Summary
형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.
Abstract
박테리아, 다양 한 식물 질병의 원인이 되는 가장 중요 한 에이전트 중 하나는 호스트 식물 세포 식물 면역 체계를 파괴에 effector 단백질의 집합을 분 비. 감염 시 세포질 이펙터 유형 III 분 비 시스템 (T3SS)를 통해 호스트 cytosol에 전달 됩니다. 식물 세포에 배달, 후에 effector(s) 생존 및 병원 체의 복제에 대 한 호스트 세포 프로세스를 변조 하는 것 특정 compartment(s) 대상. 비록 pathogenicity에 형광 단백질을 사용 하 여 그들의 기능을 이해 하는 호스트 셀에 effector 단백질의 subcellular 지역화의 박테리아에서 직접 주입 하는 이펙터의 역학 조사에서 일부 연구 하고있다 T3SS와 형광 단백질 간의 비 호환성으로 인해 도전 하고있다.
여기, 우리가 호스트 셀에서 세균 T3SS 통해 전달 하는 이펙터의 지역화를 시각화 하기 위해 최적화 된 분할 superfolder 녹색 형광 단백질 시스템 (sfGFPOPT)의 최근 우리의 방법을 설명 합니다. sfGFP11 (11번째 β 물가의 sfGFP)-태그 이펙터는 T3SS을 통해 분 비 사이트에서 형광 방출에 표적으로 하는 특정 세포 기관이 sfGFP1-10선택 (1-10번째 β 물가의 sfGFP) 행간 조립 될 수 있다. 이 프로토콜 애기 Nicotiana benthamiana 식물에 특정 세포 기관이에 슈 도모 나 스 syringae 에서 effector 단백질으로 재구성된 sfGFP 형광 신호를 시각화 하는 절차를 제공 합니다.
Introduction
식물은 수많은 침입 병원 체 포함 박테리아, 곰 팡이, 바이러스, 곤충 및 nematodes 그들의 수명 주기 동안 발생 하는 착 유기 체. Phytopathogens, 중 녹 종 등 Ralstonia 종, 그램 음성 세균성 병원 체 상처 또는 stomata 및 hydathode 같은 자연 구멍을 통해 입력 하 여 그들의 호스트 식물을 감염1. 성공적으로 호스트 식물 식민지로 세균성 병원 균 독성 요인2의 다양 한 개발을 진화 했다. 박테리아는 기 주 식물을 침공, 그들은 일련의 독성 단백질 주사-이펙터로 알려진-그들의 pathogenicity 홍보를 식물 세포에 직접. 이 이펙터 억제 또는 공장 타고 난 면역을 조절 하 고 세균 생존3결과 호스트 세포 프로세스를 조작.
병원 성 박테리아는 주로 호스트 셀4에 직접 효과 기 단백질을 제공 하는 T3SS를 사용 합니다. T3SS는 호스트 셀5의 사출 사이트 내부와 외부 세균 막 비 계 단백질 구조에서 연결 바늘 같은 채널 분자 주사기를 유사 합니다. 이 이펙터 T3SS 중재 (T3E) 분 비 메커니즘은 인간 뿐만 아니라 식물의 다양 한 그램 음성 세균성 병원 체에 잘 보존. 대표적인 식물 병원 체, P. syringae pv 중 하나입니다. 토마토 DC3000 hrcC 돌연변이 일반적으로 결함이 있는 T3SS 완전히 억제 식물 면역 (effector 단백질을 주입)에 의해6에이 돌연변이의 무 능력으로 인해 식물에 성장을 제한 했다. 호스트 세포로 전, 시 이펙터 대상 다양 한 호스트 단백질 등 식물 방위 응답, 유전자 전사, 세포 죽음, 프로테아좀, 소포 매매, 호르몬 경로7 호스트 셀 시스템에 대 한 중요 한 , 8 , 9 , 10. 따라서, 추적 호스트 셀에 effector 단백질의 세포질 지 방화의 식물 면역의 변조에 관하여 그들의 기능을 이해 하는 매력적인 대상 이다.
