عبر T3SS البكتيرية في الخلية المضيفة. SfGFP11 (11th β-حبلا من سفجفب)-يمكن تجميع كلمات المستجيب ويفرز عن طريق T3SS مع بادئة (1-10ال β-حبلا من سفجفب) عضية محددة تستهدفالأراضي الفلسطينية المحتلة sfGFP1-10 للانبعاثات fluorescence في الموقع. يوفر هذا البروتوكول إجراء لتصور إشارة الأسفار المعاد تشكيلها سفجفب مع بروتين المستجيب من Pseudomonas syringae في عضية خاصة في النباتات نبات و بينثاميانا نيكوتيانا .
Introduction
النباتات هي الكائنات الحية لاطئة التي تواجهها العديد من مسببات الأمراض الغازية بما في ذلك البكتيريا، والفطريات، والفيروسات والحشرات والديدان الخيطية طوال دورة حياتها. بين فيتوباثوجينس، تصيب الغرام مسببات الأمراض البكتيرية مثل Pseudomonas spp. ورالستونيا spp.، مصانعها المضيف عن طريق إدخال عن طريق الجروح أو الفتحات الطبيعية، مثل الثغور وهيداثودي1. لاستعمار النباتات المضيفة بنجاح، وقد تطورت مسببات الأمراض البكتيرية تطوير مجموعة متنوعة من عوامل الفوعة2. عندما تغزو البكتيريا نبات مضيف، أنها تضخ سلسلة من البروتينات الفوعة – المعروفة باسم المستجيبة — مباشرة في الخلايا النباتية لتعزيز تلك القدرة الإمراضية. قمع هذه المستجيبة أو تعدل الحصانة الفطرية النباتية، والتعامل مع العمليات الخلوية المضيف يؤدي إلى بقاء البكتيرية3.
أساسا استخدام البكتيريا المسببة للأمراض T3SS لتوصيل البروتينات المستجيب مباشرة إلى الخلايا المضيفة4. يشبه T3SS حقنه جزيئية مع إبرة مثل قناة الاتصال من هيكل بروتين سقالة عبر الأغشية البكتيرية الخارجية والداخلية للحقن من الخلية المضيفة5. إليه إفراز T3SS بوساطة المستجيب (T3E) هذا مصانة جيدا في مختلف مسببات الأمراض البكتيرية الغرام من المصنع، فضلا عن الإنسان. أحد مسببات الأمراض النباتية الممثل، P. syringae الكهروضوئية. الطماطم DC3000 المركز المسخ الذي عادة T3SS معيبة، قيدت نمو النباتات احتمالاً بسبب العجز هذا المسخ لقمع كامل الحصانة (عن طريق حقن بروتينات المستجيب) مصنع6. عند إزفاء إلى الخلايا المضيفة، تستهدف المستجيبة مختلف البروتينات المضيفة التي تعتبر مهمة لنظام الخلية المضيفة، بما في ذلك مصنع الدفاع الردود والنسخ الجيني وموت الخلية، بروتوزوم، والاتجار حويصلة وهرمون مسارات7 , 8 , 9 , 10-ولذلك، تتبع للتعريب الخلوية البروتينات المستجيب في الخلايا المضيفة هدفا جذاباً لفهم وظائفها فيما يتعلق بتعديل الحصانة النبات.
استخدمت معظم الدراسات الترجمة T3Es المتبعة-بوساطة overexpression مع بروتين الأسفار كبيرة في مصنع المضيف9. ومع ذلك، ثبت الأسلوب تعبير مغايرة للجينات التي يتم تقديمها في الأنواع الأخرى لتكون أحياناً غير وظيفية أو سوء مترجمة11،،من1213. وبالإضافة إلى ذلك، كشفت عدة دراسات أن المستجيبة البكتيرية الخضوع للتعديل لاستهداف السليم في المضيف الخلايا14،15،،من1617. ولذلك، أعرب عابر المستجيبة في سيتوسول مصنع الخلايا قد لا تكون متطابقة وظيفيا أو كمياً إلى المستجيبة التي يتم تسليمها من T3SS عند الممرض العدوى18. وعلاوة على ذلك، قد تعطل انصهار العلامات الفلورية كبيرة للبروتينات المستجيب المستجيب المناسب التسليم والتصور18،19. ولذلك، قد لا تعكس هذه النهج الاعتداء الدالة T3E التعريب الأصلي من المستجيبة يفرز T3SS تماما.
