Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Split grøn fluorescerende proteiner System til at visualisere effektorer leveret fra bakterier under infektion

doi: 10.3791/57719 Published: May 24, 2018

Summary

Fluorescerende protein-baserede tilgange til at overvåge effektorer udskilles af bakterier i værtsceller er udfordrende. Dette er på grund af inkompatibilitet mellem fluorescerende proteiner og type III sekretion system. Her, anvendes en optimeret split superfolder normal god landbrugspraksis system til visualisering af effektorer udskilles af bakterier i vært plante celle.

Abstract

Bakterier, en af de vigtigste agenser af forskellige plantesygdomme, udskiller et sæt af effektor proteiner i cellen vært plante at undergrave anlægget immunsystemet. Under infektion leveres cytoplasmatisk effektorer til vært cytosol via en type III sekretion system (T3SS). Efter levering til plante celle mål effector(s) til specifikke segmenter for at modulere vært celle processer for overlevelse og replikeringsdata af patogenet. Selv om der har været nogle forskning på de subcellulært lokalisering af effektor proteiner i værtsceller at forstå deres funktion i sygdomsfremkaldende evne ved hjælp af fluorescerende proteiner, undersøgelse af dynamikken i effektorer direkte indsprøjtet fra bakterier har været udfordrende på grund af inkompatibilitet mellem T3SS og fluorescerende proteiner.

Her beskriver vi vores seneste metode af en optimeret split superfolder grøn fluorescerende proteiner system (sfGFPOPT) til at visualisere lokalisering af effektorer leveret via den bakterielle T3SS i cellen vært. SfGFP11 (11th β-streng af sfGFP)-mærket effektor udskilles gennem T3SS kan samles med en specifik organelle målrettet sfGFP1-10OPT (1-10th . β-streng af sfGFP) fører til fluorescens emission på webstedet. Denne protokol indeholder en procedure for at visualisere det rekonstituerede sfGFP fluorescens signal med en effektor protein fra Pseudomonas syringae i en bestemt organelle i Arabidopsis og Nicotiana benthamiana planter.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Planter er siddende organismer, der støder på talrige invaderende patogener, herunder bakterier, svampe, vira, insekter og nematoder i hele deres livscyklus. Blandt phytopathogens, gramnegative bakteriel patogener som Pseudomonas spp. og Ralstonia spp., inficere deres værtsplanter af ind gennem sår eller naturlige åbninger, som spalteåbninger og hydathode1. For at med held kolonisere værtsplanter, bakterielle patogener har udviklet sig til at udvikle en bred vifte af virulens faktorer2. Når bakterier invadere en vært plante, de injicere en serie af virulens proteiner — kendt som effektorer — direkte i plantecellerne til at fremme deres sygdomsfremkaldende evne. Disse effektorer undertrykke eller modulere plante medfødt immunitet og manipulere vært cellulære processer for at resultere i bakteriel overlevelse3.

Sygdomsfremkaldende bakterier bruger primært en T3SS til at levere effektor proteiner direkte ind vært celler4. T3SS ligner en molekylær sprøjte med en nål-lignende kanal tilslutning fra en stillads protein struktur på tværs af indre og ydre bakteriel membraner til injektionsstedet vært celle5. Denne T3SS-medieret effektor (T3E) sekretion mekanisme er godt bevaret i forskellige gramnegative bakteriel patogener af anlægget samt menneskelige. En af de repræsentative plante patogener, P. syringae pv. Tomat DC3000 hrcC mutant, der typisk har en defekt T3SS, har begrænset vækst i planter sandsynligvis på grund af den manglende evne til denne mutant fuldt undertrykke plante immunitet (ved at indsprøjte effektor proteiner)6. Efter omplantningen ind i værtsceller målrette effektorer forskellige vært proteiner, der er vigtigt for celle værtssystemet, herunder plante forsvar svar, gen transskription, celledød, proteasom, vesikel Handel og hormon veje7 , 8 , 9 , 10. sporing af den cellulære lokalisering af effektor proteiner i værtsceller er derfor et attraktivt mål at forstå deres funktioner med hensyn til graduering af plante immunitet.