T3Es의 지역화 연구의 대부분 Agrobacterium-중재 overexpression 호스트 식물9큰 형광 단백질으로 고용 했다. 그러나, 다른 종에 도입 된 유전자의 분리 식 방법 잘못 지역화 된 또는 때때로 작동 하지11,,1213되도록 표시 되었습니다. 또한, 여러 연구 결과 세균성 이펙터는 호스트 셀14,15,,1617에서 적절 한 대상에 대 한 수정 받을 밝혔다. 따라서, 세포 기능 또는 양적 이펙터 병원 체 감염18시 T3SS에 의해 전달 되는 동일 하지 않을 수 있습니다 식물의 cytosol에서 이펙터 뚜렷이 표현. 또한, 대형 형광 태그 effector 단백질의 융합 적절 한 이펙터 배달 및 시각화18,19중단 될 수 있습니다. 따라서, T3E 함수 분석에이 접근 T3SS 분 비 이펙터의 네이티브 지역화를 완벽 하 게 반영 되지 않을 수 있습니다.
녹색 형광 단백질 (GFP)20발 색 단 포함 하는 중앙 물가 포함 하는 11-배가 좌초 하는 β-배럴의 구성 됩니다. Waldo 외. 작은 부품으로 구성 된 새로운 분할-GFP 시스템을 보고 (GFP β 물가 11; GFP11)와 대형 보완 조각 (GFP β 물가 1-10; GFP1-10)21. 조각을 스스로 형광 하지 않습니다 하지만 두 조각을 서로 가까운 근접에 있을 때 그들의 자기 협회에 형광. 단백질 접히는 효율성의 최적화에 대 한 강력한 접는 변종 GFP, 즉, sfGFP 및 sfGFP선택, 이후에 분할 GFP 시스템20,,2122개발 되었다. 최근, 단일 아미노산 돌연변이 sfGFP1-10선택-sfYFP1-10선택 및 sfCFP1-10선택-을 각각 sfGFP11 조각와 쇼 노란색과 청록색 형광 reconstitute 수, 생성 된23의 변형 . 또한, sfCherry, mCherry의 파생 분열 될 수 있다 sfGFP23와 같은 방식으로 sfCherry11와 sfCherry1-10 조각으로.
이 시스템은 고 살 모 넬 라24. 에서 이펙터를 사용 하 여 감염 동안 추적 하는 HeLa 세포에서 T3SS 이펙터에 맞게 되었습니다. 그러나, 그것은 이전 하지 최적화 호스트 식물 세균성 병원 체 시스템에 대 한. 최근에, 우리는 식물 세포25에 P. syringae 에서 전달 하는 T3Es의 subcellular 지 방화를 모니터링 하는 데 향상 된 sfGFP1-10선택 에 따라 분할 GFP 시스템 최적화. 식물 세포, 유전자 변형 애기 thaliana 집합에에서 다른 subcellular 구획을 T3Es의 지역화 연구를 촉진 하기 위하여 식물 다양 한 subcellular 구획 에서에서 sfGFP1-10OPT 를 표현 하기 위해 생성 된 25. 또한, 다양 한을 운반 하는 플라스 미드 세포 기관이 대상 sfGFP1-10선택 Agrobacterium에 대 한-중재 과도 overexpression 이펙터 T3SS 기반 배달에 대 한 sfGFP11 태그 벡터 또한 생성 했다. 다양 한 유전자 변형 애기 라인과 관심의 T3Es을 표현 하는 플라스 미드의 씨앗 테이블의 자료26,27에서 언급 한 소스에서 얻을 수 있습니다.