ويتألف من 11-الذين تقطعت بهم السبل β-البرميل أرفق حبلا مركزية التي تشمل chromophore20بروتين فلوري أخضر (التجارة والنقل). والدو et al. وأفادت نظام تقسيم رواية-التجارة والنقل التي تتكون من عنصر صغير (β بروتينات فلورية خضراء حبلا 11؛ GFP11) وجزء مكمل كبير (بروتينات فلورية خضراء حبلا β 1-10؛ GFP1-10)21. الشظايا لا فلوريس بحد ذاتها ولكن فلوريس على ارتباطهم الذاتي عندما تكون كل الأجزاء على مقربة من بعضها مع بعض. لتعظيم كفاءة قابلة للطي البروتين، وضعت متغيرات قابلة للطي قوية التجارة والنقل، أي، سفجفب، وسفجفبالأراضي الفلسطينية المحتلة، في وقت لاحق لتقسيم بروتينات فلورية خضراء نظام20،،من2122. في الآونة الأخيرة، واحد من الأحماض الأمينية تحور المتغيرات من sfGFP1-10الأرض الفلسطينية المحتلة-sfYFP1-10الأراضي الفلسطينية المحتلة و sfCFP1-10الأرض الفلسطينية المحتلة-التي يمكن إعادة تشكيل مع بلغة sfGFP11، وإظهار fluorescence السماوي والأصفر على التوالي، والذي تم إنشاؤه23 . وعلاوة على ذلك، يمكن تقسيم سفتشيري، مشتق مشري، إلى شظايا sfCherry1 10 و sfCherry11 بنفس الطريقة سفجفب23.
هذا النظام قد تم تكييفه لوسم وتعقب المستجيبة T3SS في خلايا هيلا أثناء الإصابة باستخدام المستجيبة من السالمونيلا24. بيد أنه كان سابقا لا الأمثل لنظام المضيف الممرض النبات الجرثومي. في الآونة الأخيرة، ونحن الأمثل نظام التجارة والنقل انقسام استناداً إلى sfGFP1-10 تحسينالأراضي الفلسطينية المحتلة لمراقبة توطين T3Es سلمت من P. syringae داخل الخلايا النباتية25سوبسيلولار. تيسيرا لدراسات الترجمة T3Es إلى الأقسام المختلفة سوبسيلولار في الخلايا النباتية، ومجموعة من المعدلة وراثيا التمويل نبات نباتات تم إنشاؤها للتعبير عنالأراضي الفلسطينية المحتلة في المقصورات المختلفة سوبسيلولار sfGFP1-10 25. وعلاوة على ذلك، والبلازميدات تحمل مجموعة متنوعة من عضية-استهدفت sfGFP1 10الأراضي الفلسطينية المحتلة المتبعة-كما تم إنشاؤها بوساطة overexpression عابرة وناقلات معلم sfGFP11 لإيصال المستجيب على أساس T3SS. يمكن الحصول على بذور مختلف خطوط نبات المعدلة وراثيا ووالبلازميدات للتعبير عن T3Es الفائدة من المصادر المذكورة في الجدول للمواد26،27.
في بروتوكول التالية، ويصف لنا نظام محسن لرصد ديناميات المستجيبة ألقاه البكتيريا في الخلايا المضيفة باستخدام نظام سفجفب سبليت. عدوى نباتات معربا عن sfGFP1 10الأراضي الفلسطينية المحتلة مع المعدلة وراثيا Pseudomonas يحمل بلازميد المؤتلف sfGFP11 النتائج في عملية تسليم للمستجيب معلم sfGFP11 من Pseudomonas في الخلية المضيفة. ونتيجة لذلك، هذه البروتينات يتم تشكيلها وترانسلوكاتي إلى compartment(s) مستهدفة محددة المستجيب. Pseudomonas syringae الكهروضوئية. الطماطم سلالة CUCPB5500 التي يتم حذف 18 المستجيبة، واستخدمت لأنه أظهر هذه السلالة منخفضة أو لا موت الخلية في التمويل أ و بينثاميانا أق28. ومع ذلك، كافة المواد والخطوات الموضحة هنا يمكن استبدال أو تعديلها لتكييف منظومة سفجفب سبليت للتحقيق من الأسئلة البيولوجية أو التحسين في الظروف المختبرية معينة أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في درجة حرارة الغرفة، ما لم ينص على خلاف ذلك.