De fleste af lokalisering undersøgelser af T3Es har ansat Agrobacterium -medieret overekspression store fluorescens protein i vært anlæg9. Men metoden Heterolog ekspression af gener, der er indført i andre arter har vist sig at være mis lokaliserede eller lejlighedsvis ikke-funktionelle11,12,13. Derudover afslørede flere undersøgelser, at bakteriel effektorer undergår ændring for ordentlig målretning vært celler14,15,16,17. Derfor, forbigående udtrykt effektorer i cytosol plantens celler ikke kan være funktionelt eller kvantitativt identisk med de effektorer, som leveres af T3SS ved patogen infektion18. Derudover kan fusion af store fluorescerende tags til effektor proteiner forstyrre den korrekte effektor-levering og visualisering18,-19. Derfor kan disse tilgange til assay funktionen T3E ikke fuldt ud afspejler de indfødte lokalisering af de T3SS-udskilles effektorer.

En grøn fluorescerende proteiner (NGL) er sammensat af en 11-strenget β-tønde omslutter en central strand, der omfatter en farvelegeme20. Waldo et al. rapporteret en roman split-NGL system, der består af en lille komponent (normal god landbrugspraksis β strand 11; GFP11) og en stor supplerende fragment (normal god landbrugspraksis β strand 1-10; GFP1-10)21. Fragmenter fluorescerer ikke i sig selv men fluorescerer på deres egen forening, når begge fragmenter er i tæt nærhed med hinanden. For optimering af protein foldning effektivitet, blev robust folde varianter af normal god landbrugspraksis, dvs., sfGFP og sfGFPOPT, efterfølgende udviklet til split normal god landbrugspraksis system20,21,22. For nylig, enkelt aminosyre muteret varianter af sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT og sfCFP1-10OPT- der kan rekonstruere med sfGFP11 fragment, og Vis gul og cyan fluorescens henholdsvis, var genereret23 . Desuden sfCherry, et derivat af mCherry, kan opdeles i sfCherry1-10 og sfCherry11 fragmenter på samme måde som sfGFP23.

Dette system er blevet tilpasset til etiket og spore T3SS effektorer i HeLa celler under infektion ved hjælp af effektorer fra Salmonella24. Det var dog tidligere ikke optimeret til plante-bakteriel patogen værtssystemet. For nylig har optimeret vi split normal god landbrugspraksis system baseret på forbedret sfGFP1-10OPT at overvåge subcellulært lokaliseringen af T3Es leveret fra P. syringae i anlægget celler25. For at lette lokalisering undersøgelser af T3Es til forskellige subcellulært rum i plantecellerne, et sæt af gensplejsede Arabidopsis thaliana blev planter genereret for at udtrykke sfGFP1-10OPT i de forskellige subcellulært rum 25. Derudover plasmider bærer en række organelle-indskyde sfGFP1-10OPT nemlig Agrobacterium-medieret forbigående overekspression og de sfGFP11-tagged vektorer for T3SS-baserede effektor levering var også genereres. Frø af forskellige gensplejsede Arabidopsis linjer og plasmider at udtrykke T3Es af interesse kan indhentes fra kilder nævnt i Tabel af materialer26,27.

I den følgende protokol beskriver vi en optimeret system for at overvåge dynamikken i effektorer leveret af bakterier i værtsceller ved hjælp af split sfGFP system. Infektion af planter at udtrykke sfGFP1-10OPT med transgene Pseudomonas transporterer rekombinante sfGFP11 plasmid resulterer i en levering af sfGFP11-mærkede effektor fra Pseudomonas i cellen vært. Derfor, disse proteiner er fremstillet og translocate til specifikke effektor target segmenter. Pseudomonas syringae pv. tomat CUCPB5500 stamme, hvor 18 effektorer er slettet, blev brugt, fordi denne stamme viste lav eller ingen celledød i både A. thaliana og N. benthamianas28. Alle materialer og trin, der beskrives her kan dog erstattet eller modificeret til at tilpasse split sfGFP system til undersøgelse af andre biologiske spørgsmål eller optimering i de givne laboratorieforhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bemærk: Alle skridt udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