다음 프로토콜에서 우리는 분할 sfGFP 시스템을 사용 하 여 호스트 세포에 박테리아에 의해 전달 하는 이펙터의 역학을 모니터링 하는 최적화 된 시스템을 설명 합니다. SfGFP1-10선택 유전자 변형 녹 sfGFP11 재조합 플라스 미드를 들고와 표현 하는 식물의 감염 호스트 셀으로 모나 스 에서 sfGFP11 태그 이펙터의 전달 결과. 따라서, 이러한 단백질 재구성 되 고 특정 이펙터 대상 compartment(s)에 이동. 슈 도모 나 스 syringae pv입니다. 토마토 18 이펙터 삭제 됩니다, CUCPB5500 스트레인이이 스트레인 A. thaliana 및 북 아 일 benthamianas28에 낮은 또는 없음 세포 죽음을 보여주 때문에 사용 되었다. 그러나, 모든 자료와 여기에 설명 된 단계 교체 수 있습니다 또는 다른 생물학 질문 또는 지정 된 실험실 조건에서 최적화의 조사를 위해 분할 sfGFP 시스템에 맞게 수정.
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Protocol
참고: 모든 단계는 수행 실 온에서 달리 명시 하지 않는 한.
1. 식물 재료 (4 주)의 준비
- 명. benthamiana 식물에 대 한 준비
- 명. benthamiana 의 각 냄비의 토양 표면에 2 씨앗을 뿌리 다, 플라스틱 돔 트레이 커버 및 25 ° C, 16/8-h 명암 photoperiod 사이클 60% 습도 성장 챔버에에서 발 아를 씨를 허용.
- 2 주 후, 선택 하 고 각 냄비에 작은 경종을 폐기 단계 1.1.1에서에서 발 아에 대 한 적용 동일한 성장 조건 하에서 식물 성장을 계속. 매 2 일 트레이 당 물 1 리터를 추가 합니다.
참고: 식물의 성장 조건 실험실에서 달라질 수 있습니다. 따라서, 건강 한 상태에 있는 식물을 성장 하는 일반 급수 프로토콜을 따릅니다. - 일주일에 새로운 용지함에 식물을 전송 하 고 추가 성장 위한 충분 한 공간이 그들을 주선. 계속 그들은 나이의 4 주에 침투 될 준비가 될 때까지 단계 1.1.1에서에서 설명한 조건 하에서 식물 성장.
참고: 식물 성장 연구소에서 성장 상태에 따라 달라질 수 있습니다. 일반적으로, 우리는 그 4 주 된 찾을 명. benthamiana 식물 약 6 잎 곰.
- A. thaliana 유전자 변형 식물에 대 한 준비
- 테이블의 자료 를 참조 하 고 유전자 변형 애기 씨앗 주문.
- 1 mL의 증류수에 50-100 유전자 변형 애기 씨를 담근 다 고 발 아의 발병을 동기화를 어둠 속에서 3 일 동안 4 ° C에서 그들을 저장 합니다.
- 플라스틱 돔 트레이 커버와 플러그 공장 트레이의 토양 표면에 2 ~ 3 씨를 뿌리 다. 23 ° C, 10/14-h 명암 photoperiod 사이클 60% 습도에서 발 아 씨앗을 허용 합니다.
참고: 씨앗 homozygotes 이어야 한다입니다. 그러나, 일괄 처리에 있는 transgene의 존재를 재확인 하는 것이 좋습니다. 이 경우에, 2 분, 표 백제 50% 70% 에탄올으로 세척 하 여 씨앗을 소독 (약 2% 차 아 염소 산) 5-6 시간 살 균 두 배 증류수 (ddH2O)로 세척 하 여 5 분에 대 한 triton X-100 따라 0.05%를 포함 하. 살 균 후 4 ° C에서 3 일 동안 충 하 고 유전자 변형 식물 선택 hygromycin B의 25 µ g/L를 포함 하는 식물 발 아 미디어에 접시. - 주 후에, 플러그 당 하나의 공장 두고 단계 1.2.3 사용 동일한 성장 조건 하에서 식물 성장을 계속.
참고: 4 주 오래 된 식물 P. syringae 감염을 위해 사용 되었다. 물 식물 매일 식물의 건강을 유지.
2. 모나 스 문화 (~ 1 주)의 준비
- 모나 스 변환에 대 한 플라스 미드의 건설
- 테이블의 자료 를 참조 하 고 이펙터 T3SS 기반 배달 시스템 벡터25의 원하는 vector(s)를 주문.
