Summary
גישות מבוססות חלבון פלואורסצנטי לפקח effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התאים המארחים הם מאתגרים. זאת בשל בעיית אי התאימות בין חלבונים פלורסנט ומערכת ההפרשה סוג-III. כאן, מערכת ה-GFP פיצול ממוטב superfolder משמש עבור ויזואליזציה של effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התא הצמח הפונדקאי.
Abstract
חיידקים, אחד מסוכני סיבתי החשוב ביותר של מחלות שונות, מפרישים קבוצת אפקטור חלבונים בתא צמח המארח כדי לערער את המערכת החיסונית של הצמח. במהלך זיהום cytoplasmic effectors מועברות ציטוזול מארח דרך סוג מערכת הפרשת השלישי (T3SS). לאחר הלידה בתא צמח, effector(s) מטרות של compartment(s) ספציפיים כדי לווסת את תהליכי התא מארח עבור הישרדות, שכפול של המחלה. אמנם יש כבר כמה מחקרים לוקליזציה subcellular אפקטור חלבונים בתאי המארח כדי להבין את תפקידם בפתוגניות באמצעות חלבונים פלורסנט, חקירה של הדינמיקה של effectors מוזרק ישירות מחיידקים מאתגרת בשל בעיית אי התאימות בין T3SS לבין חלבונים פלורסנט.
כאן, אנו מתארים את השיטה האחרונה שלנו מפוצל ממוטב superfolder חלבון פלואורסצנטי ירוק במערכת (sfGFPהכבושים) לדמיין הלוקליזציה של effectors באמצעות T3SS חיידקי התא המארח. SfGFP11 (11ה β-גדיל של sfGFP)-אפקטור מתויג מופרש דרך T3SS יכול להיות שהתכנסה עם אברון ספציפי ממוקד sfGFP1-10OPT (1-10בתאנון β-גדיל של sfGFP) מוביל פליטת קרינה פלואורסצנטית באתר. פרוטוקול זה מספק הליך להמחיש את האות זריחה sfGFP משוקם עם חלבון אפקטור מ Pseudomonas syringae אברון מסוים את הצמחים תודרנית , טבק benthamiana .
Introduction
צמחים הם אורגניזמים sessile המפגש פתוגנים פולשים רבים, כולל חיידקים, פטריות, וירוסים, חרקים, נמטודות לאורך כל מחזור החיים שלהם. בקרב phytopathogens, פתוגנים חיידקי גראם שליליים כגון Pseudomonas spp. ו- Ralstonia spp., להדביק צמחים פונדקאים שלהם על-ידי הזנת דרך פצעים או פתחים טבעיים, כגון הפיוניות, hydathode1. ליישב בהצלחה צמחים פונדקאים, פתוגנים חיידקיים התפתחו לפתח מגוון של גורמים התקפה אלימה2. כאשר חיידקים לפלוש צמח המארח, הם מזריקים סדרה של התקפה אלימה חלבונים – המכונה effectors — ישירות לתוך תאי צמחים כדי לקדם פתוגניות שלהם. Effectors האלה לדכא או לווסת את הצמח מולדת חסינות ולטפל התהליכים הסלולר מארח את התוצאה הישרדות חיידקי3.
חיידקים פתוגניים להשתמש בעיקר של T3SS כדי לספק אפקטור חלבונים ישירות לתוך התאים מארח4. T3SS דומה מזרק מולקולרית עם ערוץ דמוי מחט, התחברות של מבנה החלבון לגרדום מעבר הפנימי, החיצוני חיידקית בקרום ההזרקה של התא המארח5. מנגנון הפרשת זה אפקטור בתיווך T3SS (T3E) הוא שנשמרת היטב ב פתוגנים חיידקיים גראם שליליים שונים של הצמח, כמו גם בני אדם. אחד פתוגנים צמח נציג, pv syringae פ . עגבניות מוטציה hrcC DC3000 אשר כולל בדרך כלל T3SS פגומים, הגביל צמיחת צמחים ככל הנראה בגלל חוסר יכולת זו מוטציה לדכא לגמרי את הצמח חסינות (באמצעות הזרקת אפקטור חלבונים)6. על טרנסלוקציה לתוך התאים מארח, effectors מטרה שונים המארח חלבונים חשובים עבור מערכת התא המארח, לרבות תגובות הגנה צמח, שעתוק גנים, מוות של תאים, פרוטאוזום, שלפוחית סחר הורמון מסלולים7 , 8 , 9 , 10. לפיכך, מעקב של לוקליזציה הסלולר של החלבונים אפקטור בתאי המארח הוא ליעד אטרקטיבי כדי להבין את הפונקציות שלהם ביחס אפנון של החסינות הצמח.