1. forberedelse af plantematerialer (4 uger)

  1. Forberedelse til N. benthamiana -planter
    1. 2 frø af N. benthamiana på overfladen af hver pot, dække bakken med en plastik kuppel og tillade frø til at spire i en 25 ° C, 60% fugtighed vækst kammer med en 16/8-h lys/mørke lysperiode cyklus.
    2. Efter to uger, udvælge og kassér den mindste sætteplante i hver potte og fortsat at dyrke planter på samme vækst betingelser, som anvendes til spiring i trin 1.1.1. Tilføj 1 L vand pr. bakke hver to dage.
      Bemærk: Vækstbetingelser for planter kan variere på tværs af labs. Derfor Følg de regelmæssig vanding protokol for at vokse plante i en sund tilstand.
    3. I en uge, overføre planterne hen til en ny bakke og arrangere dem med tilstrækkelig plads til yderligere vækst. Holde voksende planter på betingelser beskrevet taktfast 1.1.1, indtil de er klar til at blive infiltreret på 4 ugens i alder.
      Bemærk: Plantevækst kan variere afhængigt af betingelsen vækst på tværs af labs. Normalt, vi finder, at den 4-uge-forhenværende N. benthamiana planter bærer omkring seks blade.
  2. Forberedelse til A. thaliana transgene planter
    1. Henvises til Tabel af materialer og bestille de gensplejsede Arabidopsis frø.
    2. Sættetid ~ 50-100 gensplejsede Arabidopsis frø i 1 mL destilleret vand og gemme dem på 4 ° C i 3 dage i mørke til at synkronisere udbrud af spireevnen.
    3. ~ 2-3 frø på overfladen af en plug plante bakke og dække bakken med en plastik kuppel. Tillad frø til at spire ved 23 ° C, luftfugtighed 60% med en 10/14-h lys/mørke lysperiode cyklus.
      Bemærk: Frø bør være homozygote. Vi anbefaler dog bekræfte tilstedeværelsen af transgenet i partiet. I dette tilfælde sterilisere frøene af vask med 70% ethanol i 2 min., 50% blegemiddel (ca 2% hypokloritiske) indeholdende 0,05% triton X-100 i 5 min. følge ved at vaske 5 - 6 gange med steril dobbeltdestilleret vand (ddH2O). Efter sterilisation, stratificere ved 4 ° C i 3 dage og plade dem på plante spiring medier indeholdende 25 µg/L hygromycin B at vælge de transgene planter.
    4. Efter en uge, efterlader kun én plante pr. stik og fortsat voksende planter de samme vækst betingelser anvendes til trin 1.2.3.
      Bemærk: Fire uger gamle planter blev brugt til P. syringae infektion. Vandplanter hver anden dag for at holde planter sunde.

2. forberedelse af Pseudomonas kultur (~ 1 uge)

  1. Opførelsen af plasmid for Pseudomonas transformation
    1. Henvises til Tabel af materialer og bestille det ønskede vector(s) med T3SS-baserede effektor leveringssystem vektor25.
    2. Indsæt effektor gen af interesse i effektor levering vektor bruger lokationsspecifikke rekombination kloning25.
      Bemærk: Når overvågning subcellulært lokalisering af fuld længde effektor protein, sætte fuld længde genet til pBK-GW-1-2 eller pBG-GW-1-2. Det er også muligt at vælge pBK-GW-1-4 eller pBG-GW-1-4 indeholdende 2 x sfGFP11 for øget fluorescens signal. I forbindelse med en delvis effektor mangler signal peptid, bruge pBK-GW-2-2 eller pBK-GW-2-4. Henvise til Park et al. detaljerede oplysninger om effektor levering vektorer25.
  2. Omdan plasmid transporterer en effektor sammenvokset til sfGFP11 tag til P. syringae pv. Tomat (Pst) CUCPB5500 ved hjælp af standard elektroporation29.
    Bemærk: Andre Pseudomonas stammer kan bruges, hvis det er nødvendigt. SfGFP11 tag systemet er konstrueret til en bred vifte af vektorer30 og genekspression af effektor er reguleret af AvrRpm1 promotor, der kan sammenlignes med fx, Pseudomonas fluorescens (EthAn)31.
  3. Spred de transformerede bakterieceller forsigtigt over overfladen på kongens B agar plader der indeholder 100 µg/mL rifampicin og 25 µg/mL kanamycin eller 25 µg/mL phosphatbufferet. Der inkuberes ved 28 ° C i 2 dage.
  4. Podes en koloni i Kongens B flydende medier med antibiotika passende for den vektor, der anvendes, og dyrke celler overnatning på 28 ° C under omrystning på 200 rpm.
  5. Gøre en glycerol bestand. Tilføje autoklaveres glycerol til en slutkoncentration på 50% og opbevares ved-80 ° C.