1-إعداد المواد النباتية (4 أسابيع)
- إعداد للنباتات بينثاميانا أ.
- بذر بذور بينثاميانا أ 2 على سطح التربة من كل وعاء وتغطي صينية بقبة بلاستيكية وتسمح للبذور على الإنبات في 25 درجة مئوية ورطوبة 60% نمو الدائرة مع دورة 16/8-ح الضوء/الظلام كبيرة.
- وبعد أسبوعين، اقتطاف وتجاهل الشتلات الأصغر في كل وعاء والاستمرار في زراعة النباتات تحت نفس ظروف النمو كما يطبق على الإنبات في خطوة 1.1.1. إضافة 1 لتر مياه كل علبة كل يومين.
ملاحظة: قد تختلف ظروف نمو النباتات عبر مختبرات. ولذلك، يتبع البروتوكول سقي العادية تنمو النباتات في حالة صحية. - في غضون أسبوع، نقل النباتات إلى علبة جديدة وترتيبها مع وجود مساحة كافية لتحقيق المزيد من النمو. الحفاظ على نمو النباتات حسب الشروط الموضحة في الخطوة 1.1.1 حتى أنهم على استعداد لأن تسللت إلى 4 أسابيع من العمر.
ملاحظة: قد يختلف نمو النبات تبعاً لحالة النمو عبر مختبرات. عادة ما نجد أن 4-الأسبوع-القديم النباتات بينثاميانا أ تحمل حوالي ستة أوراق.
- إعداد للنباتات المعدلة وراثيا ألف-التمويل
- الرجوع إلى الجدول للمواد وتأمر ببذور نبات المحورة وراثيا.
- نقع بذور نبات المعدلة وراثيا ~ 50-100 في 1 مل ماء المقطر وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة 3 أيام في الظلام لتزامن بداية الإنبات.
- زرع بذور ~ 2-3 على سطح التربة من درج محطة التوصيل وتغطي صينية بقبة بلاستيكية. تسمح للبذور على الإنبات في 23 درجة مئوية، الرطوبة 60% مع دورة 10/14-ح الضوء/الظلام كبيرة.
ملاحظة: يجب أن تكون البذور homozygotes. ومع ذلك، نوصي بإعادة تأكيد وجود التحوير في الدفعة. وفي هذه الحالة، تعقيم البذور بالغسيل مع الإيثانول 70% 2 دقيقة، التبييض 50% (حوالي 2% هيبوكلوريت) التي تحتوي على 0.05% triton X-100 للحد الأدنى 5 اتبع بالغسيل 5-6 مرات بماء مقطر مزدوجة العقيمة (ddH2س). وبعد التعقيم، التجهيزة عند 4 درجة مئوية لمدة 3 أيام ولوحة لهم في وسائل الإعلام إنبات النبات المحتوية على 25 ميكروغرام/لتر من هيجروميسين ب لتحديد النباتات المعدلة وراثيا. - وبعد أسبوع، مغادرة مصنع واحد فقط كل المكونات ومواصلة زراعة النباتات تحت نفس ظروف النمو المستخدمة للخطوة 1.2.3.
ملاحظة: استخدمت نباتات عمرها أربع الأسبوع للعدوى P. syringae . النباتات المائية يوميا للحفاظ على صحة النباتات.
2-إعداد الثقافة الزائفة (~ 1 أسبوع)
- بناء بلازميد للتحول Pseudomonas
- الرجوع إلى الجدول للمواد والنظام vector(s) المطلوب من ناقل نظام تقديم الخدمات المستندة إلى T3SS المستجيب25.
- إدراج الجين المستجيب للاهتمام الموجه تسليم المستجيب استخدام مواقع محددة جزئ استنساخ25.
ملاحظة: عند رصد التعريب سوبسيلولار من البروتين المستجيب كاملة الطول، وضع الجينات كاملة الطول في pBK-GW-1-2 أو pBG-GW-1-2. من الممكن أيضا اختيار pBK-GW-1-4 أو pBG-GW-1-4 الذي يحتوي على 2 x sfGFP11 لزيادة إشارة الأسفار. في حالة المستجيب جزئية التي تفتقر إلى إشارة الببتيد، استخدم pBK-GW-2-2 أو pBK-GW-2-4. الرجوع إلى منتزه et al. للحصول على معلومات مفصلة حول المستجيب تسليم ناقلات25.