רוב המחקרים לוקליזציה של T3Es המועסקים Agrobacterium -מתווכת ביטוי עם חלבון גדול זריחה ב צמח מארח9. עם זאת, שיטת heterologous ביטוי גנים אשר הציג בחיות אחרות הוכח להיות מותאם בצורה שגויה או מדי פעם שאינם פונקציונליים11,12,13. בנוסף, מספר מחקרים חשף כי חיידקי effectors עוברים שינוי עבור פילוח הנכונה המארחת תאים14,15,16,17. לכן, transiently הביע effectors ב ציטוזול של הצמח תאים לא יכול להיות פונקציונלית או באופן כמותי זהה effectors אשר מועברים על ידי T3SS על הפתוגן זיהום18. יתר על כן, היתוך גרעיני גדול תגים פלורסנט אפקטור חלבונים עלולות לשבש אפקטור נאות משלוח והדמיה18,19. לכן, אלה גישות assay הפונקציה T3E עשוי משקף באופן מלא לוקליזציה מקורית של effectors T3SS-מופרש.
חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מורכב של גדילי 11 β-חבית תוחמת חוט מרכזי הכולל כרומופור20. וולדו. et al. דיווח מערכת פיצול הרומן-GFP מורכב מרכיב קטן (GFP β לנטישה של 11; GFP11), קטע משלימים גדולים (GFP β סטרנד 1-10; GFP1-10)21. השברים לא לזרוח בכוחות עצמם אך לזרוח על שיוכם עצמית כאשר שני קטעים נמצאים קרוב מאוד אחד עם השני. עבור אופטימיזציה של יעילות קיפול החלבון, חזקים מתקפלים גרסאות של ה-GFP, קרי, sfGFP, sfGFPהכבושים, לאחר מכן פותחו עבור פיצול GFP מערכת20,21,22. לאחרונה, חומצה אמינית בודדת מוטציה וריאציות של sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT ו sfCFP1-10OPT- זה יכול לשקם עם פרגמנט sfGFP11 וחדר קרינה פלואורסצנטית, צהוב, ציאן, הצג בהתאמה, היו שנוצר23 . יתר על כן, sfCherry, נגזרת של mCherry, יכול להתפצל לחלקים sfCherry1-10 ו- sfCherry11 באותו אופן כמו sfGFP23.
מערכת זו כבר מותאם תווית ולעקוב אחר את effectors T3SS בתאים הלה במהלך זיהום באמצעות את effectors של סלמונלה24. עם זאת, זה היה בעבר לא אופטימיזציה עבור מערכת צמח-בקטריאלי הפתוגן המארחת. לאחרונה, אנחנו אופטימיזציה מערכת ה-GFP פיצול בהתבסס על sfGFP1-10OPT משופרת כדי לפקח לוקליזציה subcellular של T3Es העבירה של syringae פ . תאי הצמח25. כדי להקל על לימודי הסבת T3Es כדי שונים subcellular תאים בתאי הצמח, קבוצת הטרנסגניים תודרנית לבנה צמחים נוצרו להביע sfGFP1-10OPT בתאים subcellular שונים 25. יתר על כן, פלסמידים נושא מגוון של אברון-שמיועד sfGFP1-10בשטחים הכבושים Agrobacterium-ביטוי ארעי בתיווך, הווקטורים מתויג sfGFP11 למסירה מבוססי T3SS אפקטור נוצרו גם. הזרעים של קווים שונים תודרנית הטרנסגניים של פלסמידים לבטא את T3Es של עניין ניתן לקבל ממקורות הזכיר את הטבלה של חומרים26,27.