3. forbigående udtryk for Organelle-målrettet sfGFP1-10OPT i N. benthamiana (4 dage)

  1. Forberedelse af Agrobacterium kultur
    1. Bestil den ønskede vector(s) af organelle-målrettet sfGFP1-10OPT plasmid(s) (Se Tabel af materialer).
    2. Omdanne Agrobacterium tumefaciens stamme GV3101 celler32af plasmid(s). Vokse celler på Luria-Bertani (LB) agarsubstratet suppleret med 50 µg/mL kanamycin og 50 µg/mL rifampicin ved 28 ° C i 2 dage.
    3. Fra en enkelt koloni på agarsubstratet LB, podes cellerne til 5 mL flydende LB medier suppleret med 50 µg/mL kanamycin og 50 µg/mL rifampicin. Vokse celler overnatning på 28 ° C under omrystning på 200 rpm.
    4. Høst celler ved centrifugering ved 3.000 x g i 10 min. Hæld supernatanten medierne og resuspenderes i 1 mL frisk gjort infiltration buffer.
    5. Måle mængden af Agrobacterium ved at opnå optisk densitet (OD) værdien på en absorbans på 600 nm (Abs 600 nm). Justere OD600 af bakterier til 0,5 med infiltration buffer.
      Bemærk: 1 mL af suspension er nok til at infiltrere på to steder.
    6. Forlade kulturen ved stuetemperatur på en blid rocker for 1-5 h før infiltration.
    7. Stikke et hul i midten af bladene at være infiltreret med en 10 µL spids. Bruge en 1 mL needleless sprøjte for at infiltrere Agrobacterium suspensioner. Forsigtigt og langsomt injiceres omkring 500 µL af suspensioner forberedt fra trin 3.1.5 ind i blad adaxial side via sprøjten. Gentag infiltration på mindst tre forskellige planter for eksperimenterende replikater.
      Bemærk: For sundheds- og sikkerhedsmæssige årsager øjenbeskyttelse skal bæres under infiltration.
    8. Aftørre den resterende bakteriel suspension på bladene og markere grænsen for regionen infiltreret.
    9. Holde de infiltreret planter på samme vækst betingelser anvendes til trin 1.1.1 i 2 dage.

4. podning af Pseudomonas (4 dage)

  1. Streak den transformerede Pseudomonas stamme fra glycerol lager i trin 2.5 på kongens B agar medier med passende antibiotika ved 28 ° C i 2 dage.
    Bemærk: For Pseudomonas sundhed er meget kritisk. Hvis kolonierne ikke formen godt streak cellerne igen eller udbrede cellerne i Kongens flydende medier før proceduren.
  2. Podes en oejefuld af Pseudomonas celler i Mannitol-glutamat (MG) flydende medier ved 28 ° C under omrystning på 200 rpm for natten.
  3. Høst celler ved centrifugering ved 3.000 x g i 10 min. Hæld supernatanten medierne resuspenderes i 10 mM MgCl2, og justere OD600 til 0,02 (1 x 107 cfu/mL) for N. benthamiana blade og 0,002 (1 x 106 CFU/mL) for Arabidopsis blade.
  4. For N. benthamiana, infiltrere Pseudomonas suspension område af bladene hvor Agrobacterium transporterer sfGFP1-10OPT konstruktion var infiltreret 2 dage tidligere (som i trin 3.1.7). For den sfGFP1-10OPT gensplejsede Arabidopsis, infiltrere Pseudomonas suspension to 4 uger gamle kort dag-vokset blade.
    Bemærk: mindst tre planter er behov for eksperimentel replikater.