- تحويل بلازميد تحمل المستجيب تنصهر إلى العلامة sfGFP11 إلى P. syringae الكهروضوئية. الطماطم (Pst) CUCPB5500 باستخدام معيار انهانسر29.
ملاحظة: يمكن استخدام سلالات الزائفة الأخرى إذا لزم الأمر. يتكون نظام الوسم sfGFP11 لمجموعة واسعة نطاق من ناقلات30 وينظم التعبير الجيني للمستجيب المروج AvrRpm1، وقابلة للمقارنة مع، مثلاً، Pseudomonas المتألقة (إيثان)31. - انتشار الخلايا البكتيرية محولة بلطف على السطح من ب أجار لوحات الملك تحتوي على 100 ميكروغرام/مل والريفامبيسين و 25 ميكروغرام/مل كاناميسين أو 25 ميكروغرام/مل مع الجنتامايسين. تبني في 28 درجة مئوية لمدة يومين.
- تطعيم مستعمرة واحدة في وسائل الإعلام السائلة ب الملك مع المضادات الحيوية المناسبة لمتجه المستخدمة، وتنمو الخلايا بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة.
- جعل أسهم والغليسيرول. إضافة الجلسرين يعقم إلى تركيز نهائي 50% ومخزن في-80 درجة مئوية.
3-عابر من التعبير عن sfGFP1-10 عضية التي تستهدفالأراضي الفلسطينية المحتلة في بينثاميانا أ (4 أيام)
- إعداد الثقافة المتبعة
- ترتيب vector(s) المطلوب لاستهداف عضية sfGFP1-10 plasmid(s)الأراضي الفلسطينية المحتلة (انظر الجدول للمواد).
- تحويل plasmid(s) tumefaciens المتبعة سلالة الخلايا GV310132. تنمو الخلايا في المتوسط أجار بيرتاني لوريا (رطل) تستكمل مع 50 ميكروغرام/مل كاناميسين و 50 ميكروغرام/مل الريفامبيسين في 28 درجة مئوية لمدة يومين.
- من مستعمرة واحدة في المتوسط أجار رطل، تطعيم الخلايا إلى 5 مل من سائل الإعلام رطل تستكمل مع 50 ميكروغرام/مل كاناميسين و 50 ميكروغرام/مل الريفامبيسين. تنمو الخلايا بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة.
- حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في ز 3,000 x 10 كحد أدنى من أجل إيقاف الوسائط طافية وريسوسبيند بيليه في 1 مل من طازجة بتسلل المخزن المؤقت.
- قياس كمية المتبعة بالحصول على قيمة الكثافة البصرية (OD) في امتصاص 600 نانومتر (إس 600 نانومتر). ضبط OD600 من البكتيريا إلى 0.5 مع المخزن المؤقت لعمليات التسلل.
ملاحظة: 1 مل تعليق ما يكفي للتسلل في المكانين. - ترك الثقافة في درجة حرارة الغرفة على الروك لطيف ح 1-5 أمام التسلل.
- كزة حفرة في وسط الأوراق أن تسلل مع تلميح 10 ميليلتر. استخدم حقنه needleless 1 مل للتسلل المعلقات المتبعة . بعناية وبطء ضخ حوالي 500 ميليلتر من المعلقات أعد الخطوة 3.1.5 إلى جانب نبات أداكسيال عن طريق المحاقن. كرر التسلل على نباتات مختلفة على الأقل ثلاثة replicates التجريبية.
ملاحظة: لأسباب تتعلق بالصحة والسلامة، ينبغي أن ترتديه حماية العين أثناء عمليات التسلل. - تمحو تعليق البكتيريا المتبقية على الأوراق ووضع علامة على حدود المنطقة تسلل.
- إبقاء النباتات تسلل تحت نفس ظروف النمو المستخدمة للخطوة 1.1.1 لمدة يومين.
4-تلقيح Pseudomonas (4 أيام)
- خط سلالة Pseudomonas محولة من المخزون والغليسيرول في خطوة 2.5 الوسائط أجار ب الملك بالمضادات الحيوية المناسبة عند 28 درجة مئوية لمدة يومين.
ملاحظة: صحة Pseudomonas حرج للغاية. إذا كانت لا تشكل مستعمرات جيدا، خط الخلايا مرة أخرى أو نشر الخلايا في وسائل الإعلام السائلة للملك قبل الشروع. - تطعيم لوبفول Pseudomonas الخلايا في السائل وسائل الإعلام غلوتامات المانيتول (MG) في 28 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة لبين عشية وضحاها.
- حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في ز 3,000 x 10 كحد أدنى من أجل إيقاف الوسائط طافية، ريسوسبيند بيليه في 10 مم مجكل2وضبط OD600 إلى 0.02 (1 × 107 زيمبابوي/mL) لأوراق بينثاميانا أ وإلى 0.002 (1 × 106 زيمبابوي/mL) لأوراق نبات .
- بينثاميانا أ، التسلل بتعليق Pseudomonas مجال الأوراق حيث كان تسلل المتبعة تحمل بناءالأراضي الفلسطينية المحتلة sfGFP1-10 2 أيام سابقا (كما هو الحال في الخطوة 3.1.7). sfGFP1-10الأراضي الفلسطينية المحتلة المعدلة وراثيا نبات، التسلل بتعليق Pseudomonas اثنين منذ 4 أسابيع قصيرة يترك نابعة من اليوم.
ملاحظة: تحتاج على الأقل ثلاثة مصانع ل replicates التجريبية.
5-مراقبة سفجفب إشارة عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل] (يوم واحد)
- قطع القرص أوراق من Pseudomonas-تلقيح أوراق. عند نقطة زمنية معينة بعد تسلل Pseudomonas، صورة قرصين ورقة 2-سم2 من مصنع واحد لاستخدام ليزر مسح النظام [كنفوكل] مع 40 X/1.2 غ ج-أبوتشرومات الماء الغمر الهدف أو 63 X/0.8 الغمر النفط نا ج-أبوتشرومات والهدف. لتجنب قتل قبل إصابة الخلايا الميتة، مراقبة الخلايا بعيداً عن حفرة تسلل.
- بدء تشغيل المراقبة في وضع طاقة منخفضة لليزر الأرجون 488 نانومتر. زيادة قوة الليزر للكشف عن سفجفب.
ملاحظة: نحن عادة استخدام 2-15% كثافة الليزر للكشف عن إشارة الأسفار. ومع ذلك، قوة الليزر وإعداد كشف ينبغي أن تعدل استناداً إلى نظام الفحص المجهري المستخدم. هنا، تم تعيين عوامل الانبعاثات إلى 520-550 نانومتر. وكثيراً ما تنبعث الخلايا الميتة السيارات-الأسفار تحت الإثارة 488 نانومتر الليزر. ولذلك، كعنصر سلبي، ينبغي أن تسللت إلى المستجيب نفسه دون علامة sfGFP11 ولاحظ تحت نفس الظروف المراقبة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحدث الإثارة ليزر عالية أوتوفلوريسسينسي الكلوروفيل. ولذلك، ضبط كثافة الليزر باستخدام الخلايا النباتية التحكم حتى لا تتعرض لحمل أوتوفلوريسسينسي الكلوروفيل.- كونتيرستينينج من جدار الخلية، التسلل يوديد propidium 20 مم (PI) إلى القرص ليف في 5-10 دقيقة قبل الملاحظة.
- لنواة تلطيخ، غمر أقراص ليف في بارافورمالدهيد 0.1% لمدة 5 دقائق متبوعاً بالغسل بالماء. ثم التسلل 10 ملم PI في القرص ليف في 5-10 دقيقة قبل الملاحظة المجهرية. تكرار التجارب ثلاث مرات على الأقل.
ملاحظة: هذه الخطوة غير الحرجة ولكن من المفيد تعريف التعريب المستجيب في غشاء البلازما أو النواة. إذا أظهرت المستجيبة للاهتمام بهم التعريب في عضية محددة، استخدم علامة عضية المعطى لتأكيد إضفاء الطابع المحلي المستجيب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تتألف من أحد عشر بيتا خيوط بنية بيتا للبرميل للتجارة والنقل ويمكن تقسيمها إلى أجزاء اثنين وحبلاال 1-10 (GFP1-10الأراضي الفلسطينية المحتلة) وحبلاال (GFP11) 11. على الرغم من أن أيا من الشظايا اثنين الفلورسنت بأنفسهم، سفجفب الذاتي تجميعها يمكن أن تنبعث منها في الأسفار عند وجود شظايا اثنين بالقرب من (الشكل 1A). في هذا النظام، sfGFP1-10الأرض الفلسطينية المحتلة-الإعراب عن نبات أو بينثاميانا أ. يتم تلقيح النباتات مع Pseudomonas تحمل المستجيب sfGFP11 معلم. هو إعادة تشكيل ل sfGFP1-10الأراضي الفلسطينية المحتلة أعرب في سيتوسول المستجيب sfGFP11 معلم ألقاها Pseudomonas في سيتوسول الخلية المضيفة وثم ترانسلوكاتي معا في المقصورة المستهدفة (الشكل 1B). الرقم 2 يمثل الإجراء عموما، من إعداد المواد النباتية و الباسيفيكي بالكشف عن إشارة fluorescence في الخلية النباتية.