בפרוטוקול הבא, נתאר מערכת אופטימיזציה כדי לנטר את הדינמיקה של effectors מועברים על ידי חיידקים בתאי המארח באמצעות מערכת sfGFP מפוצל. זיהום של הצמחים לבטא sfGFP1-10בשטחים הכבושים עם הטרנסגניים Pseudomonas נושאת sfGFP11 רקומביננטי פלסמיד תוצאות משלוח של אפקטור מתויג sfGFP11 של Pseudomonas לתוך התא הפונדקאי. כתוצאה מכך, חלבונים אלה הם מחדש, translocate כדי compartment(s) היעד אפקטור ספציפיים. Pv Pseudomonas syringae . עגבניות זן CUCPB5500 שבו יימחקו 18 effectors, שימש כי זן זה הראה נמוך או ללא מוות תאי s לבנה א ו- benthamiana (ש ע)28. עם זאת, כל החומרים ו השלבים המתוארים כאן ניתן להחליף או שונה כדי להתאים את המערכת sfGFP פיצול לחקירה של שאלות ביולוגיות נוספות או אופטימיזציה בתנאי המעבדה נתונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הפעולות מבוצעות בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.
1. הכנה של חומרים צמח (4 שבועות)
- הכנה הצמחים benthamiana ש
- לזרוע 2 זרעי benthamiana (ש ע) על פני אדמת כל הסיר, מכסים את המגש עם כיפה פלסטיק, ולאפשר הזרעים לנבוט ב- 25 ° C, 60% לחות הצמיחה קאמרית עם מחזור 16/8-h/כהה photoperiod.
- אחרי שבועיים, לבחור למחוק שתיל הקטן ביותר בכל סיר ו להמשיך לגדל צמחים בתנאים צמיחה אותו כפי שהוא מיושם עבור הנביטה בשלב 1.1.1. להוסיף 1 ליטר של מים למגש כל יומיים.
הערה: תנאי גידול הצמחים עשויים להשתנות על פני מעבדות. לכן, לפי התקנון השקיה רגיל כדי לגדל את הצמח במצב בריא. - בעוד שבוע, להעביר את הצמחים למגש חדש ולסדר אותם עם מרחב הולם לצמיחה נוספת. לשמור על גידול הצמחים בתנאים המתוארים שלב 1.1.1 עד שהם יהיו מוכנים להיות חדרו רוב בגיל 4 שבועות.
הערה: צימוח עשויות להשתנות בהתאם התנאי צמיחה על פני מעבדות. בדרך כלל, אנו מוצאים את השבוע בת 4 benthamiana ש צמחים לשאת 6 עלים.
- הכנה הצמחים הטרנסגניים לבנה א
- עיין בטבלה של חומרים , להזמין את הזרעים תודרנית מהונדס.
- להשרות זרעי תודרנית הטרנסגניים ~ 50-100 מ של מים מזוקקים ואחסן אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים בחושך כדי לסנכרן את התחלתה של נביטה.
- לזרוע זרעים ~ 2-3 על פני אדמת מגש צמח הכנס ולכסות את המגש עם כיפה פלסטיק. לאפשר הזרעים לנבוט ב 23 ° C, 60% לחות עם מחזור 10/14-h/כהה photoperiod.
הערה: הזרעים צריך להיות homozygotes. עם זאת, אנו ממליצים reconfirming על הימצאות transgene באצווה. במקרה זה, לעקר את הזרעים בשטיפה עם אתנול 70% למשך 2 דקות, 50% מלבין (תת-2% על כלורי) המכילה 0.05% טריטון X-100 עבור 5 דק בעקבות כביסה 5 - 6 פעמים עם מים מזוקקים זוגי סטרילי (ddH2O). לאחר עיקור, stratify ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים, צלחת אותם במדיה נביטת הצמח המכיל 25 µg/L של hygromycin B כדי לבחור את הצמחים הטרנסגניים. - לאחר שבוע, להשאיר צמח אחד בלבד לכל הכנס והמשך גידול הצמחים בתנאים הצמיחה באותו המשמש שלב 1.2.3.
הערה: בן בשבוע-4 צמחים שימשו את הזיהום syringae פ . מים צמחים בכל יום נוספים כדי לשמור על הצמחים בריא.