5. observation af sfGFP Signal via konfokalmikroskopi (1 dag)

  1. Skære blad disken fra Pseudomonas-podes blade. På særlige tidspunkter efter infiltration af Pseudomonas, image to 2-cm2 blade diske fra en enkelt plante ved hjælp af en laser scanning Konfokal system med 40 X / 1.2 NA C-Apochromat vand fordybelse mål eller 63 X / 0,8 NA C-Apochromat immersionsolie mål. For at undgå døde celler dræbt af såret, observere celler fra infiltration hul.
  2. Start observation på en lav effekt indstilling af 488-nm argon laser. Øge laser power til at registrere sfGFP.
    Bemærk: Vi plejer at bruge 2-15% af laser intensitet for at registrere fluorescens-signal. Men laser power og påvisning indstilling bør være justeret baseret på brugerens mikroskopi system. Her, blev emission filtrene fastsat til 520-550 nm. De døde celler udsender ofte auto-fluorescens under 488 nm laser excitation. Derfor, som en negativ kontrol, bør de samme effektor uden sfGFP11 tag infiltreret og observeret de samme observation betingelser. Desuden kan høj laser excitation fremkalde klorofyl autofluorescence. Derfor, justere laser intensitet ved hjælp af planteceller kontrol for ikke for at fremkalde klorofyl autofluorescence.
    1. For en counterstaining af cellevæggen, infiltrere 20 mM propidium Iodid (PI) blad disken på 5-10 min før observation.
    2. Kernen farvning, nedsænkes blad diske i 0,1% PARAFORMALDEHYD i 5 min. efterfulgt af vask med vand. Derefter, infiltrere 10 mM PI i blad disken på 5-10 min før mikroskopiske observation. Gentage eksperimenterne mindst tre gange.
      Bemærk: Dette trin er ikke kritisk, men nyttigt at definere effektor lokalisering på plasma membran eller kernen. Hvis effektorer af interesse viste deres lokalisering i en specifik organelle, brug en markør for den givne organelle for at bekræfte lokaliseringen af effektor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Β-tønde struktur af normal god landbrugspraksis er sammensat af elleve β tråde og kan opdeles i to fragmenter, 1-10th strand (GFP1-10OPT) og de 11th (GFP11) strand. Selv om ingen af to fragmenter fluorescerende af sig selv, kan selvsamlede sfGFP udsender fluorescens, når de to fragmenter findes i umiddelbar nærhed (figur 1A). I dette system, sfGFP1-10OPT-udtryk for Arabidopsis eller N. benthamiana planter er podet med Pseudomonas bærer en sfGFP11 markeret effektor. SfGFP11 tagged effektor leveret af Pseudomonas i cytosol af cellen vært er rekonstitueret til sfGFP1-10OPT udtrykt i cytosol og derefter translocate sammen i target rum (figur 1B). Figur 2 repræsenterer den samlede procedure, fra forberedelse af plantematerialer og Pst til afsløring af fluorescens signal i cellen fabrikken.

Som et eksempel på vores metode brugte vi P. syringae effektor protein, AvrB, som er leveret til de vært planteceller grundig T3SS under infektion. I Arabidopsis, er AvrB anerkendt af et tilsvarende modstand protein, RPM1 og udløser immunrespons herunder overfølsomme celle død33. I den tidligere undersøgelse viste normal god landbrugspraksis reporter assay og biokemiske analysen at AvrB og RPM1 er lokaliseret i plasma membranen af anlægget celle33,34,35. For at undersøge lokalisering af AvrB ved hjælp af vores metode, var Agrobacterium husly CYTO sfGFP1-10OPT gen infiltreret i N. benthamiana. I to dage, AvrB-sfGFP11-omdannet Pseudomonas celler blev podet ind Agrobacterium-infiltreret region. Suppleret sfGFP fluorescens signaler blev observeret i Pst CUCPB5500 indeholdende AvrB-sfGFP11 på plasma membran (figur 3B). Derimod blev ingen signaler fundet i den inficerede celle af Pst regnskabsmæssige native AvrB (figur 3A).