- 사이트별 재결합25복제를 사용 하 여 이펙터 배달 벡터에 관심의 이펙터 유전자를 삽입 합니다.
참고: 전체 길이 effector 단백질의 subcellular 지 방화, 모니터링 넣어에 전장 유전자 pBK-GW-1-2 또는 pBG-GW-1-2. 그것은 또한 pBK-GW-1-4를 선택할 수 또는 pBG-GW-1-4 포함 된 2에 대 한 x sfGFP11 증가 형광 신호. 신호 펩 티 드 부족 부분 이펙터, 경우 pBK-GW-2-2 또는 pBK-GW-2-4를 사용 합니다. 공원 외. 이펙터 배달 벡터25에 대 한 자세한 내용은 참조 하십시오.
- P. syringae pv sfGFP11 태그를 융합 하는 이펙터를 들고 플라스 미드를 변환. 토마토 (태평양 표준시) CUCPB5500 표준 electroporation29를 사용 하 여.
참고: 필요한 경우 다른 녹 종자를 사용할 수 있습니다. SfGFP11 태그 시스템은 벡터30 의 광범위 한 범위에 대 한 구성 하 고 있는 이펙터의 유전자 발현 비교와 함께, 예를 들어, 슈 도모 나 스 fluorescens (이 단)31AvrRpm1 발기인에 의해 규제 됩니다. - 임금의 B 한 천 배지 100 µ g/mL 리 팜 피신과 25 µ g/mL 대 또는 25 µ g/mL gentamycin 포함의 표면 변형 된 세균성 세포를 부드럽게 확산. 2 일 동안에 28 ° C를 품 어.
- 킹의 B 액체 미디어 사용, 벡터에 대 한 적절 한 항생제로 한 식민지를 접종 하 고 200 rpm에서 떨고와 28 ° C에서 하룻밤 세포 성장.
- 글리세롤 재고를 확인 합니다. 50%-80 ° c.에 게의 최종 농도에 압력가 글리세롤을 추가
3. 과도 식 세포 기관이 대상 sfGFP1-10선택 북 아 일 benthamiana (4 일)에서
- Agrobacterium 문화의 준비
- 주문 sfGFP1-10선택 plasmid(s) 세포 기관이 대상의 원하는 vector(s) ( 테이블의 자료를 참조).
- plasmid(s) Agrobacterium tumefaciens 스트레인 GV3101 셀32변환. 2 일 동안 50 µ g/mL 대와 28 ° C에서 50 µ g/mL 리 팜 피신 보충 Luria Bertani (파운드) 한 천 매체에 세포 성장.
- 파운드 한 천 매체에 단 하나 식민지에서 50 µ g/mL 대와 50 µ g/mL 리 팜 피신 보충 액체 LB 미디어의 5 mL로 세포를 접종. 200 rpm에서 떨고와 28 ° C에서 하룻밤 세포 성장.
- 10 분에 대 한 3000 x g에서 원심 분리 하 여 세포 표면에 뜨는 미디어에서 부와 갓의 1 mL에 펠 릿을 resuspend 수확이 했다 침투 버퍼를.
- 600의 흡 광도에서 광학 밀도 (OD) 값을 얻어서 Agrobacterium 의 수량을 측정 nm (Abs 600 nm). 0.5 침투 버퍼와 함께 박테리아의 세600 조정 합니다.
참고: 서 스 펜 션의 1 mL 두 개의 관광 명소에 침투 하기 충분 하다. - 실 온에서 문화를 침투 하기 전에 1-5 h에 대 한 부드러운 로커에 둡니다.
- 10 µ L 팁으로 침투 하는 나뭇잎의 중심에 구멍을 찌른. 1 mL needleless 주사기를 사용 하 여 침투 Agrobacterium 정지. 신중 하 고 천천히 주사 약 500 µ L 주사기를 통해 잎 adaxial 측면에 3.1.5 단계에서 준비 하는 정지의. 실험적인 복제에 대 한 적어도 3 개의 다른 식물에 침투를 반복 합니다.