2. הכנת Pseudomonas תרבות (~ 1 לשבוע)
- בניית פלסמיד לשינוי Pseudomonas
- עיין בטבלה של חומרים , להזמין את vector(s) הרצוי של וקטור מערכת משלוח25אפקטור מבוסס T3SS.
- הכנס את הגן אפקטור עניין הווקטור משלוח אפקטור באמצעות רקומבינציה בייעודי לאתר שיבוט25.
הערה: בעת פיקוח על לוקליזציה subcellular של חלבון אפקטור באורך מלא, למקם את הגן באורך מלא לתוך pBK-GW-1-2 או זה פשוט-GW-1-2. זה גם אפשרי לבחור pBK-GW-1-4 או זה פשוט-GW-1-4 המכיל 2 x sfGFP11 עבור גדל פלורסצנטיות אות. במקרה של אפקטור חלקית חסר אות פפטיד, השתמש pBK-GW-2-2 או pBK-GW-2-4. עיין פארק ואח . לקבלת מידע מפורט אודות אפקטור משלוח וקטורים25.
- להפוך את פלסמיד נושא של אפקטור דבוקה תג sfGFP11 פ syringae pv. עגבניות (Pst) CUCPB5500 באמצעות אלקטרופורציה תקן29.
הערה: זנים Pseudomonas אחרים ניתן להשתמש במידת הצורך. מערכת תג sfGFP11 נבנית עבור מגוון רחב של וקטורים30 , בביטוי הגן של אפקטור מוסדר על ידי האמרגן AvrRpm1, אשר הוא דומה, למשל, Pseudomonas fluorescens (איתן)31. - להפיץ את התאים חיידקי טרנספורמציה בעדינות על-פני B אגר צלחות המלך המכיל 100 µg/mL ריפאמפיצין ו 25 kanamycin µg/mL או 25 gentamycin µg/mL. דגירה-28 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
- לחסן מושבה אחת לתוך המדיה נוזלי B של המלך עם אנטיביוטיקה מתאימה הווקטור המשמש ולהגדיל את התאים בן לילה ב 28 ° C ברעידות-200 סל ד.
- הופכים מניה גליצרול. להוסיף גליצרול בלוק ריכוז סופי של 50% והחנות-80 מעלות צלזיוס.
3. ארעי ביטוי של אברון, ממוקדות sfGFP1-10הכבושים ב benthamiana ש (4 ימים)
- הכנה של תרבות Agrobacterium
- סדר vector(s) הרצוי של אברון, ממוקדות sfGFP1-10הכבושים plasmid(s) (עיין טבלה של חומרים).
- להפוך את plasmid(s) Agrobacterium tumefaciens זן GV3101 תאים32. לגדל את התאים באמצעי אגר לוריא-Bertani (LB) בתוספת 50 µg/mL kanamycin, ריפאמפיצין µg/mL 50-28 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
- ממושבה בודדת על המדיום אגר ליברות, לחסן את התאים לתוך 5 מ של מדיה LB נוזלי בתוספת 50 kanamycin µg/mL ו- 50 ריפאמפיצין µg/mL. לצמוח התאים בן לילה ב 28 ° C ברעידות-200 סל ד.
- קציר התאים על ידי צנטריפוגה ב x 3000 g עבור 10 דקות יוצקים את התקשורת supernatant, resuspend בגדר ב 1 מ"ל של טרי עשוי מאגר הסתננות.
- למדוד את כמות Agrobacterium על ידי קבלת הערך צפיפות אופטית (OD) ספיגת של 600 nm (Abs 600 ננומטר). התאם את יתר600 של החיידקים כדי 0.5 עם חדירה מאגר.
הערה: 1 מ"ל של השעיה זה מספיק כדי לחדור על שני מקומות. - להשאיר את התרבות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה עדין עבור h 1-5 לפני חדירה.
- דקרו לתוך המרכז של העלים ועמדו להסתנן עם טיפ µL 10. השתמש מזרק needleless 1-mL כדי לחדור את המתלים Agrobacterium . לאט ובזהירות להזריק µL כ-500 של המתלים שהוכנו מ שלב 3.1.5 לתוך הצד adaxial עלה דרך המזרק. חזור על החדירה לפחות שלושה צמחים משכפל ניסיוני.