كمثال عن أسلوبنا، استخدمنا P. syringae المستجيب البروتين، أفرب، الذي يتم تسليم في خلايا النبات المضيف دقيق T3SS أثناء الإصابة. نبات، يعترف أفرب بروتين مقاومة مقابلة، RPM1، والاستجابات المناعية المشغلات بما في ذلك موت الخلية شديدة الحساسية33. في الدراسة السابقة، كشفت المقايسة مراسل بروتينات فلورية خضراء والمقايسة الحيوية أن يتم ترجمة أفرب و RPM1 في غشاء البلازما النبات الخلية33،،من3435. النظر في إضفاء الطابع المحلي على أفرب باستخدام أسلوب لدينا، كان تسلل المتبعة إيواء الجينات الخلوي sfGFP1-10الأراضي الفلسطينية المحتلة في بينثاميانا أ. في اليومين الماضيين، تم تلقيح خلايا أفرب-sfGFP11-حولت Pseudomonas في المتبعة-تسللوا إلى المنطقة. إشارات الأسفار سفجفب تستكمل لوحظت في CUCPB5500 الباسيفيكي الذي يحتوي على أفرب-sfGFP11 في غشاء البلازما (الشكل 3B). وفي المقابل، عثر لا إشارات في الخلية المصابة توقيت المحيط الهادي تحمل أفرب الأصلي (الشكل 3A).
رقم 1. نظام التجارة والنقل التقسيم الأمثل. (أ) هيكل بيتا للبرميل بروتينات فلورية خضراء وتتكون من أحد عشر بيتا-خيوط ويمكن تقسيمها إلى 1-10ال β-ستراند (GFP1-10) وال 11 β-ستراند (GFP11). (ب) باستخدام هذا الأسلوب، أبديت أجزاءالأراضي المحتلة sfGFP1-10 في الخلايا النباتية، وحين تنصهر فيها أفرب حبلا sfGFP11 وتتحول إلى Pseudomonas. سوف تظهر فقط خلية النباتات المصابة ب الزائفة التي تحتوي على sfGFP11 fluorescence سفجفب (حيث يموضع المستجيب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. نظرة عامة حول الإجراء. المعدلة وراثيا نبات أو sfGFP1-10الأرض الفلسطينية المحتلة-تسللت إلى بينثاميانا أ. مصنع مصابون توقيت المحيط الهادي CUCPB5500 تحمل المستجيب معلم sfGFP11 عن طريق التسلل المحاقن. ويمكن الكشف عن الأسفار سفجفب المجمعة عن طريق نظام الفحص المجهري [كنفوكل] في الموقع لإضفاء الطابع المحلي على المستجيب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. يترك الكشف أفرب-سفجفب على بينثاميانا أ ح 3 بعد الإصابة. توقيت المحيط الهادي CUCPB5500 إيواء جين أفرب معلم sfGFP11 كان تسلل 5th أو أوراقال 6 من أ. بينثاميانا، الذي كان تسلل المتبعة تحمل sfGFP1 10الأراضي الفلسطينية المحتلة قبل يومين. وكان الملون جدار الخلية يوديد propidium. بينما الخلايا معربا عن sfGFP1 10 الأراضي الفلسطينية المحتلة مع أفرب فقط لا تظهر أي إشارة الفلورية (A). ولوحظت إشارات التجارة والنقل (السهم الأصفر) في الخلايا المصابة ب توقيت المحيط الهادي التي تحتوي على الجين أفرب-sfGFP11 في التسلل بعد ح 3 (ب). ويمثل هذه النتيجة أن فقط أفرب-sfGFP11، لا أفرب، يتم تشكيلها مع sfGFP1-10الأراضي الفلسطينية المحتلة في سيتوسول وثم سفجفب المجمعة هو ذوبانها إلى غشاء البلازما. ويمثل اللون الأرجواني الزائفة جدار الخلية والكلوروفيل أوتوفلوريسسينسي. ويمثل الأخضر الأسفار سفجفب