Summary
Fluoreszierende Protein-basierte Ansätze, Effektoren abgesondert von Bakterien in Wirtszellen zu überwachen sind anspruchsvoll. Dies ist aufgrund der Inkompatibilität zwischen fluoreszierende Proteine und die Typ-III-Sekretion-System. Hier wird eine optimierte Split Superfolder GLP-System zur Visualisierung von Effektoren abgesondert von Bakterien in die Wirtszelle Pflanze verwendet.
Abstract
Bakterien, eines der wichtigsten Erreger von verschiedenen Pflanzenkrankheiten, absondern, eine Reihe von Effektor-Proteine in die Wirtszelle Pflanze, die Pflanze Immunsystem zu untergraben. Während der Infektion werden zytoplasmatischen Effektoren Host Zytosol über einen Typ III-Sekretion System (T3SS) geliefert. Nach der Anlieferung in die Pflanzenzelle zielt auf die Effector(s) der spezifischen Kompartiments um Zelle Hostprozesse für Überleben und Replikation des Erregers zu modulieren. Zwar gab es einige der Forschung auf die subzelluläre Lokalisation der Effektor-Proteine in den Wirtszellen, ihre Funktion in der Pathogenität zu verstehen, durch die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen, Untersuchung der Dynamik von Effektoren direkt aus Bakterien injiziert ist aufgrund der Inkompatibilität zwischen der T3SS und fluoreszierende Proteine eine Herausforderung gewesen.
Hier beschreiben wir unsere jüngsten Methode eines optimierten Split Superfolder grün fluoreszierendes Protein Systems (SfGFPOPT), die Lokalisierung von Effektoren geliefert über die bakterielle T3SS in der Wirtszelle zu visualisieren. Die sfGFP11 (11th β-Aktionsbereich des SfGFP)-tagged Effektor abgesondert durch die T3SS kann mit einem bestimmten Organell, die gezielte sfGFP1-10OPT (1-10th β-Aktionsbereich des SfGFP) führenden zur Fluoreszenzemission am Standort montiert werden. Dieses Protokoll enthält eine Prozedur zum rekonstituierten SfGFP Fluoreszenzsignal mit einem Effektor-Protein von Pseudomonas Syringae in einem bestimmten Organell in Arabidopsis und Nicotiana Benthamiana Pflanzen zu visualisieren.
Introduction
Pflanzen sind festsitzende Organismen, die zahlreiche eindringende Krankheitserreger wie Bakterien, Pilze, Viren, Insekten und Nematoden während ihres gesamten Lebenszyklus zu begegnen. Unter den phytopathogene Gramnegative bakterielle Krankheitserreger wie Pseudomonas spp. und Ralstonia spp., infizieren ihre Wirtspflanzen durch Eingabe durch Wunden oder natürliche Öffnungen, z. B. die Spaltöffnungen und Hydathode1. Um erfolgreich Wirtspflanzen besiedeln, haben bakterielle Krankheitserreger entwickelt, um eine Vielzahl von Virulenz Faktoren2entwickeln. Wenn Bakterien eine Wirtspflanze eindringen, sie injizieren eine Reihe von Virulenz Proteinen – bekannt als Effektoren – direkt in die Pflanzenzellen ihre Pathogenität zu fördern. Diese Effektoren unterdrücken oder modulieren die Pflanze angeborene Immunität und zelluläre Hostprozesse um bakterielle überleben3führen zu manipulieren.
Pathogene Bakterien verwenden hauptsächlich eine T3SS Effektor-Proteine direkt in Host Zellen4liefern. Das T3SS ähnelt eine molekularen Spritze mit einem nadelartigen Kanal Anschluss von einem Gerüst-Protein-Struktur über die innere und die äußere bakterielle Membranen an der Injektionsstelle des Host Zelle5. Dieser T3SS-vermittelte Effektor (T3E) Sekretion Mechanismus ist gut erhaltenen in verschiedenen Gramnegative bakterielle Erreger der Anlage als auch menschliche. Eines der repräsentativen Pflanzenpathogene, p. Syringae pv. Tomaten DC3000 HrcC Mutant hat in der Regel eine defekte T3SS beschränkt hat Wachstum bei Pflanzen wahrscheinlich aufgrund der Unfähigkeit dieser Mutante, die Pflanze Immunität (durch die Injektion von Effektor-Proteine)6vollständig zu unterdrücken. Bei der Translokation in den Wirtszellen Ziel Effektoren verschiedene Host-Proteine, die wichtig für das Hostsystem Zelle, einschließlich Anlage Verteidigung Antworten, Gentranskription Zelltod, Proteasom, Vesikel Menschenhandel und Hormon Wege7 , 8 , 9 , 10. Verfolgung von der zellulären Lokalisation der Effektor-Proteine in den Wirtszellen deshalb ein attraktives Ziel, ihre Funktionen in Bezug auf die Modulation der Pflanze Immunität zu verstehen.
Die meisten Studien, Lokalisierung von den T3Es haben Agrobakterium -vermittelten Überexpression mit einem großen Fluoreszenz-Protein in der Host-Anlage9beschäftigt. Jedoch die heterologen Expression-Methode nach Genen, die bei anderen Spezies eingeführt werden nachweislich falsch lokalisierten oder gelegentlich nicht-funktionale11,12,13Jahre alt sein. Darüber hinaus ergab mehrere Studien, dass bakterielle Effektoren Modifikation für eine korrekte Ausrichtung in den Host Zellen14,15,16,17unterziehen. Daher äußerte vorübergehend Effektoren in das Zytosol der Anlage können Zellen nicht quantitativ oder funktional identisch mit den Effektoren, die durch die T3SS auf Erreger Infektion18geliefert werden. Darüber hinaus kann die Fusion von großen fluoreszierende Tags Effektorproteine richtige Effektor Lieferung und Visualisierung18,19stören. Daher können diese Ansätze für die T3E Funktion assay nicht voll die native Lokalisierung des T3SS abgesondert Effektoren widerspiegeln.
Ein grünes fluoreszierendes Protein (GFP) besteht aus einer 11-Stranded β-Fass umschließt ein Leitbündel, die ein Chromophor20enthält. Waldo Et al. berichtet eine neuartige Split-GFP-System, das eine kleine Komponente besteht (GFP β Aktionsbereich 11; GFP11) und ein großes ergänzende Fragment (GFP β Strang 1-10; GFP1-10)21. Die Fragmente nicht fluoreszieren selbst aber auf ihre selbstassoziation fluoreszieren, wenn beide Fragmente in der Nähe miteinander sind. Für die Optimierung der Protein Falten Effizienz wurden robuste faltbare Varianten der GFP, d. h., SfGFP und SfGFPOPT, anschließend für die Split GFP System20,21,22entwickelt. Vor kurzem, einzelne Aminosäure mutierte Varianten des sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT und sfCFP1-10OPT-, die mit sfGFP11 Fragment und Show gelb und Cyan Fluoreszenz bzw. rekonstruieren können, waren generierten23 . Darüber hinaus SfCherry, ein Derivat des mCherry, kann aufgeteilt werden in sfCherry1-10 und sfCherry11 Fragmente in der gleichen Weise wie SfGFP23.
Dieses System wurde angepasst zu kennzeichnen und verfolgen die T3SS Effektoren in HeLa-Zellen während der Infektion mit den Effektoren von Salmonellen24. Jedoch war es bisher nicht für das Hostsystem Pflanze-bakterielle Erreger optimiert. Vor kurzem haben wir optimiert Split GFP-System basierend auf die verbesserte sfGFP1-10OPT , die subzelluläre Lokalisation der T3Es von p. Syringae in pflanzlichen Zellen25geliefert zu überwachen. Zur Erleichterung der Lokalisierungs-Arbeiten des T3Es zu verschiedenen subzelluläre Kompartimente in den Pflanzenzellen, eine Reihe von transgenen Arabidopsis Thaliana wurden Pflanzen erzeugt, um sfGFP1-10OPT in die verschiedenen subzelluläre Kompartimente express 25. Darüber hinaus Plasmide tragen eine Vielzahl von Organell-sfGFP1-10OPT für gezielt Agrobakterium-vermittelten transiente Überexpression und die sfGFP11-Tags Vektoren für die Lieferung des T3SS-basierte Effektor auch erzeugt wurden. Die Samen der verschiedenen transgenen Arabidopsis -Linien und die Plasmide, die T3Es von Interesse auszudrücken erhalten Sie bei Quellen, die in der Tabelle der Materialien26,27erwähnt.
In das folgende Protokoll beschreiben wir ein optimales System zur Überwachung der Dynamik von Effektoren von Bakterien in den Wirtszellen mit Split-SfGFP-System geliefert. Infektion von Pflanzen, sfGFP1-10OPT mit transgenen Pseudomonas tragen rekombinante sfGFP11 Plasmid führt zu einer Lieferung von der sfGFP11-Tags Effektor von Pseudomonas in der Wirtszelle. Infolgedessen diese Proteine sind wieder hergestellt und zu bestimmten Effektor Ziel Kompartiments translozieren. Pseudomonas Syringae pv. Tomaten Verwendet wurde CUCPB5500-Stamm, die in dem 18 Effektoren gelöscht werden, weil diese Sorte niedrige oder keine Zelltod in A. Thaliana und N. Benthamianas28zeigte. Jedoch können alle Materialien und hier beschriebenen Schritten ersetzt oder geändert, um Split-SfGFP-System zur Untersuchung von anderen biologischen Fragen oder Optimierung unter bestimmten Laborbedingungen anzupassen.
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Protocol
Hinweis: Alle Schritte sind bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
1. Vorbereitung von pflanzlichen Stoffen (4 Wochen)
- Vorbereitung auf die N. Benthamiana Pflanzen
- 2 säen von N. Benthamiana auf der Bodenoberfläche von jedem Pot, das Fach mit einer Plastikhaube abdecken und lassen Samen zum Keimen in einem 25 ° C, 60 % Luftfeuchtigkeit Wachstum Kammer mit einem 16/8-h hell/dunkel Photoperiode Zyklus.
- Nach zwei Wochen herausgreifen und verwerfen die kleinste Sämling in jeden Topf und weiterhin wachsen Pflanzen unter den gleichen Bedingungen wie für die Keimung im Schritt 1.1.1 angewendet. Fügen Sie 1 L Wasser pro Fach alle zwei Tage.
Hinweis: Die Wachstumsbedingungen für Pflanzen variieren in Labors. Deshalb folgen Sie die regelmäßige Bewässerung Protokoll um die Pflanze in einem gesunden Zustand wachsen. - Übertragen Sie in einer Woche die Pflanzen auf ein neues Tablett und ordnen sie mit ausreichend Platz für weiteres Wachstum. Halten, wachsen Sie die Pflanzen unter den Bedingungen im Schritt 1.1.1 beschrieben, bis sie bereit sind, im Alter von 4 Wochen infiltriert werden.
Hinweis: Pflanzenwachstum unterscheiden sich je nach Wachstum in Labors. In der Regel finden wir, dass die 4 Wochen alten N. Benthamiana Pflanzen tragen etwa sechs Blätter.
- Vorbereitung für A. Thaliana transgene Pflanzen
- Beziehen sich auf die Tabelle der Materialien und der transgenen Saatguts Arabidopsis bestellen.
- ~ 50-100 transgenen Arabidopsis Samen in 1 mL destilliertem Wasser einweichen und aufbewahren bei 4 ° C für 3 Tage in der Dunkelheit, den Beginn der Keimung zu synchronisieren.
- ~ 2-3 säen auf der Bodenoberfläche eines Stecker-Pflanze-Tabletts und Tablett mit einer Plastikhaube abdecken. Samen keimen bei 23 ° C, 60 % Luftfeuchtigkeit mit einem Zyklus von 10/14-h hell/dunkel Photoperiode zu ermöglichen.
Hinweis: Die Samen sollte homozygoten. Wir empfehlen jedoch die erneute Bestätigung der Anwesenheit des Transgens im Batch. In diesem Fall sterilisieren die Samen durch Waschen mit 70 % Ethanol, 2 min, 50 % Bleichmittel (ca. 2 % Hypochlorit) mit 0,05 % Triton x-100 für 5 min. durch Waschen 5-6 Mal mit sterilem doppelt destilliertes Wasser (DdH2O) folgen. Nach der Sterilisation bei 4 ° C für 3 Tage zu Schichten und Platte sie auf Pflanzen keimen Medien mit 25 µg/L der Hygromycin B die transgenen Pflanzen auswählen. - Nach einer Woche lassen nur eine Pflanze pro Topf und weiter züchten von Pflanzen unter den gleichen Wachstumsbedingungen für Schritt 1.2.3 verwendet.
Hinweis: Vier Wochen alten Pflanzen dienten die p. Syringae -Infektion. Wasser Pflanzen täglich Pflanzen gesund zu erhalten.
2. Vorbereitung der Pseudomonas -Kultur (~ 1 Woche)
- Bau des Plasmids für Pseudomonas -transformation
- Beziehen sich auf die Tabelle der Materialien und bestellen Sie die gewünschte Vector(s) des T3SS-basierte Effektor Liefersystem Vektor25.
- Legen Sie die Effektor-gen von Interesse in der Effektor-Lieferung-Vektor mit ortsspezifische Rekombination Klonen25.
Hinweis: Beim Überwachen der subzellulären Lokalisierung von Full-Length-Effektor Protein setzen Sie das Full-Length-gen in pBK-GW-1-2 oder pBG-GW-1-2. Es ist auch möglich, pBK-GW-1-4 wählen oder pBG-GW-1-4 mit 2 x sfGFP11 für erhöhten Fluoreszenzsignal. Verwenden Sie im Falle einer teilweisen Effektor fehlt Signalpeptid pBK-GW-2-2 oder pBK-GW-2-4. Sie finden Sie im Park Et Al. für detaillierte Informationen über Effektor Lieferung Vektoren25.
- Das Plasmid trägt ein Effektor verschmolzen, das sfGFP11-Tag, p. Syringae pv zu verwandeln. Tomaten (Pst) CUCPB5500 mit standard Elektroporation29.
Hinweis: Andere Pseudomonas -Stämme können bei Bedarf verwendet werden. SfGFP11 Tag-System ist für eine breite Palette von Vektoren30 gebaut und die Genexpression von der Effektor wird vom Veranstalter AvrRpm1, vergleichbar mit z. B. Pseudomonas Fluorescens (EthAn)31geregelt. - Die transformierten Bakterienzellen sanft über die Oberfläche des Königs B Agarplatten mit 100 µg/mL Rifampicin und 25 µg/mL Kanamycin oder 25 µg/mL Gentamycin verteilt. 2 Tage bei 28 ° C inkubieren.
- Impfen Sie eine Kolonie in des Königs B Flüssigmedien mit Antibiotika für den Vektor verwendet, und wachsen Sie die Zellen über Nacht bei 28 ° C mit schütteln bei 200 u/min.
- Machen Sie einen Glycerin-bestand. Eine Endkonzentration von 50 % und bei-80 ° c autoklaviert Glycerin hinzufügen
3. transiente Expression der Organelle ausgerichtete sfGFP1-10OPT in N. Benthamiana (4 Tage)
- Vorbereitung der Agrobacterium Kultur
- Bestellen Sie die gewünschte Vector(s) der Organelle ausgerichtete sfGFP1-10OPT Plasmid(s) (siehe die Tabelle der Materialien).
- Agrobacterium Tumefaciens Stamm GV3101 Zellen32verwandeln Sie die Plasmid(s). Wachsen Sie die Zellen auf Luria-Bertani (LB) Agar Medium ergänzt mit 50 µg/mL Kanamycin und 50 µg/mL Rifampicin bei 28 ° C für 2 Tage.
- Impfen Sie aus einer einzigen Kolonie auf der LB-Agar-Medium die Zellen in 5 mL LB Flüssigmedien mit 50 µg/mL Kanamycin und 50 µg/mL Rifampicin ergänzt. Wachsen Sie die Zellen über Nacht bei 28 ° C mit schütteln bei 200 u/min.
- Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 10 min. überstand Medien abgießen und das Pellet in 1 mL frisch Aufschwemmen gemacht Infiltration Puffer.
- Messen Sie die Menge der Agrobacterium durch den Erhalt des optische Dichte (OD) Wert auf eine Extinktion von 600 nm (Abs 600 nm). Passen Sie die OD600 der Bakterien auf 0,5 mit Infiltration Puffer.
Hinweis: 1 mL der Suspension ist genug, um an zwei Stellen zu infiltrieren. - Lassen Sie die Kultur bei Raumtemperatur auf eine sanfte Rocker für 1-5 h vor dem Eindringen.
- Stecken Sie ein Loch in der Mitte der Blätter mit einer 10 µL Spitze eingeschleust werden. Verwenden einer nadellosen Spritze 1 mL, um Agrobacterium Suspensionen zu infiltrieren. Injizieren Sie vorsichtig und langsam ca. 500 µL der Suspensionen aus Schritt 3.1.5 Blatt adaxial seitlich über die Spritze vorbereitet. Wiederholen Sie die Infiltration auf mindestens drei verschiedenen Pflanzen für experimentelle repliziert.
Hinweis: Aus Gesundheits- und Sicherheitsgründen sollte während Infiltration Augenschutz getragen werden. - Wischen Sie die restlichen Bakteriensuspension auf den Blättern und markieren Sie die Grenze des Gebietes infiltriert.
- Halten Sie die infiltrierten Pflanzen unter den gleichen Wachstumsbedingungen für Schritt 1.1.1 für 2 Tage verwendet.
4. Beimpfen von Pseudomonas (4 Tage)
- Streifen Sie die transformierte Pseudomonas Belastung aus dem Glycerin bestand im Schritt 2.5 auf des Königs B Agar Medien mit den entsprechenden Antibiotika bei 28 ° C für 2 Tage.
Hinweis: Die Gesundheit der Pseudomonas ist sehr kritisch. Wenn Kolonien nicht gut sind, die Zellen wieder Streifen oder Zellen in flüssigen Medien der König vor dem fortfahren zu propagieren. - Eine IMPFÖSE Pseudomonas Zellen in Flüssigmedien Mannit-Glutamat (MG) bei 28 ° C mit schütteln bei 200 u/min für die Übernachtung zu impfen.
- Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 10 min. aus den überstand Medien Gießen Aufschwemmen das Pellet in 10 mM MgCl2, und passen Sie die OD600 auf 0,02 (1 x 107 KBE/mL) für N. Benthamiana Blätter und 0,002 (1 x 106 KBE/mL) für Arabidopsis . Blätter
- Infiltrieren Sie für die N. Benthamianadie Pseudomonas -Suspension in den Bereich der Blätter, wo die Agrobacterium tragen sfGFP1-10OPT Konstrukt 2 Tage zuvor (wie in Schritt 3.1.7) infiltriert wurde. Infiltrieren Sie für die sfGFP1-10OPT transgenen Arabidopsisdie Pseudomonas -Aufhängung in zwei 4-Woche-alten kurzen Tag gewachsen Blätter.
Hinweis: mindestens drei Pflanzen sind für experimentelle Wiederholungen erforderlich.
5. Beobachtung der SfGFP Signal über konfokalen Mikroskopie (1 Tag)
- Schneiden Sie die Blatt-Disc von Pseudomonas-Blätter geimpft. Zu bestimmten Zeitpunkten nach Infiltration von Pseudomonas, Bild zwei 2-cm-2 -Blatt-Scheiben aus die einzelne Pflanze mit einem Laser-scanning-konfokale System mit 40 X / 1,2 NA C-Apochromat Wasser eintauchen Ziel oder 63 X / 0,8 NA C-Apochromat Ölimmersion Ziel. Zur Vermeidung von toten Zellen getötet durch Verwundung beobachten Sie die Zellen vom Loch eindringen.
- Starten Sie die Beobachtung bei einem low-Power-Wert von 488 nm Argonlaser. Erhöhen Sie die Leistung des Lasers, SfGFP zu erkennen.
Hinweis: Wir verwenden in der Regel 2-15 % der Laserintensität der Fluoreszenzsignal erkennen. Allerdings sollte die Laserleistung und Erkennung Einstellung basiert auf dem System des Benutzers Mikroskopie angepasst werden. Dabei wurden die Emission Filter auf 520-550 nm eingestellt. Die abgestorbenen Zellen emittieren oft Auto-Fluoreszenz unter der 488 nm Laseranregung. Der gleichen Effektor ohne das sfGFP11-Tag sollte daher als Negativkontrolle, infiltriert und unter den gleichen Beobachtungsbedingungen beachtet werden. Darüber hinaus kann hohe Laseranregung Chlorophyll Autofluoreszenz induzieren. Daher die Intensität Laser mit der Pflanzenzellen Kontrolle um nicht Chlorophyll Autofluoreszenz induzieren.- Für eine gegenfärbung der Zellwand, 20 mM Propidium Jodid (PI) in der Blatt-Disc bei 5 bis 10 min vor der Beobachtung zu infiltrieren.
- Tauchen Sie für den Kern, Färbung die Blattscheiben in 0,1 % Paraformaldehyd für 5 min, gefolgt vom Waschen mit Wasser ein. Dann die 10 mM PI in die Blatt-Scheibe bei 5 bis 10 min vor mikroskopische Beobachtung zu infiltrieren. Wiederholen Sie die Experimente mindestens dreimal.
Hinweis: Dieser Schritt ist nicht kritisch, aber hilfreich die Effektor-Lokalisierung in der Plasmamembran oder den Kern zu definieren. Wenn die Effektoren des Interesses ihrer Lokalisation in einem bestimmten Organell zeigte, verwenden Sie einen Marker für die bestimmten Organell, um die Lokalisierung der Effektor zu bestätigen.
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Representative Results
Die β-Fass-Struktur der GFP besteht aus elf β-Stränge und kann in zwei Fragmente, die 1-10th Strand (GFP1-10OPT) und die 11th (GFP11) Strand unterteilt werden. Obwohl weder selbst fluoreszierende zwei Fragmente, kann selbst-zusammengebauten SfGFP die Fluoreszenz ausstrahlen, wenn die beiden Fragmente in der Nähe (Abbildung 1A) vorhanden sind. In diesem System, sfGFP1-10OPT- Arabidopsis oder N. Benthamiana zum Ausdruck bringen Pflanzen mit Pseudomonas tragen einen sfGFP11 getaggt Effektor geimpft sind. Der sfGFP11 markiert Effektor in das Zytosol der Wirtszelle durch Pseudomonas geliefert wird die sfGFP1-10-OPT in das Zytosol ausgedrückt wiederhergestellt und dann zusammen ins Ziel Fach (Abbildung 1 b) translozieren. Abbildung 2 stellt das gesamte Verfahren von der Vorbereitung der pflanzlichen Rohstoffen und Pst auf die Aufdeckung des Fluoreszenzsignals in der Pflanzenzelle.
Als ein Beispiel für unsere Methode verwendet wir p. Syringae Effektor Protein, AvrB, die in die Wirtszellen Pflanze gründlich die T3SS während der Infektion geliefert wird. In Arabidopsiswird durch einen entsprechenden Widerstand Protein, DZ1 und Trigger Immunantworten einschließlich überempfindlich Zelle Tod33AvrB erkannt. In der vorherigen Studie ergab der GFP-Reporter-Assay und der biochemischen Test, dass AvrB und DZ1 in der Plasmamembran der pflanzlichen Zelle33,34,35lokalisiert sind. Um die Lokalisierung der AvrB mit unserer Methode zu untersuchen, war Agrobacterium beherbergen das Zyto-sfGFP1-10-OPT -gen in N. Benthamianainfiltriert. In zwei Tagen AvrB sfGFP11 verwandelt Pseudomonas Zellen in Agrobacteriumgeimpft wurden-Region infiltriert. Ergänzt SfGFP Fluoreszenz-Signale in der Pst -CUCPB5500 beobachtet wurden, enthält AvrB-sfGFP11 an der Plasmamembran (Abb. 3 b). Im Gegensatz dazu keine Signale in der infizierten Zelle Pst fanden tragen native AvrB (Abb. 3A).
Abbildung 1: Die optimierte Split-GFP-System. (A) die β-Fass-Struktur der GFP besteht aus elf β-Stränge und in 1-10th β-Strand (GFP1-10) und die 11th β-Strand (GFP11) aufgeteilt werden kann. (B) bei dieser Methode die sfGFP1-10-OPT -Fragmente wurden in Pflanzenzellen, ausgedrückt, während der sfGFP11 Strang zu AvrB verschmolzen und Pseudomonasumgewandelt. Nur Pflanzen Zelle infiziert durch Pseudomonas mit sfGFP11 zeigen die SfGFP Fluoreszenz (wo der Effektor lokalisiert). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Überblick über das Verfahren. Die transgenen Arabidopsis oder sfGFP1-10-OPT-infiltriert N. Benthamiana Pflanze infiziert sind mit Pst CUCPB5500 tragen einen sfGFP11 getaggt Effektor durch Spritze Infiltration. Die Fluoreszenz des montierten SfGFP kann über ein System der konfokalen Mikroskopie am Standort der Effektor Lokalisierung erkannt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. AvrB-SfGFP-Erkennung auf N. Benthamiana verlässt 3 h nach der Infektion. Die PST-Datei CUCPB5500 beherbergen war ein sfGFP11-Tags AvrB gen infiltrierten auf der 5th oder 6th Blatt N. Benthamiana, die durch Agrobacterium tragen die sfGFP1-10-OPT 2 Tage zuvor infiltriert wurde. Die Zellwand wurde durch Propidium Jodid gefärbt. Während die Zellen mit dem Ausdruck sfGFP1-10 OPT mit AvrB-nur Fluoreszenzsignal (A) nicht angezeigt. Die GFP-Signale (gelber Pfeil) wurden von der PST-Datei mit AvrB sfGFP11 gen in 3 h nach dem Eindringen (B) an den infizierten Zellen beobachtet. Dieses Ergebnis entspricht, dass einzige AvrB-sfGFP11, nicht AvrB mit sfGFP1-10OPT in das Zytosol wiederhergestellt wird und dann die montierten SfGFP an der Plasmamembran umgesiedelt ist. Magenta Pseudo-Farbe repräsentiert die Zellwand und Chlorophyll Autofluoreszenz. Grün repräsentiert die montierte SfGFP Fluoreszenz. Skalieren von Balken = 40 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll dient zur Überwachung der genauen Lokalisierung der Effektor-Proteine der Wirtszelle Pflanze bei Infektion durch die bakterielle T3SS injiziert. Zuvor, Split-GFP-System diente als ein Werkzeug zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierung von Säugetieren Proteine23,36, Salmonellen T3E Lokalisierung und Agrobacterium VirE2 Lieferung durch das T4SS in der Pflanzenzellen37. Um dieses System in den Pflanzenzellen anzuwenden, verwendet frühere Studien eine transgene Maize Pflanze, die konstitutiv drückt die zytoplasmatischen GFP1-10 und transgenen Pilze, Ustilago Maydis, die die GFP11-Tags Effektor-Protein ausdrückt. Jedoch hat der Mais -U. Maydis System nicht erfolgreich gewesen weil der Ausdruck der translozierten Effektorproteine schwach waren und hohes Maß an Hintergrund Autofluoreszenz die Erkennung der rekonstituierten GFP Signal38 erschwert. Um dieses Problem zu beheben, habe wir ein sfGFP1-10 Variante, sfGFP1-10OPT, das verbessert die Löslichkeit und Fluoreszenz Intensität21,22.
Trotz der Vorteile der Split-SfGFP-System gibt es einige Einschränkungen für die Untersuchung der Effektor Lokalisierung und Dynamik. Erstens ist das Fluoreszenzsignal beobachteten rekonstituierten SfGFP relativ schwach. Dies könnte eine kleine Menge der Effektor Moleküle direkt vom p. Syringaezurückzuführen. Dieses schwache Signal könnte verbessert werden, mithilfe der Multimerizing-sfGFP11-Tag. Die Vektoren mit 2 x sfGFP11 Tag stehen aus den Quellen aufgeführt in der Tabelle der Materialienzur Verfügung. Zweitens konnte der cytosolischen sfGFP1-10- OPT nicht mit sfGFP11 gezielt auf Golgi, ER und Plastiden25wieder hergestellt werden. Co Ausdruck von Mitochondrien gezielt sfGFP11 und cytosolischen sfGFP1-10OPT führte zu Mislocalization der neu konstituierten SfGFP der Zellflüssigkeit und Kern25. Daher sollte Lokalisierung von der Effektor von Interesse erneut überprüft werden, durch die Anwendung der entsprechenden Organell-bezogene sfGFP1-10OPT. Wenn kein GLP-Signal in den infizierten Zellen mit dem Ausdruck cytosolischen sfGFP1-10OPTnicht erkannt wird, empfehlen wir, N. Benth Golgi, ER, zum Ausdruck zu bringen und Plastiden gezielteOPT sfGFP1-10 oder unter Verwendung der entsprechenden Organell gezielt sfGFP1-10OPT transgenen Arabidopsis25.
Diese Methode demonstriert die Verwendung von Split-fluoreszierende Protein-System als ein nützliches Werkzeug zu prüfen, die zeitliche und räumliche Dynamik von Effektoren in Host Pflanzen25. Zukünftige Forschung konzentriert sich auf die Fortschritte in der Einzelmolekül-Bildgebung, die detaillierte Untersuchungen der Dynamik der Plasmamembran lokalisiert Effektoren ermöglichen kann. Darüber hinaus möglicherweise ein Sekretion Assay mit einem bakteriellen System nützliche Alternative zur Lokalisierung von Pilz Effektoren zu studieren; Es verhindert die Aggregation von Effektoren und hohe Autofluoreszenz am Standort Pilz eindringen.
Es sei darauf hingewiesen, dass bei dieser Methode gibt es einige wichtige Punkte. Erstens sollten pflanzliche Rohstoffe und Bakterien gesund und frisch sein. Zur Visualisierung der Effektor-Signals zu gewährleisten, sollte die sfGFP1-10-OPT aus Pflanzen und die sfGFP11 von Pseudomonas stark ausgedrückt werden. Daher ist es wichtig, wachsen Pflanzen unter optimalen Wachstumsbedingungen und schützen sie vor ökologischen Stressoren, wie Schädlinge. Wir empfehlen auch, dass alle Bakterien verwendet für die Infiltration von den 2 Tag gewachsen Zellen auf den Agarplatten und nicht von Glycerin Bestände getroffen werden. Zweitens kann die Länge der Zeitaufwand für die Reifung der Organelle ausgerichtete sfGFP1-10OPT bei Transienten Expression in N. Benthamiana, für jedes Organell Marker Protein variieren. Reifung der PM-sfGFP1-10OPT erfordert beispielsweise mehr als 48 h nach eindringen. Schließlich hängen der Zeitpunkt und der Ausdruck der rekonstituierten SfGFP Signale vom Typ der Effektor-Proteine, die erforderlich sind, um einigen experimentellen Bedingungen zu optimieren.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) finanziert vom Ministerium für Wissenschaft, IKT und zukünftigen Raumentwicklung (NRF-2018R1A2A1A05019892), DC und durch einen Zuschuss aus Plant Molecular Breeding Center (unterstützt. PMBC) der nächsten Generation Biogreen 21 Programm der ländlichen Entwicklung Verwaltung (PJ013201), EP Wir danken dem Bildgebungszentrum Instrumentierung Nationalzentrum für das Umweltmanagement zu einem confocal Mikroskop für Dreharbeiten zur Verfügung zu stellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidopsis transgenic lines | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
| NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
| PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
| Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
| NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
| PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
| ER-sfCherry1-10 | Addgene | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
| CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
| sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| Bacterial strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml) | ||
| Media components | |||
| Plant germination media | Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve. | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | Store at 4 °C. |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| LB media | Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed. | ||
| Tryptone | BD Bioscience | 211705 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| NaCl | Duchefa Biochemie | S0520 | |
| Micro agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
| King's B media | 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed. | ||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 212120 | |
| Anhydrous K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
| Glycerol | Duchefa Biochemie | G1345 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
| Mannitol-Glutamate (MG) liquid media | Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7 | ||
| Mannitol | Duchefa Biochemie | M0803 | |
| L-glutamic acid | Duchefa Biochemie | G0707 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
| Infiltration buffer | 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use. | ||
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize. |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Prepare 100 mM stock in water. Autoclave. |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM stock in DMSO. |
| Confocal microscope equipments/materials | |||
| 710 laser scanning confocal system | Carl Zeiss | ||
| Axio observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| Propidium iodide | ThermoFisher | P1304MP |
References
- Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).
- Buttner, D. Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells. FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 4 (2013).
- Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants. J Bacteriol. 180 (17), 4523-4531 (1998).
- Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Semin Cell Dev Biol. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).
- Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants. Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).
- Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
- Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiol. 122 (4), 999-1001 (2000).
- Courbot, M., et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol. 144 (2), 1052-1065 (2007).
- Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
- Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function. J Biol Chem. 278 (16), 14196-14202 (2003).
- Reinicke, A. T., et al. A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery. J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).
- Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization. Cell. 137 (2), 283-294 (2009).
- Fernandez-Alvarez, A., et al. Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis. PLoS Pathog. 8 (3), e1002563 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, Á Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52 (1), 59 (2008).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).
- Cabantous, S., et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association. Sci Rep. 3, 2854 (2013).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nat Commun. 7, 11046 (2016).
- Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors. Nat Methods. 7 (4), 325-330 (2010).
- Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017).
- Addgene. , Available from: https://www.addgene.org (2018).
- Arabidopsis Biological Resource Center. , Available from: https://abrc.osu.edu (2018).
- Kvitko, B. H., et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4), e1000388 (2009).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Kovach, M. E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Upadhyaya, N. M., et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat. Mol Plant Microbe Interact. 27 (3), 255-264 (2014).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc. 2006 (7), (2006).
- Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).
- Nimchuk, Z., et al. Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae. Cell. 101 (4), 353-363 (2000).
- Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
- Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells. Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).
- Tanaka, S., et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).