הערה: בשל סיבות בטיחות וגהות, הגנה העין יש ללבוש במהלך חדירה. - . נגבי את המתלים חיידקי הנותרת על העלים ולסמן את הגבול של האזור הסתנן.
- שמור את הצמחים הסתנן תחת באותם התנאים לצמיחה המשמש שלב 1.1.1 במשך יומיים.
4. חיסון של Pseudomonas (4 ימים)
- פס המתח Pseudomonas טרנספורמציה מן המלאי גליצרול בשלב 2.5 במדיה של המלך B אגר עם האנטיביוטיקה המתאימה ב- 28 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
הערה: הבריאות של Pseudomonas הוא מאוד קריטי. אם המושבות לא בצורת. ובכן, צובעות את התאים שוב או להפיץ את התאים בתקשורת נוזלי של המלך, לפני שתמשיך. - לחסן loopful של תאים Pseudomonas מניטול-גלוטמט (מ ג) בתקשורת נוזלי ב 28 ° C ברעידות-200 סל"ד נלון.
- קציר התאים על ידי צנטריפוגה ב x 3000 g עבור 10 דקות יוצקים את התקשורת supernatant, resuspend בגדר ב- 10 מ מ MgCl2ולהתאים את יתר600 עד 0.02 (1 x 107 cfu/mL) עלים benthamiana ש וכדי 0.002 (1 x 106 cfu/mL) עבור תודרנית עלים.
- עבור benthamiana ש, לחדור את המתלים Pseudomonas האזור של העלים איפה Agrobacterium נושא sfGFP1-10OPT לבנות חדרו יומיים קודם לכן (כמו שלב 3.1.7). עבור sfGFP1-10OPT הטרנסגניים תודרנית, לחדור את המתלים Pseudomonas שני בת 4 שבוע קצר תוצרת יום עלים.
הערה: לפחות שלושה צמחים יש צורך משכפל ניסיוני.
5. התבוננות sfGFP אות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (יום 1)
- לגזור את הדיסק עלה מ Pseudomonas-מחוסן עלים. בנקודות זמן מסוים לאחר חדירה של Pseudomonas, תמונת שני דיסקים עלה 2-ס מ2 מצמח יחיד באמצעות לייזר קונפוקלי מערכת עם 40 X סריקה / 1.2 נה ג-עדשה אפוכרומטית מים טבילה אובייקטיבית או 63 X / 0.8 נה ג-עדשה אפוכרומטית שמן טבילה המטרה. כדי להימנע תאים מתים נהרג מירי ופצעו, לבחון את התאים מן החור הסתננות.
- התחל את ההתבוננות בקביעה צריכת חשמל נמוכה 488 ננומטר ללייזר. להגביר את עוצמת הלייזר כדי לזהות sfGFP.
הערה: בדרך כלל נשתמש 2-15% של עוצמת לייזר כדי לזהות את האות זריחה. עם זאת, עוצמת הלייזר ואת הגדרת זיהוי צריך להיות מותאם על פי המערכת מיקרוסקופיה של המשתמש. . הנה, המסננים פליטה מוגדר על 520-550 ננומטר. התאים המתים פולטים לעיתים קרובות אוטומטי-זריחה תחת עירור 488 ננומטר לייזר. לכן, כפקד שלילי, אפקטור אותו ללא תג sfGFP11 צריך להיות חדרו, שנצפו תחת השגחה באותם התנאים. בנוסף, עירור גבוהה לייזר יכול לגרום autofluorescence כלורופיל. לכן, להתאים את עוצמת לייזר באמצעות תאי צמחים הבקרה כדי לא לגרום autofluorescence כלורופיל.- עבור counterstaining של דופן התא, לחדור יודיד propidium 20 מ מ (PI) הדיסק עלה ב 5-10 דקות לפני התצפית.
- עבור גרעין מכתים, להטביע את הדיסקים עלה לתוך paraformaldehyde 0.1% למשך 5 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים. לאחר מכן, לחדור את 10 מ מ PI קסרתהל עלה ב 5-10 דקות לפני תצפית מיקרוסקופית. חזור על הניסויים לפחות שלוש פעמים.