참고: 건강과 안전 이유를 위해 눈 보호 침투 동안 착용 되어야 한다. - 잎에 남아 있는 세균 현 탁 액 떨어져 닦 고 침투 지역의 경계를 표시.
- 2 일 동안 단계 1.1.1 사용 동일한 성장 조건 하에서 침투 식물 유지.
4. 접종의 모나 스 (4 일)
- 2 일 동안 28 ° C에 적절 한 항생제와 킹의 B 천 미디어에 2.5 단계에서 글리세롤 재고에서 행진 변형된 녹 스트레인.
참고: 녹 의 건강이 매우 중요 합니다. 식민지를 잘 형성 하지 않는다, 세포를 다시 행진 또는 진행 하기 전에 임금의 액체 매체에 있는 셀을 전파. - 마 니 톨 조미료 (MG) 액체 미디어 28 ° C에서 하룻밤을 위해 200 rpm에서 떨고 있는 녹 셀의 loopful 접종
- 수확 10 분에 대 한 3000 x g에서 원심 분리에 의해 셀 부 표면에 뜨는 미디어 어 펠 릿 10 mm MgCl2, resuspend 고 명 benthamiana 잎 및 0.002 (1 x 106 세600 0.02 (1 x 107 cfu/mL)을 조정 cfu/mL) 애기 단풍. 에 대 한
- 명. benthamiana에 대 한 녹 서 스 펜 션 sfGFP1-10선택 구문을 들고 Agrobacterium 이전 (3.1.7 단계)에서 2 일을 침투 했다 잎의 영역으로 침투. sfGFP1-10선택 유전자 변형 애기, 대 두 4 주 오래 된 짧은 하루 성장 잎으로 녹 서 스 펜 션에 침투.
참고: 적어도 3 개의 식물 실험 복제 필요 합니다.
5. sfGFP 신호 Confocal 현미경 검사 법 (1 일)을 통해 관찰
- 녹에서 잎 디스크 잘라-잎을 주사. 모나 스의 침투 후 특정 시간 점에, 40 X confocal 시스템 스캐닝 레이저를 사용 하 여 단일 공장에서 두 개의 2 cm2 잎 디스크 이미지 / 1.2 나 C-Apochromat 물 침수 목표 또는 63 / 0.8 X 나 C-Apochromat 기름 침수 목적입니다. 부상에 의해 살해 하는 죽은 세포를 방지 하려면 침투 구멍에서 세포를 관찰 합니다.
- 488 nm 아르곤 레이저의 저전력 설정에서 관측을 시작 합니다. 레이저 파워 sfGFP 탐지를 증가.
참고: 우리가 일반적으로 형광 신호를 찾으려면를 레이저 강도의 2-15%를 사용 합니다. 그러나, 레이저 파워와 검색 설정을 조정 해야 사용자의 현미경 시스템에 따라. 여기, 방출 필터 520-550 nm로 설정 했다. 죽은 세포는 종종 488 nm 레이저 여기 아래 자동-형광 방출. 따라서, 부정적인 컨트롤 sfGFP11 태그를 하지 않고 같은 이펙터 침투 하 고 동일한 관측 조건 하에서 관찰 될 해야 합니다. 또한, 높은 레이저 여기 엽록소 autofluorescence를 유도할 수 있다. 따라서 엽록소 autofluorescence 유도를 하지 않도록 제어 식물 세포를 사용 하 여 레이저 강도 조정 합니다.- 세포 벽의 counterstaining에 대 한 리프 디스크 관찰 전에 5-10 분에 20 m m propidium 요오드 화물 (PI)을 침투.
- 얼룩이 핵에 대 일 분 뒤에 물으로 세척 하 여 0.1 %paraformaldehyde 리프 디스크 잠수함. 그런 다음, 10mm, PI 리프 디스크 현미경 관찰 하기 전에 5-10 분에 침투. 실험 3 번 이상 반복 합니다.
참고:이 단계는 아닙니다 중요 하지만 원형질 막 또는 핵에 이펙터 지역화를 정의 하는 데 도움이. 관심의 이펙터에 특정 세포 기관이 그들의 지역화 면, 주어진된 세포 기관이 대 한 마커를 사용 하 여는 이펙터의 지역화를 확인.