Figure 1
Figur 1. Optimeret split normal god landbrugspraksis system. (A) β-tønde struktur af normal god landbrugspraksis er lavet af elleve β-tråde og kan opdeles i de 1-10th β-streng (GFP1-10) og de 11th β-streng (GFP11). (B) i denne metode, sfGFP1-10OPT fragmenter blev udtrykt i plantecellerne, mens sfGFP11 strand var sammenvokset til AvrB og omdannet til Pseudomonas. Kun planter celle inficeret af Pseudomonas indeholdende sfGFP11 vil vise sfGFP fluorescens (hvor effektor lokaliserer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Oversigt over proceduren. Den gensplejsede Arabidopsis eller sfGFP1-10OPT-infiltreret N. benthamiana plante er inficeret med Pst CUCPB5500 bærer en sfGFP11-tagged effektor gennem sprøjte infiltration. Fluorescens af den samlede sfGFP kan registreres via en Konfokal mikroskopi systemet på stedet af effektor lokalisering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. AvrB-sfGFP opdagelse på N. benthamiana efterlader 3 h efter infektion. Den Pst CUCPB5500 husly et sfGFP11-mærket AvrB gen var infiltreret på de 5th eller 6th blad af N. benthamiana, som var infiltreret af Agrobacterium transporterer sfGFP1-10OPT 2 dage tidligere. Cellevæggen blev plettet af propidium Iodid. Mens de celler, der udtrykker sfGFP1-10 OPT med AvrB, der kun viser ikke nogen fluorescens signal (A). Normal god landbrugspraksis signaler (gul pil) blev observeret på de inficerede celler af Pst indeholdende AvrB-sfGFP11-genet på 3 h efter infiltration (B). Dette resultat repræsenterer at kun AvrB-sfGFP11, ikke AvrB, er fremstillet med sfGFP1-10OPT på cytosol og derefter den samlede sfGFP er omplantes til plasmamembran. Magenta pseudo farve repræsenterer cellevæg og klorofyl autofluorescence. Grøn repræsenterer de forsamlede sfGFP fluorescens. Skalere barer = 40 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollen beskrevet her bruges til at overvåge den nøjagtige lokalisering af effektor proteiner tilført af den bakterielle T3SS vært plante cellen efter infektion. Tidligere, split normal god landbrugspraksis system blev brugt som et redskab til at studere subcellulært lokalisering af pattedyr proteiner23,36, Salmonella T3E lokalisering og Agrobacterium VirE2 levering gennem T4SS ind i den plante celler37. For at anvende dette system i plantecellerne, brugt tidligere undersøgelser en transgene majs plante, som constitutively udtrykker cytoplasmatisk GFP1-10 og transgene svampe, Ustilago maydis, der udtrykker GFP11-tagged effektor protein. Majs -U. maydis systemet har imidlertid ikke været vellykket fordi udtrykket niveauer af omplantede effektor proteiner var svage og højt niveau af baggrunden autofluorescence hæmmet påvisning af den rekonstituerede normal god landbrugspraksis signal38. For at afhjælpe dette problem, vi brugte en sfGFP1-10 variant, sfGFP1-10OPT, der væsentligt forbedrer opløselighed og fluorescens intensitet21,22.

Trods fordelene ved split sfGFP system er der nogle begrænsninger for undersøgelsen af effektor lokalisering og dynamik. Først, den observerede rekonstitueret sfGFP fluorescerende signal er relativt svag. Dette kan skyldes en lille mængde af effektor molekyler leveret direkte fra P. syringae. Denne svagt signal kan forbedres ved hjælp af multimerizing sfGFP11 tag. Vektorer transporterer 2 x sfGFP11 tag er også tilgængelige fra de kilder, der er anført i Tabel af materialer. For det andet mislykkedes det cytosole sfGFP1-10 OPT skal rekonstitueres med sfGFP11 målrettet til Golgi, ER og plastid25. Co udtryk af mitokondrier-målrettet sfGFP11 og cytosole sfGFP1-10OPT resulterede i mislocalization af den igen udgjorde sfGFP i cytosol og kerne25. Derfor, lokalisering af effektor interesse skal valideres igen ved at anvende passende organelle-målrettet sfGFP1-10OPT. Når nogen normal god landbrugspraksis signal ikke registreres i de inficerede celler, der udtrykker cytosole sfGFP1-10OPT, anbefaler vi at bruge N. benth udtrykker Golgi, ER, og plastid målrettet sfGFP1-10OPT eller ved hjælp af den tilsvarende organelle målrettet sfGFP1-10OPT gensplejsede Arabidopsis25.