הערה: השלב זה לא קריטי אבל מועיל להגדרת לוקליזציה אפקטור קרום פלזמה או לגרעין. אם effectors עניין הראה לוקליזציה שלהם אברון ספציפי, השתמש סמן אברון נתון כדי לאשר הלוקליזציה של אפקטור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המבנה β-חבית של GFP מורכב של קווצות β 11 ואת ניתן לחלק שני קטעים, 1-10בתאנון סטראנד (GFP1-10OPT) ומלון סטראנדth (GFP11) 11. למרות של פלורסנט בכוחות עצמם שני קטעים, sfGFP עצמית שהורכב שמתרגל את זריחה כאשר קיימים שני קטעים בסמיכות (איור 1 א'). במערכת זו, sfGFP1-10OPT-צמחים תודרנית או benthamiana ש מחוסנים עם Pseudomonas נושא של אפקטור sfGFP11 מתויג. אפקטור sfGFP11 מתויג מועברים על ידי Pseudomonas לתוך ציטוזול של התא המארח הוא מחדש את sfGFP1-10OPT לידי ביטוי ציטוזול, ואז translocate יחד לתוך תא המטרה (איור 1B). איור 2 מייצג בהליך הכולל, ההכנה של חומרים צמח Pst כדי זיהוי האות פלורסצנטיות בתא צמח.
כדוגמה בשיטה שלנו, השתמשנו החלבון אפקטור פ syringae , AvrB, אשר מועבר לתוך תאי צמחים מארח יסודית את T3SS במהלך זיהום. ב תודרנית, AvrB מזוהה על ידי חלבון ההתנגדות המתאים, RPM1, מעורר תגובות מערכת החיסון כולל מוות תא רגיש33. במחקר הקודם, וזמינותו כתב GFP ואת וזמינותו הביוכימי חשף כי AvrB ו- RPM1 הם נקודתיים קרום הפלזמה של34,3533,תא הצמח. לבחון הלוקליזציה של AvrB בשיטה שלנו, Agrobacterium מחסה הגןהכבושים sfGFP1-10 CYTO חדרו ב benthamiana ש. בעוד יומיים, תאים AvrB-sfGFP11-טרנספורמציה Pseudomonas חוסנו לתוך Agrobacterium-אזור חדרה. זריחה sfGFP המלווים אותות נצפתה CUCPB5500 Pst המכיל AvrB-sfGFP11-קרום פלזמה (איור 3B). לעומת זאת, אין אותות נמצאו את התא הנגוע על ידי Pst נושא מקורי AvrB (איור 3 א).
איור 1. מערכת ה-GFP פיצול ממוטבת. (א) המבנה β-חבית של GFP עשוי β 11-גדילי, ניתן לחלק 1-10בתאנון β-סטרנד (GFP1-10) ו- 11ה β-סטרנד (GFP11). (B) בשיטה זו, השבריםהכבושים sfGFP1-10-באו לידי ביטוי בתאי הצמח, בעוד סטרנד sfGFP11 הייתה דבוקה AvrB והפך Pseudomonas. רק צמחים תא נגוע על ידי Pseudomonas המכיל sfGFP11 יראה את זריחה sfGFP (איפה אפקטור רגישה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. סקירה של ההליך- את הטרנסגניים תודרנית או בשטחיםהכבושיםשל sfGFP1-10-חדרו benthamiana ש צמחים נגועים Pst CUCPB5500 נושאת אפקטור מתויג sfGFP11 באמצעות מזרק הסתננות. ניתן להבחין את זריחה של sfGFP שהורכב דרך מערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית באתר של ההתאמה אפקטור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. זיהוי AvrB-sfGFP- benthamiana ש משאיר 3 h לאחר זיהום. ה-Pst CUCPB5500 מחסה שגן AvrB מתויג sfGFP11 היה הסתנן את 5th או עלהה 6 של benthamiana (ש ע), אשר חדרו מאת Agrobacterium נושא sfGFP1-10 בשטחיםהכבושים יומיים קודם לכן. קיר התא הוכתם propidium יודיד. תוך התאים לבטא sfGFP1-10 בשטחים הכבושים עם AvrB בלבד אינם מראים כל אות קרינה