المجمعة. تغيير حجم أشرطة = 40 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يستخدم بروتوكول الموصوفة هنا لرصد الترجمة دقيقة من البروتينات المستجيب حقن الخلايا النباتية المضيف عند الإصابة بواسطة T3SS البكتيرية. سابقا، استخدم نظام التجارة والنقل الانقسام كأداة لدراسة الترجمة سوبسيلولار للبروتينات الثدييات23،36، والتعريب T3E السالمونيلا ، والتسليم VirE2 المتبعة عن طريق T4SS إلى الخلايا النباتية37. لتطبيق هذا النظام في الخلايا النباتية، استخدمت الدراسات السابقة المعدلة وراثيا ذرة نبات مؤثرا يعبر عن 10 GFP1 هيولى والفطريات المعدلة وراثيا، مايديس Ustilago، الذي يعبر عن البروتين معلم GFP11 المستجيب. ومع ذلك،U. مايديس النظام الذرة-لم تكن ناجحة لأن مستويات التعبير من البروتينات المستجيب ذوبانها كانت ضعيفة ومستوى عال من أوتوفلوريسسينسي الخلفية يعوق الكشف عن إشارة بروتينات فلورية خضراء المعاد تشكيلها38. لتصحيح هذه المشكلة، استخدمنا sfGFP1-10 البديل، sfGFP1-10الأرض الفلسطينية المحتلة، أن يحسن بشكل ملحوظ الذوبان والأسفار كثافة21،22.
وعلى الرغم من مزايا نظام سفجفب سبليت، توجد بعض القيود للدراسة التعريب المستجيب والديناميات. أولاً، إشارة الفلورسنت سفجفب المعاد تشكيلها ملاحظتها ضعيفة نسبيا. يمكن أن يكون هذا بسبب كمية صغيرة من الجزيئات المستجيب تسليمها مباشرة من P. syringae. ويمكن تحسين هذا إشارة ضعيفة باستخدام علامة sfGFP11 مولتيميريزينج. وتتوفر أيضا ناقلات تحمل العلامة x sfGFP11 2 من المصادر المدرجة في الجدول للمواد. ثانيا، فشل sfGFP1-10 سيتوسوليك الأراضي الفلسطينية المحتلة أن يعاد تشكيلها مع sfGFP11 يستهدف غولجي ER والبلاستيديه25. التعبير المشارك استهدفت الميتوكوندريا sfGFP11 وسيتوسوليك sfGFP1-10الأراضي الفلسطينية المحتلة وادي إلى ميسلوكاليزيشن سفجفب إعادة تشكيلها سيتوسول ونواة25. ولذلك ينبغي إعادة المصادقة تعريب المستجيب للاهتمام بتطبيق sfGFP1-10 عضية المستهدفة المناسبةالأراضي الفلسطينية المحتلة. عندما لم يتم الكشف عن أي إشارة بروتينات فلورية خضراء في الخلايا المصابة معربا عن سيتوسوليك sfGFP1-10الأرض الفلسطينية المحتلة، نوصي باستخدام بينث أ. الإعراب عن غولجي ER، واستهدفت البلاستيديه sfGFP1-10الأراضي الفلسطينية المحتلة أو استخدام عضية المقابلة التي استهدفت sfGFP1-10الأراضي الفلسطينية المحتلة المعدلة وراثيا نبات25.
هذا الأسلوب أثبت استخدام نظام تقسيم البروتينات الفلورية كأداة مفيدة لدراسة ديناميات المستجيبة في النباتات المضيفة25الزماني والمكاني. البحث في المستقبل سوف تركز على التقدم في مجال التصوير جزيء واحد، والتي قد تتيح دراسات تفصيلية لديناميات المستجيبة المترجمة بغشاء البلازما. وعلاوة على ذلك، فحص إفراز استخدام نظام بكتيرية قد تكون بديلاً مفيداً لدراسة توطين المستجيبة الفطرية؛ فهو يمنع تجميع المستجيبة وأوتوفلوريسسينسي عالية في موقع الاختراق الفطرية.
