Summary
Fluorescerande protein-baserade metoder för att övervaka effektorer utsöndras av bakterier in i värdceller är utmanande. Detta beror på inkompatibilitet mellan fluorescerande proteiner och i typ III sekretionssystemet. Här används en optimerad split superfolder GFP system för visualisering av effektorer utsöndras av bakterier in i växten värdcellen.
Abstract
Bakterier, en av den viktigaste smittämnen olika växtsjukdomar, utsöndrar en uppsättning effektor proteiner i växten värdcellen att undergräva immunsystemet växt. Under infektion levereras cytoplasmiska effektorer till värd cytosolen via en typ III-sekretionssystemet (T3SS). Efter leverans till cellen växt riktar effector(s) den specifika delar skall det ingå för att modulera cell värdprocesser för överlevnad och replikering av patogenet. Även om det varit lite forskning på subcellulär lokalisering av effektor proteiner i de mottagande cellerna att förstå deras funktion i patogenicitet med hjälp av fluorescerande proteiner, utredning av dynamiken i effektorer direkt sprutas från bakterier har varit en utmaning på grund av inkompatibilitet mellan T3SS och fluorescerande proteiner.
Här beskriver vi vår senaste metod av en optimerad split superfolder grönt fluorescerande protein system (sfGFPOPT) att visualisera localizationen av effektorer levereras via den bakteriella T3SS i värdcellen. SfGFP11 (11: e β-del av sfGFP)-märkta effektor utsöndras genom T3SS kan monteras med en viss organell riktade sfGFP1-10OPT (1-10th β-del av sfGFP) leder till fluorescens utsläpp på platsen. Detta protokoll ger en procedur för att visualisera ombildade sfGFP fluorescens signalen med en effektor protein från Pseudomonas syringae i en viss organell i Arabidopsis och Nicotiana benthamiana växter.
Introduction
Växter är oskaftade organismer som möter många invaderande patogener inklusive bakterier, svampar, virus, insekter och nematoder under hela deras livscykel. Bland phytopathogens, infektera de gramnegativa bakteriella patogenerna såsom Pseudomonas spp. och Ralstonia spp., deras värdväxter genom genom sår eller naturliga öppningar, såsom stomata och hydathode1. För att framgångsrikt kolonisera värdväxter, har bakteriella patogener utvecklats för att utveckla en mängd virulens faktorer2. När bakterier invaderar en värdväxt, de injicerar en serie av virulens proteiner — kallas effektorer — direkt in i växtcellerna att främja deras patogenicitet. Dessa effektorer undertrycka eller modulerar den växt medfödd immuniteten och manipulera de värd cellulära processerna för att resultera i bakteriell överlevnad3.
Patogena bakterier använder främst en T3SS för att leverera effektor proteiner direkt i host celler4. T3SS liknar en molekylär spruta med en nål-liknande kanal ansluter från en byggnadsställning proteinstruktur över inre och yttre bakteriell membranen till injektionsstället i den mottagande cell5. Denna T3SS-medierad effektor (T3E) sekretion mekanism är väl bevarade i olika gramnegativa bakteriella patogener av anläggningen samt mänskliga. En av de representativa växt patogenerna, P. syringae pv. Tomat DC3000 hrcC mutant som vanligtvis har en defekt T3SS, har begränsad tillväxt i växter sannolikt på grund av oförmågan av denna mutant att helt undertrycka den växt immunitet (genom att injicera effektor proteiner)6. Vid flyttning in i värdceller rikta effektorer olika värd proteiner som är viktiga för cell värdsystemet, inklusive växt försvar svaren, transkription av gener, celldöd, proteasom, vesikler människohandel och hormon vägar7 , 8 , 9 , 10. spårning av cellulära localizationen av effektor proteiner i de mottagande cellerna är därför ett attraktivt mål att förstå deras funktioner när det gäller modulering växt immunitet.