פלואורסצנטית (A). האותות GFP (חץ צהוב) נצפו על התאים הנגועים מאת Pst המכיל גנים AvrB-sfGFP11-3 שעות לאחר חדירה (B). תוצאה זו מייצג כי רק AvrB-sfGFP11, לא AvrB, הוא מחדש עם sfGFP1-10OPT -ציטוזול, ואז sfGFP שהורכב translocated את קרום פלזמה. פסאודו מגנטה צבע מייצג את דופן התא ואת autofluorescence כלורופיל. הירוק מייצג את זריחה sfGFP התאספו. גודל ברים = 40 µm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן משמש לניטור לוקליזציה מדויק של החלבונים אפקטור מוזרק על ידי רופא חיידקי T3SS לתוך התא הפונדקאי צמח על זיהום. בעבר, מערכת ה-GFP פיצול שימש ככלי ללמוד את subcellular לוקליזציה של יונקים חלבונים23,36, סלמונלה T3E לוקליזציה ומסירת Agrobacterium VirE2 דרך T4SS לתוך צמח תאים37. כדי להחיל מערכת זו בתאי הצמח, מחקרים קודמים משמש הטרנסגניים תירס צמח צורונים שיבטא את GFP1 cytoplasmic-10 ופטריות מהונדס, פחמון זקן התירס, המבטאת את החלבון מתויג GFP11 אפקטור. עם זאת, תירס -זקן התירס U. המערכת לא היתה מוצלחת כי רמות ביטוי החלבונים translocated אפקטור היו חלשים, רמה גבוהה של הרקע autofluorescence המניע את הגילוי של אות ה-GFP משוקם38. כדי לתקן בעיה זו, השתמשנו sfGFP1-10 variant, sfGFP1-10בשטחים הכבושים, המשפר באופן משמעותי את מסיסות, קרינה פלואורסצנטית בעוצמה21,22.
למרות היתרונות של מערכת sfGFP מפוצל, ישנן כמה מגבלות לחדר העבודה של לוקליזציה אפקטור ואת הדינמיקה. ראשית, האות פלורסנט שנצפה sfGFP משוקם הוא יחסית חלש. זה יכול להיות בגלל כמות קטנה של מולקולות אפקטור מועברת ישירות מ- syringae פ. . האות חלש הזה יכולים להשתפר באמצעות התג sfGFP11 multimerizing. הווקטורים נושא תג x sfGFP11 2 זמינים גם מן המקורות המופיעים בטבלה של חומרים. שנית, sfGFP1-10 cytosolic בשטחים הכבושים נכשלה להיות מחדש עם sfGFP11 ממוקד גולג'י, ER ופלסטידה25. ביטוי שיתוף של המיטוכונדריה, ממוקדות sfGFP11 ו- sfGFP1-10 cytosolicהכבושים כתוצאה mislocalization של sfGFP מחדש בשמו החוקי ציטוזול ואת גרעין25. לכן, לוקליזציה של אפקטור עניין צריך לאמת מחדש על-ידי החלת את המתאים, ממוקדות אברון sfGFP1-10בשטחים הכבושים. כאשר כל אות GFP לא זוהה בתאים נגועים לבטא sfGFP1-10 cytosolicהכבושים, אנו ממליצים על שימוש benth (ש ע) ביטוי גולג'י, המיון, ופלסטידה ממוקד sfGFP1-10בשטחים הכבושים או באמצעות האברון המשמש המתאימים לפלח sfGFP1-10OPT הטרנסגניים תודרנית25.
בשיטה זו הפגין את השימוש במערכת חלבון פלואורסצנטי פיצול ככלי שימושי כדי לבחון את הדינמיקה הגיאופוליטיות והמרחביות הטמפורלי של effectors צמחים מארח25. להמשך המחקר יתמקד הטכנולוגית הדמיה מולקולה בודדת, אשר עשוי לאפשר מחקרים מפורטת של הדינמיקה של קרום פלזמה מותאם לשפות אחרות effectors. יתר על כן, וזמינותו הפרשת באמצעות מערכת חיידקי יכול להיות חלופה יעילה ללמוד לוקליזציה של פטריות effectors; זה מונע את המצבור של effectors ושל autofluorescence גבוהה באתר חדירה פטרייתי.