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Representative Results
GFP의 β 배럴 구조 11 β 물가의 구성 이며, 두 조각, 1-10번째 가닥 (GFP1-10선택)와 11일 (GFP11) 가닥으로 나눌 수 있습니다. 비록 둘 다 2 개의 파편 스스로 형광의 자기 조립된 sfGFP 근접 (그림 1A)에 존재 하는 2 개의 파편 때 형광을 내보낼 수 있습니다. 이 시스템에서는, sfGFP1-10선택-식물 녹 sfGFP11 태그 이펙터를 들고와 주사는 애기 명. benthamiana 를 표현. 호스트 셀의 cytosol로 모나 스 에 의해 전달 sfGFP11 태그 이펙터는 cytosol에서 표현 sfGFP1 10OPT 를 재구성 하 고 대상 구획 (그림 1B)에 함께 이동. 그림 2 는 식물 세포에 형광 신호 검출에 식물 재료와 Pst 의 준비에서 전체 절차를 나타냅니다.
우리의 방법의 예를 들어, 우리는 P. syringae effector 단백질에 전달 철저 한 호스트 식물 세포는 T3SS 감염 시 AvrB를 사용 합니다. 애기, AvrB 해당 저항 단백질, RPM1, 지나치게 세포 죽음33를 포함 하는 트리거 면역 반응에 의해 인식 된다. 이전 연구에서 GFP 기자 분석 결과 및 생 화 확 적인 분석 결과 AvrB 및 RPM1 식물 세포33,,3435의 원형질 막에 지역화는 밝혔다. 우리의 방법을 사용 하 여 AvrB의 지역화를 검사, Agrobacterium CYTO sfGFP1-10선택 유전자를 품고 명. benthamiana에 침투 했다. 2 일, AvrB-sfGFP11-변형 녹 셀 Agrobacterium으로 주사 했다-지역 침투. 보충된 sfGFP 형광 신호 Pst CUCPB5500에서 관찰 된 원형질 막 (그림 3B) AvrB-sfGFP11 포함 된. 반면, 아무 신호 했다 발견 감염된 세포에 태평양 표준시 에 의해 네이티브 AvrB (그림 3A)를 들고.
그림 1입니다. 최적화 된 분할 GFP 시스템. (A) GFP의 β 배럴 구조 11 β 물가의 만들어지고 1-10번째 β-스트랜드 (GFP1-10)과 11일 β-가닥은 (GFP11)로 분할할 수 있습니다. (B)이이 방법에서는, sfGFP1-10선택 조각 표현 했다 식물 세포에서 동안 sfGFP11 스트랜드 AvrB 융합 되었고 녹으로 변형. 슈 도모 나 스 sfGFP11를 포함 하 여 감염 된 식물 셀만 (여기서는 이펙터 localizes) sfGFP 형광을 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 절차의 개요. 유전자 변형 애기 나 sfGFP1-10선택-침투 북 아 일 benthamiana 공장 Pst CUCPB5500 감염 주사기 침투를 통해 sfGFP11 태그 이펙터를 들고. 조립된 sfGFP의 형광 이펙터 지역화의 사이트에 confocal 현미경 시스템을 통해 감지할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 명. benthamiana 에 AvrB-sfGFP 검색 감염 후 3 h 나뭇잎. 태평양 표준시 CUCPB5500 은닉 sfGFP11 태그 AvrB 유전자 5일 또는 명. benthamiana, Agrobacterium 들고 sfGFP1-10선택 2 일 이전에 의해 침투 되었다 어떤의 6번째 잎에 침투 했다. 세포 벽은 propidium 요오드 화물에 의해 얼룩이 진다. SfGFP1-10 선택 AvrB 전용으로 표현 하는 셀 동안 어떤 형광 신호 (A) 표시 되지 않습니다. GFP 신호 (노란색 화살표) 3 h 후 침투 (B)에서 AvrB sfGFP11 유전자를 포함 하는 Pst 에 의해 감염 된 세포에서 관찰 되었다. 이 결과 하지 AvrB, AvrB sfGFP11 유일한 sfGFP1 10수신 거부 는 cytosol로 재구성 및 조립된 sfGFP 플라즈마 멤브레인 translocated은 다음을 나타냅니다. 마젠타 의사 색 세포 벽 및 엽록소 autofluorescence 나타냅니다. 그린 조립된 sfGFP 형광을 나타냅니다. 스케일 바 = 40 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜 모니터링 호스트 식물 세포 감염 시 세균 T3SS에 의해 주입 하는 effector 단백질의 정확한 지역화에 사용 됩니다. 이전, 분할 GFP 시스템 포유류 단백질23,36의 subcellular 지 방화, 살 모 넬 라 T3E 지역화, Agrobacterium VirE2 납품에 T4SS 통해 공부 하는 도구로 사용 되었다는 식물 세포37. 식물 세포에서이 시스템을 적용, 이전 연구 유전자 변형 옥수수 식물을 constitutively 세포질 GFP1-10과 유전자 변형 균, 표현 Ustilago maydis, GFP11 태그 effector 단백질을 표현 하는 사용. 그러나, 옥수수-미국 maydis 시스템 되지 않았습니다 성공적인 translocated effector 단백질 식 수준의 약한 되었고 배경 autofluorescence의 높은 수준의 재구성된 GFP 신호38의 감지에 장애가 있기 때문에. 이 문제를 해결 하려면 사용 하는 sfGFP1 10 variant, sfGFP1-10선택, 용 해도 및 형광 강도21,22크게 향상.
분할 sfGFP 시스템의 장점에도 불구 하 고 이펙터 현지화 및 역학의 연구를 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, 관찰된 재구성된 sfGFP 형광 신호는 상대적으로 약하다. P. syringae에서 직접 전달 하는 효과 기 분자의 작은 금액으로 인해 수 있습니다. Multimerizing sfGFP11 태그를 사용 하 여이 약한 신호를 향상 시킬 수 있습니다. 2 x sfGFP11 태그를 운반 하는 벡터 자료의 테이블에에서 나열 된 소스에서 사용할 수 있습니다. 둘째, cytosolic sfGFP1-10 선택 sfGFP11 골, 응급실, plastid25를 대상으로 재구성 하지 못했습니다. 미토 콘 드리 아-타겟 sfGFP11 및 cytosolic sfGFP1-10선택 의 공동 식 cytosol 그리고 핵25에 다시 구성된 sfGFP의 mislocalization에서 결과. 따라서, 관심의 이펙터의 지역화 적절 한 세포 기관이 대상 sfGFP1-10선택적용 하 여 다시 확인 되어야 합니다. Cytosolic sfGFP1 10OPT를 표현 하는 감염 된 세포에 있는 GFP 신호 감지 되지 않으면 골, 응급실, 표현 명. benth 를 사용 하는 것이 좋습니다 고 plastid sfGFP1-10선택 또는 해당 세포 기관이 대상을 사용 하 여 대상 sfGFP1-10선택 유전자 변형 애기25.
이 메서드는 호스트 식물25에 이펙터의 시간적, 공간적 역학 검사 하는 유용한 도구로 분할 형광 단백질 시스템의 사용을 시연 했다. 미래 연구는 단일 분자 이미징, 원형질 막 지역화 이펙터의 역학의 상세한 연구 사용에 발전에 집중할 것 이다. 또한, 세균성 시스템을 사용 하 여 분 비 분석 결과 균 이펙터;의 지역화를 공부 하 유용한 대안이 될 수 있습니다. 이펙터 및 곰 팡이 침투 사이트에서 높은 autofluorescence의 집계를 방지합니다.
이 메서드의 몇 가지 핵심 포인트는 주목 한다. 첫째, 식물 재료와 박테리아 모두 건강 하 고 신선한 이어야 한다. 이펙터 신호의 시각화를 위해 녹 에서 sfGFP11와 sfGFP1-10선택 식물에서 수 강하게 표현 한다. 따라서, 그것은 최적의 성장 조건 하에서 식물 성장 및 해충 등의 환경 스트레스에서 그들을 보호 하는 것이 중요입니다. 침투에 사용 하는 모든 박테리아 한 천 판 2 일 성장 세포와 글리세롤 주식에서 아닙니다 취해질 것이 좋습니다. 둘째, 북 아 일 benthamiana에 과도 식의 경우 세포 기관이 대상 sfGFP1-10선택 의 성숙에 필요한 시간의 길이 각 세포 기관이 마커 단백질에 대 한 달라질 수 있습니다. 예를 들어 오후-sfGFP1-10선택 의 성숙 침투 후 48 h를 요구 한다. 마지막으로, 시간 지점과 재구성된 sfGFP 신호 식 수준 따라 일부 실험 조건을 최적화 하는 데 필요한 effector 단백질의 종류에 따라 다릅니다.
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Disclosures
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
이 연구는 기초 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 사역의 과학, ICT 및 향후 계획 (NRF-2018R1A2A1A05019892) dc 및 식물 분자 번 식 센터 (에서 교부 금에 의해 투자에 의해 지원 되었다 PMBC) 에피소드를 농촌 개발 관리 (PJ013201)의 다음 세대 Biogreen 21 프로그램의 우리 confocal 현미경 촬영을 제공 하기 위해 환경 관리에 대 한 국립 계측 센터의 이미징 센터를 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidopsis transgenic lines | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
| NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
| PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
| Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
| NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
| PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
| ER-sfCherry1-10 | Addgene | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
| CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
| sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| Bacterial strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml) | ||
| Media components | |||
| Plant germination media | Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve. | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | Store at 4 °C. |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| LB media | Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed. | ||
| Tryptone | BD Bioscience | 211705 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| NaCl | Duchefa Biochemie | S0520 | |
| Micro agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
| King's B media | 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed. | ||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 212120 | |
| Anhydrous K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
| Glycerol | Duchefa Biochemie | G1345 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
| Mannitol-Glutamate (MG) liquid media | Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7 | ||
| Mannitol | Duchefa Biochemie | M0803 | |
| L-glutamic acid | Duchefa Biochemie | G0707 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
| Infiltration buffer | 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use. | ||
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize. |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Prepare 100 mM stock in water. Autoclave. |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM stock in DMSO. |
| Confocal microscope equipments/materials | |||
| 710 laser scanning confocal system | Carl Zeiss | ||
| Axio observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| Propidium iodide | ThermoFisher | P1304MP |
References
- Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).
- Buttner, D. Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells. FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 4 (2013).
- Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants. J Bacteriol. 180 (17), 4523-4531 (1998).
- Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Semin Cell Dev Biol. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).
- Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants. Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).
- Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
- Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiol. 122 (4), 999-1001 (2000).
- Courbot, M., et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol. 144 (2), 1052-1065 (2007).
- Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
- Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function. J Biol Chem. 278 (16), 14196-14202 (2003).
- Reinicke, A. T., et al. A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery. J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).
- Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization. Cell. 137 (2), 283-294 (2009).
- Fernandez-Alvarez, A., et al. Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis. PLoS Pathog. 8 (3), e1002563 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, Á Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52 (1), 59 (2008).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).
- Cabantous, S., et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association. Sci Rep. 3, 2854 (2013).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nat Commun. 7, 11046 (2016).
- Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors. Nat Methods. 7 (4), 325-330 (2010).
- Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017).
- Addgene. , Available from: https://www.addgene.org (2018).
- Arabidopsis Biological Resource Center. , Available from: https://abrc.osu.edu (2018).
- Kvitko, B. H., et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4), e1000388 (2009).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Kovach, M. E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Upadhyaya, N. M., et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat. Mol Plant Microbe Interact. 27 (3), 255-264 (2014).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc. 2006 (7), (2006).
- Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).
- Nimchuk, Z., et al. Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae. Cell. 101 (4), 353-363 (2000).
- Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
- Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells. Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).
- Tanaka, S., et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).