تجدر الإشارة إلى أن هناك بعض النقاط الرئيسية في هذا الأسلوب. أولاً، ينبغي أن تكون المواد النباتية والبكتيريا الصحية والطازجة. إلى ضمان التصور إشارة المستجيب، ينبغي بشدة أعرب sfGFP1 10الأراضي الفلسطينية المحتلة من النباتات و sfGFP11 من Pseudomonas . ولذلك، من المهم أن تنمو النباتات تحت ظروف النمو المثلى وحماية لهم من عوامل الإجهاد البيئي، مثل الآفات. كما نوصي بأن تتخذ جميع البكتيريا المستخدمة لعمليات التسلل من الخلايا نمت يوم 2 على لوحات أجار وليس من مخزون والغليسيرول. ثانيا، في حالة عابرة من التعبير في بينثاميانا أ، قد تختلف طول الفترة الزمنية اللازمة لنضوج sfGFP1-10 عضية التي تستهدفالأراضي الفلسطينية المحتلة لكل عضية ماركر البروتين. على سبيل المثال، يتطلب نضوج م-sfGFP1-10الأراضي الفلسطينية المحتلة أكثر من 48 ساعة بعد تسلل. أخيرا، النقطة الزمنية ومستويات التعبير من إشارات سفجفب المعاد يتوقف على نوع البروتينات المستجيب المطلوبة لتحسين بعض الظروف التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
هذا البحث كان يدعمها "برنامج بحوث العلوم الأساسية" عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تمول وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي (جبهة الخلاص الوطني-2018R1A2A1A05019892) إلى العاصمة ومن منحة مقدمة من مركز تربية الجزيئية النباتية ( بمبك) للبرنامج 21 Biogreen الجيل القادم من "إدارة التنمية الريفية" (PJ013201) إلى الجيش الشعبي. ونشكر مركز التصوير من المركز الوطني للقياس "الإدارة البيئية" لتوفير مجهر [كنفوكل] لتصوير فيلم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidopsis transgenic lines | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
| NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
| PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
| Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
| NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
| PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
| ER-sfCherry1-10 | Addgene | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
| CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
| sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| Bacterial strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml) | ||
| Media components | |||
| Plant germination media | Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve. | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | Store at 4 °C. |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| LB media | Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed. | ||
| Tryptone | BD Bioscience | 211705 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| NaCl | Duchefa Biochemie | S0520 | |
| Micro agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
| King's B media | 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed. | ||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 212120 | |
| Anhydrous K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
| Glycerol | Duchefa Biochemie | G1345 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
| Mannitol-Glutamate (MG) liquid media | Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7 | ||
| Mannitol | Duchefa Biochemie | M0803 | |
| L-glutamic acid | Duchefa Biochemie | G0707 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
| Infiltration buffer | 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use. | ||
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize. |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Prepare 100 mM stock in water. Autoclave. |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM stock in DMSO. |
| Confocal microscope equipments/materials | |||
| 710 laser scanning confocal system | Carl Zeiss | ||
| Axio observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| Propidium iodide | ThermoFisher | P1304MP |
References
- Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).
- Buttner, D. Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells. FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 4 (2013).
- Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants. J Bacteriol. 180 (17), 4523-4531 (1998).
- Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Semin Cell Dev Biol. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).
- Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants. Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).
- Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
- Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiol. 122 (4), 999-1001 (2000).
- Courbot, M., et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol. 144 (2), 1052-1065 (2007).
- Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
- Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function. J Biol Chem. 278 (16), 14196-14202 (2003).
- Reinicke, A. T., et al. A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery. J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).
- Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization. Cell. 137 (2), 283-294 (2009).
- Fernandez-Alvarez, A., et al. Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis. PLoS Pathog. 8 (3), e1002563 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, Á Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52 (1), 59 (2008).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).
- Cabantous, S., et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association. Sci Rep. 3, 2854 (2013).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nat Commun. 7, 11046 (2016).
- Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors. Nat Methods. 7 (4), 325-330 (2010).
- Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017).
- Addgene. , Available from: https://www.addgene.org (2018).
- Arabidopsis Biological Resource Center. , Available from: https://abrc.osu.edu (2018).
- Kvitko, B. H., et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4), e1000388 (2009).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Kovach, M. E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Upadhyaya, N. M., et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat. Mol Plant Microbe Interact. 27 (3), 255-264 (2014).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc. 2006 (7), (2006).
- Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).
- Nimchuk, Z., et al. Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae. Cell. 101 (4), 353-363 (2000).
- Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
- Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells. Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).
- Tanaka, S., et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).