יצוין, כי ישנם כמה נקודות מפתח בשיטה זו. ראשית, חומרים צמח וחיידקים צריך להיות בריא ורענן. כדי להבטיח ויזואליזציה של האות אפקטור, sfGFP1-10 בשטחיםהכבושים מצמחים והן את sfGFP11 של Pseudomonas כדאי בחום להתבטא. לכן, חשוב לגדל צמחים בתנאים מיטביים לצמיחה, להגן עליהם מפני לחצים סביבתיים, כגון מזיקים. בנוסף, אנו ממליצים כי כל החיידקים המשמשים חדירה להילקח התאים גדל-יום 2 על הלוחות אגר ולא מניות גליצרול. שנית, במקרה של ביטוי benthamiana שארעית, משך הזמן הדרוש ההבשלה של sfGFP1-10, ממוקדות אברוןOPT עשוי להשתנות עבור כל חלבון סמן אברון. לדוגמה, ההבשלה של PM-sfGFP1-10OPT דורש יותר מ- 48 שעות לאחר חדירה. ולבסוף, נקודת הזמן ואת רמות הביטוי של האותות sfGFP משוקם תלוי בסוג של חלבונים אפקטור הנדרשים כדי למטב את כמה תנאים ניסיוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי תכנית המחקר מדע בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד המדע, ICT תכנון עתידי (ה-NRF-2018R1A2A1A05019892) הבירה ועל ידי מענק של מרכז רבייה מולקולרית של צמחים ( PMBC) של התוכנית 21 Biogreen ' הדור הבא ' של המינהל לפיתוח כפרי (PJ013201) כדי EP. אנו מודים למרכז הדמיה של המרכז הלאומי מכשור לניהול סביבתי לספק מיקרוסקופ קונפוקלי לצלם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidopsis transgenic lines | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
| NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
| PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
| Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
| NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
| PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
| ER-sfCherry1-10 | Addgene | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
| CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
| sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| Bacterial strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml) | ||
| Media components | |||
| Plant germination media | Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve. | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | Store at 4 °C. |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| LB media | Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed. | ||
| Tryptone | BD Bioscience | 211705 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| NaCl | Duchefa Biochemie | S0520 | |
| Micro agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
| King's B media | 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed. | ||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 212120 | |
| Anhydrous K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
| Glycerol | Duchefa Biochemie | G1345 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
| Mannitol-Glutamate (MG) liquid media | Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7 | ||
| Mannitol | Duchefa Biochemie | M0803 | |
| L-glutamic acid | Duchefa Biochemie | G0707 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
| Infiltration buffer | 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use. | ||
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize. |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Prepare 100 mM stock in water. Autoclave. |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM stock in DMSO. |
| Confocal microscope equipments/materials | |||
| 710 laser scanning confocal system | Carl Zeiss | ||
| Axio observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| Propidium iodide | ThermoFisher | P1304MP |
References
- Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).
- Buttner, D. Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells. FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 4 (2013).
- Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants. J Bacteriol. 180 (17), 4523-4531 (1998).
- Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Semin Cell Dev Biol. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).
- Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants. Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).
- Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
- Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiol. 122 (4), 999-1001 (2000).
- Courbot, M., et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol. 144 (2), 1052-1065 (2007).
- Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
- Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function. J Biol Chem. 278 (16), 14196-14202 (2003).
- Reinicke, A. T., et al. A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery. J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).
- Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization. Cell. 137 (2), 283-294 (2009).
- Fernandez-Alvarez, A., et al. Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis. PLoS Pathog. 8 (3), e1002563 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, Á Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52 (1), 59 (2008).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).
- Cabantous, S., et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association. Sci Rep. 3, 2854 (2013).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nat Commun. 7, 11046 (2016).
- Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors. Nat Methods. 7 (4), 325-330 (2010).
- Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017).
- Addgene. , Available from: https://www.addgene.org (2018).
- Arabidopsis Biological Resource Center. , Available from: https://abrc.osu.edu (2018).
- Kvitko, B. H., et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4), e1000388 (2009).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Kovach, M. E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Upadhyaya, N. M., et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat. Mol Plant Microbe Interact. 27 (3), 255-264 (2014).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc. 2006 (7), (2006).
- Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).
- Nimchuk, Z., et al. Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae. Cell. 101 (4), 353-363 (2000).
- Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
- Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells. Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).
- Tanaka, S., et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).