Denne metode demonstrerede brugen af split fluorescerende proteiner system som et nyttigt redskab til at undersøge den tidsmæssige og rumlige dynamik af effektorer i vært planter25. Kommende forskning vil fokusere på fremskridt i enkelt-molekyle billeddannelse, som kan aktivere detaljerede undersøgelser af dynamikken i plasma membran-lokaliseret effektorer. Desuden, en sekretion analyse ved hjælp af en bakteriel system kan være nyttig alternativ at studere lokalisering af svampe effektorer; Det forhindrer sammenlægning af effektorer og høj autofluorescence på webstedet svampe penetration.

Det skal bemærkes, at der er nogle centrale punkter i denne metode. For det første, både plantematerialer og bakterier skal være sund og frisk. For at sikre en visualisering af effektor signal, bør både sfGFP1-10OPT fra planter og sfGFP11 fra Pseudomonas kraftigt udtrykkes. Derfor er det vigtigt at dyrke planter under de optimale vækstbetingelser og beskytte dem mod miljømæssige stressfaktorer, såsom skadedyr. Vi anbefaler også, at alle bakterier anvendes til infiltration tages fra de 2 dag-dyrkede celler på agar plader og ikke fra glycerol bestande. For det andet, i tilfælde af forbigående udtryk i N. benthamiana, længden af tid, der kræves for modning af organelle-målrettet sfGFP1-10OPT kan variere for hver organelle markør protein. Modning af PM-sfGFP1-10OPT kræver f.eks mere end 48 timer efter infiltration. Endelig afhænge tidspunkt og udtryk niveauer af rekonstitueret sfGFP signaler af typen af effektor proteiner, der er nødvendige for at optimere visse forsøgsbetingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af grundlæggende videnskab forskningsprogram gennem National Research Foundation af Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for videnskab, IKT og fremtidige planlægning (NRF-2018R1A2A1A05019892) til DC og af et tilskud fra planten Molekylær Breeding Center ( PMBC) af næste Generation Biogreen 21 program for landdistrikternes udvikling Administration (PJ013201) til EP. Vi takker de imaging center for National Instrumentation Center for Environmental Management til at give en Konfokal mikroskop til at filme.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis transgenic lines Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10 ABRC CS69831
NU-sfGFP1-10 ABRC CS69832
PT-sfGFP1-10 ABRC CS69833
MT-sfGFP1-10 ABRC CS69834
PX-sfGFP1-10 ABRC CS69835
ER-sfGFP1-10 ABRC CS69836
GO-sfGFP1-10 ABRC CS69837
PM-sfGFP1-10 ABRC CS69838
Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10 Addgene 97387
NU-sfGFP1-10 Addgene 97388
PT-sfGFP1-10 Addgene 97389
MT-sfGFP1-10 Addgene 97390
PX-sfGFP1-10 Addgene 97391
ER-sfGFP1-10 Addgene 97392
GO-sfGFP1-10 Addgene 97393
PM-sfGFP1-10 Addgene 97394
ER-sfCherry1-10 Addgene 97403
ER-sfYFP1-10 Addgene 97404
CYTO-sfCFP1-10 Addgene 97405
sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2 Addgene 98250 pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4 Addgene 98251 pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2 Addgene 98252 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4 Addgene 98253 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2 Addgene 98254 pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4 Addgene 98255 pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2 Addgene 98256 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4 Addgene 98257 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
Bacterial strains
Agrobacterium tumefaciens GV3101 Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml)
Media components
Plant germination media Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve.
Murashige & Skoog medium including vitamins Duchefa Biochemie M0222 Store at 4 °C.
Sucrose Duchefa Biochemie S0809
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
LB media Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave.  Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed.
Tryptone BD Bioscience 211705
Yeast extract BD Bioscience 212750
NaCl Duchefa Biochemie S0520
Micro agar Duchefa Biochemie M1002
King's B media 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed.
Proteose peptone BD Bioscience 212120
Anhydrous K2HPO4 Sigma-Aldrich 1551128 USP
Glycerol Duchefa Biochemie G1345
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
Bacto Agar BD Bioscience 214010
Mannitol-Glutamate (MG) liquid media Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7
Mannitol Duchefa Biochemie M0803
L-glutamic acid Duchefa Biochemie G0707
KH2PO4 Sigma-Aldrich NIST200B
Infiltration buffer 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use.