De flesta lokalisering studier av T3Es har anställt Agrobacterium -medierad överuttryck med ett stort fluorescens protein i den mottagande anläggning9. Metoden heterologa uttryck för gener som introduceras i andra arter har dock visat sig vara mis lokaliserade eller ibland icke-funktionella11,12,13. Flera studier visade dessutom att bakteriell effektorer genomgår förändring för korrekt inriktning värd celler och14,15,16,17. Därför, övergående uttryckte effektorer i cytosolen av anläggningen celler inte kan vara funktionellt eller kvantitativt identisk med de effektorer som levereras av T3SS på patogen infektion18. Fusion av stora fluorescerande taggar till effektor proteiner kan dessutom störa korrekt effektor leverans och visualisering18,19. Dessa synsätt till assay funktionen T3E återspeglar därför inte fullt infödda localizationen av de T3SS-utsöndras effektorer.
Ett grönt fluorescerande protein (GFP) består av en 11-strängat β-fat omslutande en central strand som inkluderar en kromofor20. Waldo o.a. rapporterade en roman split-GFP-system som består av en liten komponent (GFP β strand 11; GFP11) och ett stort kompletterande fragment (GFP β programdel 1-10; GFP1-10)21. Fragmenten fluorescerar inte själva men fluorescerar vid sin egen förening när båda fragment finns i närheten med varandra. För optimering av protein fällbara effektivitet utvecklades därefter robusta hopfällbara varianter av GFP, dvs, sfGFP och sfGFPOPT, split GFP system20,21,22. Nyligen, enda aminosyra muterade varianter av sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT och sfCFP1-10OPT- som kan rekonstruera med sfGFP11 fragment och Visa gul och cyan fluorescens respektive, var genererade23 . Dessutom sfCherry, ett derivat av mCherry, kan delas in i sfCherry1-10 och sfCherry11 fragment på samma sätt som sfGFP23.
Detta system har anpassats för att märka och spåra de T3SS effektorer i HeLa cells under infektion med effektorer från Salmonella24. Det var dock tidigare inte optimerad för växt-bakterie patogen värdsystemet. Nyligen har optimerat vi split GFP systemet baserat på den förbättrade sfGFP1-10OPT att övervaka subcellulär lokalisering av de T3Es som levereras från P. syringae in växt celler25. För att underlätta lokalisering studierna av T3Es till olika subcellulär fack i växtcellerna, en uppsättning av transgena Arabidopsis thaliana genererades växter för att uttrycka sfGFP1-10OPT i de olika subcellulär fack 25. Dessutom plasmidsna transporterar en mängd organell-riktade sfGFP1-10OPT för den Agrobacterium-medierad övergående överuttryck och sfGFP11-taggade vektorer för leverans av T3SS-baserade effektor genererades också. Frön av olika transgena Arabidopsis linjer och plasmidsna att uttrycka T3Es av intresse kan erhållas från källor som nämns i Tabell av material26,27.
I följande protokoll beskriver vi ett optimerat system för att övervaka dynamiken i effektorer levereras av bakterier i de mottagande cellerna använder split sfGFP systemet. Infektion av växter som uttrycker sfGFP1-10OPT med transgena Pseudomonas transporterar rekombinant sfGFP11 plasmid resulterar i en leverans av den sfGFP11-taggade effektor från Pseudomonas i värdcellen. Därför dessa proteiner är färdigberett och translocate till den specifika effektor mål delar skall det ingå. Pseudomonas syringae pv. tomat CUCPB5500 stam där 18 effektorer raderas, användes eftersom denna stam visade låg eller ingen celldöd i både A. thaliana och N. benthamianas28. Alla material och steg som beskrivs här kan dock ersättas eller ändras för att anpassa split sfGFP systemet för undersökning av andra biologiska frågor eller optimering i de givna laboratorieförhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Alla åtgärder utförs i rumstemperatur, om inte annat anges.
1. beredning av växtmaterial (4 veckor)
- Förberedelse för N. benthamiana växter
- Så 2 frön av N. benthamiana på jordytan av varje pott, täcka facket med en plast kupol, och ge frön att gro i en 25 ° C, 60% luftfuktighet tillväxt kammare med en 16/8-h ljus/mörk fotoperiod cykel.
- Efter två veckor, plocka ut och kassera den minsta plantan i varje kruka och fortsätta växa växter på samma tillväxt villkor som tillämpas för groning i steg 1.1.1. Lägg till 1 L vatten per bricka varannan dag.
Obs: Tillväxten villkorar för växter kan variera över labs. Därför, följa protokollet regelbundet vattnas för att odla växten i ett hälsosamt skick. - I en vecka, överföra växterna till en ny bricka och ordna dem med tillräckligt utrymme för ytterligare tillväxt. Fortsätta växa växter enligt de villkor som beskrivs i steg 1.1.1 tills de är redo att vara infiltrerade vid 4 veckors ålder.
Obs: Växternas tillväxt kan variera beroende på villkoret tillväxt över labs. Vanligtvis finner vi att de 4 veckor gammalt N. benthamiana växter bära omkring sex blad.
- Förberedelse för A. thaliana transgena växter
- Se Tabell för material och Beställ transgena Arabidopsis frön.
- Blötlägg ~ 50-100 transgena Arabidopsis frön i 1 mL destillerat vatten och lagra dem vid 4 ° C i 3 dagar till mörkret att synkronisera uppkomsten av grobarhet.
- Så ~ 2-3 frön på jordytan en plug plant bricka och täcka facket med en plast kupol. Låt fröna att gro. vid 23 ° C, 60% luftfuktighet med en 10/14-h ljus/mörk fotoperiod cykel.
Obs: Frön bör homozygoter. Vi rekommenderar dock bekräfta förekomsten av transgenens i batchen. I det här fallet sterilisera fröna genom tvättning med 70% etanol i 2 min, 50% blekmedel (ca 2% hypoklorit) som innehåller 0,05% triton x-100 för 5 min. Följ genom tvättning 5 - 6 gånger med steril dubbel destillerat vatten (ddH2O). Efter sterilisering stratifiera vid 4 ° C i 3 dagar och platta dem på växten grobarhet media som innehåller 25 µg/L hygromycin B att välja de transgena växterna. - Efter en vecka, lämna endast en växt per plug och fortsätta växa växter på samma tillväxt villkor används för steg 1.2.3.
Obs: Fyra veckor gamla växter användes för P. syringae infektionen. Vatten växter varannan dag för att hålla växterna friska.
2. beredning av Pseudomonas kultur (~ 1 vecka)
- Byggandet av Plasmiden för Pseudomonas omvandling
- Se Tabell för material och beställa den önskade vector(s) T3SS-baserade effektor leveranssystem vektor:25.
- Sätt in effektor genen sevärdheter i effektor leverans vektorn med platsspecifika rekombination kloning25.
Obs: När övervakning subcellulär lokalisering av fullängds effektor protein, sätter fullängds genen in i pBK-GW-1-2 eller pBG-GW-1-2. Det är också möjligt att välja pBK-GW-1-4 eller pBG-GW-1-4 som innehåller 2 x sfGFP11 för ökade fluorescens signal. När det gäller en partiell effektor saknar signal peptid, använda pBK-GW-2-2 eller pBK-GW-2-4. Se Park et al. för detaljerad information om effektor leverans vektorer25.
- Transform plasmiden bär en effektor fixerade i sfGFP11-taggen till P. syringae pv. Tomat (Pst) CUCPB5500 använder standard elektroporation29.
Obs: Andra Pseudomonas -stammar kan användas vid behov. SfGFP11 tag systemet är uppbyggt för ett brett spektrum av vektorer30 och genuttrycket av effektor är reglerad av promotorn AvrRpm1, som är jämförbar med, exempelvis Pseudomonas fluorescens (EthAn)31. - Spridda omformade bakteriecellerna försiktigt över ytan av kungens B agarplattor som innehåller 100 µg/mL rifampicin och 25 µg/mL kanamycin eller 25 µg/mL gentamycin. Inkubera vid 28 ° C i 2 dagar.
- Inokulera en koloni i kungens B flytande medier med antibiotika som är lämpliga för den vektor som används, och växa cellerna övernattning på 28 ° C med skakningar vid 200 rpm.
- Göra en glycerol lager. Lägga till Ånghärdad glycerol till en slutlig koncentration på 50% och förvaras vid-80 ° C.
3. övergående uttryck för organell-riktade sfGFP1-10OPT i N. benthamiana (4 dagar)
- Beredning av Agrobacterium kultur
- Beställ den önskade vector(s) av organell-riktade sfGFP1-10OPT plasmid(s) (se Tabell för material).
- Förvandla en plasmid(s) till Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 celler32. Odla cellerna på Luria-Bertani (LB) agarsubstrat kompletteras med 50 µg/mL kanamycin och 50 µg/mL rifampicin vid 28 ° C i 2 dagar.
- Från en enda koloni på LB agarmedium, Inokulera cellerna i 5 mL flytande LB media kompletteras med 50 µg/mL kanamycin och 50 µg/mL rifampicin. Odla cellerna övernattning på 28 ° C med skakningar vid 200 rpm.
- Skörden cellerna genom centrifugering vid 3 000 x g i 10 min. Häll av supernatanten media och återsuspendera pelleten i 1 mL färsk gjort infiltration buffert.
- Mäta mängden Agrobacterium genom att erhålla optiska densitet (OD) värdet på en absorbans 600 nm (Abs 600 nm). Justera den OD600 av bakterier till 0,5 med infiltration-buffert.
Obs: 1 mL suspension är tillräckligt för att infiltrera på två ställen. - Lämna kulturen i rumstemperatur på en mild rocker för 1-5 h innan infiltration.
- Peta ett hål i mitten av bladen för att vara infiltrerade med 10 µL spets. Använd en 1 mL nålfri spruta för att infiltrera Agrobacterium upphängningarna. Försiktigt och långsamt injicera omkring 500 µL av de suspensioner beredda från 3.1.5 steg in i blad adaxial sida via sprutan. Upprepa infiltration på minst tre olika växter för experimentell replikat.
Obs: För hälso-och säkerhetsskäl bör ögonskydd användas under infiltration. - Torka av återstående bakteriesuspensionen på bladen och markera gränsen för den infiltrerade regionen.
- Hålla de infiltrerade växterna på samma tillväxt villkor används för steg 1.1.1 för 2 dagar.
4. inympning av Pseudomonas (4 dagar)
- Strimma transformerad Pseudomonas stammen från glycerol lager i steg 2.5 på kungens B agar media med lämpliga antibiotika vid 28 ° C i 2 dagar.
Obs: Hälsan hos Pseudomonas är mycket kritisk. Om kolonierna inte utgör väl, streak cellerna igen eller propagera cellerna i kungens flytande media innan du fortsätter. - Inokulera en platinaögla av Pseudomonas celler i Mannitol-glutamat (MG) flytande media vid 28 ° C med skakningar vid 200 rpm för övernattning.
- Harvest cellerna genom centrifugering vid 3 000 x g i 10 min. Häll av supernatanten media, återsuspendera pelleten i 10 mM MgCl2, och justera den OD600 till 0,02 (1 x 107 cfu/mL) för N. benthamiana blad och till 0,002 (1 x 106 cfu/mL) för Arabidopsis lämnar.
- För den N. benthamiana, infiltrera Pseudomonas upphängningen in i området av bladen där den Agrobacterium bära sfGFP1-10OPT konstruktion var infiltrerat 2 dagar tidigare (som i steg 3.1.7). För den sfGFP1-10OPT transgena Arabidopsis, infiltrera Pseudomonas suspensionen i två 4-vecka-gammal kort dag-växt blad.
Obs: minst tre växter behövs för experimentell replikat.
5. observation av sfGFP Signal via konfokalmikroskopi (1 dag)
- Skär ut blad skivan från den Pseudomonas-inokulerade bladen. Vid specifika tidpunkter efter infiltration av Pseudomonas, bild två 2-cm2 blad skivor från den enda anläggning som använder en laserscanning confocal system med 40 X / 1,2 NA C-Apochromat vatten nedsänkning mål eller 63 X / 0.8 NA C-Apochromat oljeimmersion mål. För att undvika döda celler dödas av såra, iaktta cellerna bort från infiltration hålet.
- Starta observation på en låg inställning av 488-nm argon laser. Öka laser kraften att upptäcka sfGFP.
Obs: Vi brukar använda 2-15% av laser intensitet för att upptäcka fluorescens signalen. Dock bör den lasereffekt och upptäckt inställningen justeras utifrån användarens mikroskopi system. Här sattes de utsläpp filter till 520-550 nm. De döda cellerna avger ofta auto-fluorescens under 488-nm laser magnetiseringen. Därför, som en negativ kontroll, bör de samma effektor utan taggen sfGFP11 infiltrerat och observeras på samma observation villkor. Dessutom kan hög laser magnetisering inducera klorofyll autofluorescens. Därför justera laser intensitet använder kontroll växtcellerna så att inte framkalla klorofyll autofluorescens.- För en counterstaining i cellväggen, infiltrera 20 mM propidium jodid (PI) till leaf skivan på 5-10 min före observation.
- För kärnan färgning, dränka leaf skivorna till 0,1% PARAFORMALDEHYD för 5 min följt av tvättning med vatten. Sedan infiltrera 10 mM PI till leaf skivan på 5-10 min innan mikroskopisk observation. Upprepa experimenten minst tre gånger.
Obs: Detta steg är inte kritisk, men bra att definiera effektor lokaliseringen på plasmamembranet eller kärnan. Om effektorer av intresse visade deras lokalisering i en viss organell, använda en markör för viss organell bekräfta localizationen av effektor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Β-fat struktur GFP består av elva β delar och kan delas in i två fragment, 1-10th strand (GFP1-10OPT) och den 11: e (GFP11) strand. Även om ingen av två fragment fluorescerande själva, kan själv monterade sfGFP avger fluorescensen när två fragment finns i närheten (figur 1A). I detta system, sfGFP1-10OPT-uttrycker Arabidopsis eller N. benthamiana växter inokuleras med Pseudomonas bär en sfGFP11 taggade effektor. Den sfGFP11 taggade effektor levererats av Pseudomonas till cytosolen värdcellens bereds till sfGFP1-10OPT uttryckt i cytosolen och sedan translocate tillsammans i målet facket (figur 1B). Figur 2 föreställer det övergripande förfarandet, från förberedelse av växtmaterial och Pst till upptäckt av fluorescens signalen i cellen växt.
Som ett exempel på vår metod använde vi proteinet effektor P. syringae , AvrB, som levereras till värd växtcellerna grundlig T3SS under infektion. I Arabidopsis, känns AvrB igen av en motsvarande bröstcancerresistent protein, RPM1 och utlösare immunsvar inklusive överkänsliga cell death33. I den tidigare studien avslöjade GFP reporter analysen och biokemiska analysen att AvrB och RPM1 är lokaliserade i plasmamembranet av plant cell33,34,35. För att undersöka localizationen av AvrB med vår metod, var Agrobacterium härbärgerat CYTO sfGFP1-10OPT genen infiltrerat i N. benthamiana. I två dagar, AvrB-sfGFP11-omvandlad Pseudomonas celler var inokuleras i den Agrobacterium-infiltrerade regionen. Kompletteras sfGFP fluorescensen signaler observerades i den Pst -CUCPB5500 som innehåller AvrB-sfGFP11 på plasmamembranet (figur 3B). Däremot fanns inga signaler i den infektera cellen av Pst transporterar native AvrB (figur 3A).
Figur 1. Optimerad split GFP systemet. (A) β-fat struktur GFP består av elva β-trådar och kan delas in i den 1-10th β-strand (GFP1-10) och den 11: e β-strand (GFP11). (B) i denna metod, sfGFP1-10OPT fragment uttrycktes i växtceller, medan sfGFP11 strand var smält till AvrB och förvandlat till Pseudomonas. Endast växter cellen infekterats av Pseudomonas som innehåller sfGFP11 visas sfGFP fluorescensen (där effektor lokaliserar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Översikt över förfarandet. Den transgena Arabidopsis eller sfGFP1-10OPT-infiltrerade N. benthamiana växt är infekterade med Pst CUCPB5500 bär en sfGFP11-taggade effektor genom sprutan infiltration. Fluorescensen av den sammansatta sfGFP kan upptäckas via ett konfokalmikroskopi system på plats för effektor lokaliseringen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. AvrB-sfGFP-detektering på N. benthamiana lämnar 3 h efter infektion. Den Pst CUCPB5500 hysa en sfGFP11-taggade AvrB-gen var infiltrerade på den 5: e eller 6th blad av N. benthamiana, som var infiltrerats av Agrobacterium bära sfGFP1-10OPT 2 dagar tidigare. Cellväggen var färgas av propidium jodid. Medan de celler som uttrycker sfGFP1-10 OPT med AvrB-bara visar inte någon fluorescens signal (A). GFP signalerna (gul pil) observerades vid de infektera cellerna av Pst innehållande AvrB-sfGFP11-genen på 3 h efter infiltration (B). Detta resultat representerar att bara AvrB-sfGFP11, inte AvrB, bereds med sfGFP1-10OPT i cytosolen och sedan den församlade sfGFP är flyttad till plasmamembranet. Magenta pseudo färg representerar cellväggen och klorofyll autofluorescens. Grönt representerar den församlade sfGFP fluorescensen. Skala barer = 40 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I protokollet som beskrivs här används för övervakning exakt lokalisering av effektor proteinerna injiceras genom den bakteriella T3SS i värdcellen växt vid infektion. Tidigare, split GFP systemet användes som ett verktyg för att studera den subcellulär lokalisering av protein från däggdjur23,36, Salmonella T3E lokalisering och Agrobacterium VirE2 leverans via T4SS in i den Anläggningen celler37. Tillämpa detta system i växtcellerna genom används tidigare studier en transgen majs växt som konstitutivt uttrycker cytoplasmiska GFP1-10 och transgena svampar, Ustilago maydis, som uttrycker GFP11-taggade effektor proteinet. Majs -U. maydis systemet har dock inte lyckats eftersom de flyttade effektor proteinerna uttryck var svag och hög bakgrund autofluorescens försvåras upptäckten av den rekonstituerade GFP signal38. För att åtgärda problemet, vi använde en sfGFP1-10 variant, sfGFP1-10OPT, som avsevärt förbättrar löslighet och fluorescens intensitet21,22.
Trots fördelarna med split sfGFP systemet finns det vissa begränsningar för studien av effektor lokalisering och dynamics. Först är observerade ombildade sfGFP fluorescerande signalen relativt svag. Detta kan bero på en liten mängd effektor molekyler levereras direkt från P. syringae. Denna svaga signal kan förbättras med hjälp av multimerizing sfGFP11 taggen. Vektorer bära 2 x sfGFP11 taggen finns också från källor som förtecknas i Tabell för material. För det andra misslyckades den cytosoliska sfGFP1-10 OPT rekonstitueras med sfGFP11 riktade till Golgi, ER och plastid25. Samtidig uttryck för mitokondrierna-riktade sfGFP11 och cytosoliska sfGFP1-10OPT resulterade i mislocalization av det nytt konstituerade sfGFP till cytosolen och nucleus25. Lokalisering av effektor av intresse bör därför valideras igen genom att tillämpa lämpliga organell-riktade sfGFP1-10OPT. När någon god Jordbrukarsed signal inte detekteras i de infektera celler som uttrycker cytosoliska sfGFP1-10OPT, vi rekommenderar att du använder N. benth uttrycker Golgi, ER, och plastid riktade sfGFP1-10OPT eller använda motsvarande organell riktade sfGFP1-10OPT transgena Arabidopsis25.
Denna metod visade användningen av split fluorescerande protein systemet som ett användbart verktyg för att undersöka effektorer i värd växter25temporal och spatial dynamik. Framtida forskning kommer att fokusera på framsteg i singel-molekyl imaging, som kan göra det möjligt för detaljerade studier av dynamiken i plasmamembranet-lokaliserad effektorer. Dessutom kan en sekretion analys med hjälp av en bakteriell system vara användbart alternativ att studera lokalisering av svamp effektorer; Det förhindrar sammanläggning av effektorer och hög autofluorescens på webbplatsen svamp penetration.
Det bör noteras att det finns några viktiga punkter i denna metod. För det första bör både växtmaterial och bakterier vara frisk och fräsch. För att säkerställa visualisering av effektor signalen, bör både sfGFP1-10OPT från växter och sfGFP11 från Pseudomonas starkt uttryckas. Det är därför viktigt att odla växter under de optimala odlingsbetingelser och skydda dem från miljöfaktorer, såsom skadedjur. Vi rekommenderar också att alla bakterier används för infiltration vidtas från 2 dag-odlade celler på agar plåtar och inte från glycerol bestånd. För det andra, när det gäller övergående uttryck i N. benthamiana, tidsperiod som krävs för mognaden av organell-riktade sfGFP1-10OPT kan variera för varje organell markör protein. Mognaden av PM-sfGFP1-10OPT kräver till exempel mer än 48 h efter infiltration. Slutligen, tidpunkten och de uttryck de ombildade sfGFP signalerna beror på vilken typ av effektor proteiner som krävs för att optimera vissa experimentella förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av grundläggande vetenskap forskningsprogram genom den nationella forskning stiftelsen av Korea (NRF) finansieras av ministeriet för vetenskap, IKT och framtida planering (NRF-2018R1A2A1A05019892) för DC och ett bidrag från växten molekylär avel Center ( PMBC) för Nästa Generation Biogreen 21 program för landsbygdens utveckling administrationen (PJ013201) att EP. Vi tackar imaging mitten av National Instrumentation Center för miljöledning att tillhandahålla confocal Mikroskop för filmning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidopsis transgenic lines | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
| NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
| PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
| Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
| NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
| PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
| ER-sfCherry1-10 | Addgene | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
| CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
| sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| Bacterial strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml) | ||
| Media components | |||
| Plant germination media | Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve. | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | Store at 4 °C. |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| LB media | Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed. | ||
| Tryptone | BD Bioscience | 211705 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| NaCl | Duchefa Biochemie | S0520 | |
| Micro agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
| King's B media | 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed. | ||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 212120 | |
| Anhydrous K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
| Glycerol | Duchefa Biochemie | G1345 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
| Mannitol-Glutamate (MG) liquid media | Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7 | ||
| Mannitol | Duchefa Biochemie | M0803 | |
| L-glutamic acid | Duchefa Biochemie | G0707 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
| Infiltration buffer | 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use. | ||
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize. |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Prepare 100 mM stock in water. Autoclave. |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM stock in DMSO. |
| Confocal microscope equipments/materials | |||
| 710 laser scanning confocal system | Carl Zeiss | ||
| Axio observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| Propidium iodide | ThermoFisher | P1304MP |
References
- Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).
- Buttner, D. Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells. FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 4 (2013).
- Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants. J Bacteriol. 180 (17), 4523-4531 (1998).
- Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Semin Cell Dev Biol. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).
- Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants. Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).
- Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
- Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiol. 122 (4), 999-1001 (2000).
- Courbot, M., et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol. 144 (2), 1052-1065 (2007).
- Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
- Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function. J Biol Chem. 278 (16), 14196-14202 (2003).
- Reinicke, A. T., et al. A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery. J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).
- Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization. Cell. 137 (2), 283-294 (2009).
- Fernandez-Alvarez, A., et al. Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis. PLoS Pathog. 8 (3), e1002563 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, Á Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52 (1), 59 (2008).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).
- Cabantous, S., et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association. Sci Rep. 3, 2854 (2013).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nat Commun. 7, 11046 (2016).
- Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors. Nat Methods. 7 (4), 325-330 (2010).
- Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017).
- Addgene. , Available from: https://www.addgene.org (2018).
- Arabidopsis Biological Resource Center. , Available from: https://abrc.osu.edu (2018).
- Kvitko, B. H., et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4), e1000388 (2009).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Kovach, M. E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Upadhyaya, N. M., et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat. Mol Plant Microbe Interact. 27 (3), 255-264 (2014).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc. 2006 (7), (2006).
- Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).
- Nimchuk, Z., et al. Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae. Cell. 101 (4), 353-363 (2000).
- Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
- Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells. Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).
- Tanaka, S., et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).