MES Duchefa Biochemie M1503 Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize.
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Prepare 100 mM stock in water. Autoclave.
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406 Prepare 150 mM stock in DMSO.
Confocal microscope equipments/materials
710 laser scanning confocal system Carl Zeiss
Axio observer Z1 inverted microscope Carl Zeiss
Propidium iodide ThermoFisher P1304MP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
  2. Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126, (5), 969-980 (2006).
  3. Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).
  4. Buttner, D. Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells. FEMS Microbiol Rev. 40, (6), 894-937 (2016).
  5. Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 4 (2013).
  6. Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants. J Bacteriol. 180, (17), 4523-4531 (1998).
  7. Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Semin Cell Dev Biol. 20, (9), 1055-1063 (2009).
  8. Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).
  9. Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants. Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).
  10. Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol. 12, (1), 37-43 (2009).
  11. Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiol. 122, (4), 999-1001 (2000).
  12. Courbot, M., et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol. 144, (2), 1052-1065 (2007).
  13. Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580, (4), 1094-1102 (2006).
  14. Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function. J Biol Chem. 278, (16), 14196-14202 (2003).
  15. Reinicke, A. T., et al. A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery. J Biol Chem. 280, (15), 14620-14627 (2005).
  16. Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization. Cell. 137, (2), 283-294 (2009).
  17. Fernandez-Alvarez, A., et al. Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis. PLoS Pathog. 8, (3), e1002563 (2012).
  18. Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, (6), 571-579 (2009).
  19. Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, Á Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52, (1), 59 (2008).
  20. Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24, (1), 79-88 (2006).
  21. Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 23, (1), 102-107 (2005).
  22. Cabantous, S., et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association. Sci Rep. 3, 2854 (2013).
  23. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nat Commun. 7, 11046 (2016).
  24. Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors. Nat Methods. 7, (4), 325-330 (2010).
  25. Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29, (7), 1571-1584 (2017).
  26. Addgene. Available from: https://www.addgene.org (2018).
  27. Arabidopsis Biological Resource Center. Available from: https://abrc.osu.edu (2018).
  28. Kvitko, B. H., et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5, (4), e1000388 (2009).
  29. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, (1), 23-28 (1990).
  30. Kovach, M. E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166, (1), 175-176 (1995).
  31. Upadhyaya, N. M., et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat. Mol Plant Microbe Interact. 27, (3), 255-264 (2014).
  32. Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc. 2006, (7), (2006).
  33. Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, (26), 15849-15854 (1998).
  34. Nimchuk, Z., et al. Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae. Cell. 101, (4), 353-363 (2000).
  35. Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (18), 7619-7624 (2011).
  36. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (25), E3501-E3508 (2016).
  37. Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells. Plant J. 77, (3), 487-495 (2014).
  38. Tanaka, S., et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Eur J Cell Biol. 94, (7-9), 349-358 (2015).
Split grøn fluorescerende proteiner System til at visualisere effektorer leveret fra bakterier under infektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, H. Y., Lee, S. E., Woo, J., Choi, D., Park, E. Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection. J. Vis. Exp. (135), e57719, doi:10.3791/57719 (2018).More

Lee, H. Y., Lee, S. E., Woo, J., Choi, D., Park, E. Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection. J. Vis. Exp. (135), e57719, doi:10.3791/57719 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter