Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie

doi: 10.3791/57719 Published: May 24, 2018

Summary

Fluorescerende eiwit gebaseerde benaderingen te controleren effectoren uitgescheiden door bacteriën in de cellen van de gastheer zijn uitdagend. Dit is te wijten aan de incompatibiliteit tussen fluorescente proteïnen en het type III secretie systeem. Hier, wordt een geoptimaliseerde split superfolder GFP-systeem gebruikt voor visualisatie van effectoren uitgescheiden door bacteriën in de fabriek van de gastheercel.

Abstract

Bacteriën, een van de belangrijkste oorzakelijke agens van diverse plantenziektes, afscheiden een aantal effector eiwitten in de plant gastheercel te ondermijnen van het immuunsysteem van de plant. Tijdens de infectie cytoplasmatische effectoren afgeleverd bij het cytosol host via een type III secretie systeem (T3SS). Na de levering in de cel van de plant, de effector(s) is gericht op de specifieke compartment(s) om te moduleren host cel processen voor overleving en replicatie van het pathogene agens. Hoewel er al wat onderzoek op de subcellular localisatie van effector eiwitten in de cellen van de gastheer om hun functie in pathogeniteit te begrijpen met behulp van fluorescente proteïnen, onderzoek van de dynamiek van de effectoren direct ingespoten van bacteriën heeft zijn uitdagend als gevolg van de incompatibiliteit tussen de T3SS en de fluorescente proteïnen.

Hier beschrijven we onze recente methode van een geoptimaliseerde split superfolder groen fluorescent proteïne systeem (sfGFPOPT) te visualiseren van de lokalisatie van de effectoren geleverd via de bacteriële T3SS in de gastheercel. De sfGFP11 (11th β-onderdeel van sfGFP)-tagged effector uitgescheiden via het T3SS kan worden gemonteerd met een specifieke organel gericht sfGFP1-10OPT (1-10th β-onderdeel van sfGFP) voorloop fluorescentie uitstoot op de site. Dit protocol wordt een procedure beschreven om te visualiseren het gereconstitueerde sfGFP fluorescentie signaal met een effector eiwit van Pseudomonas syringae in een bepaalde organel in het Arabidopsis en Nicotiana benthamiana planten.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Planten zijn sessiele organismen die talrijke invasie ziekteverwekkers zoals bacteriën, schimmels, virussen, insecten en nematoden gedurende hun hele levenscyclus optreden. Onder de planteziekteverwekkers, infecteren de gram-negatieve bacteriële pathogenen zoals Pseudomonas spp. en Ralstonia spp., hun waardplanten door te voeren door middel van wonden of natuurlijke openingen, zoals de stoma en de Waterporie1. Om met succes koloniseren gastheerplanten, zijn bacteriële pathogenen geëvolueerd om een verscheidenheid van virulentie factoren2. Wanneer bacteriën een waardplant binnenvallen, zij een reeks van virulentie eiwitten injecteren — bekend als effectoren — rechtstreeks in de plantencellen te bevorderen hun pathogeniteit. Deze effectoren onderdrukken of het moduleren van de plant aangeboren immuniteit en manipuleren van de host cellulaire processen om te leiden tot bacteriële survival3.

Pathogene bacteriën maken hoofdzakelijk gebruik van een T3SS om effector eiwitten leveren rechtstreeks in gastheer cellen4. De T3SS lijkt op een moleculaire injectiespuit met een naald-achtige kanaal verbinding maakt vanaf een steiger eiwitstructuur via de binnenste en de buitenste bacteriële membranen op de site van de injectie van de ontvangende cel5. Dit T3SS-gemedieerde effector (T3E) secretie mechanisme is zowel goed geconserveerde in verschillende gram-negatieve bacteriële pathogenen van de plant als menselijk. Één van de representatieve plant pathogenen, de P. syringae pv. Tomaat DC3000 hrcC mutant die heeft meestal een defecte T3SS, heeft de groei van planten die waarschijnlijk te wijten aan het onvermogen van deze mutant volledig onderdrukken de plant immuniteit (door het injecteren van effector eiwitten)6beperkt. Bij translocatie in de cellen van de gastheer richten effectoren verschillende host eiwitten die belangrijk voor het hostsysteem cel zijn, met inbegrip van plant verdediging reacties, gene transcriptie celdood, proteasoom, blaasje mensenhandel en hormoon trajecten7 , 8 , 9 , 10. Daarom, bijhouden van de cellulaire lokalisatie van de effector eiwitten in de cellen van de gastheer is een aantrekkelijk doelwit te begrijpen hun taken met betrekking tot de modulatie van de immuniteit van de plant.

De meeste van de studies van de lokalisatie van de T3Es hebben Agrobacterium -gemedieerde overexpressie met een grote fluorescentie-eiwit in de plant host9werkzaam. Echter is de methode heterologe expressie voor genen die worden ingevoerd in andere soorten gebleken te zijn mis gelokaliseerde of af en toe niet-functionele11,12,13. Verschillende studies bleek bovendien dat bacteriële effectoren wijziging voor juiste targeting in de ontvangende cellen14,15,16,17ondergaat. Daarom uitgedrukt Transient effectoren in het cytosol van de plant cellen mogelijk niet functioneel of kwantitatief identiek aan de effectoren die worden geleverd door de T3SS op pathogen infectie18. Bovendien, de fusie van grote fluorescerende labels aan effector eiwitten kan het verstoren van de juiste effector levering en visualisatie18,19. Daarom kunnen deze benaderingen te assay de T3E functie niet volledig overeen met de inheemse lokalisatie van de T3SS-uitgescheiden effectoren.

Een groen fluorescente proteïne (GFP) bestaat uit een 11-stranded β-vat bijvoeging van een centraal onderdeel waarin een chromofore20. Waldo et al. een nieuwe split-GFP-systeem dat uit een klein onderdeel bestaat gemeld (GFP β onderdeel 11; GFP11) en een grote aanvullende fragment (GFP β deel 1-10; GFP1-10)21. De fragmenten niet zelf lichten maar lichten op hun zelfstandige vereniging wanneer beide fragmenten in de directe nabijheid met elkaar zijn. Voor de optimalisatie van de opvouwbare efficiëntie van eiwit, werden robuuste opvouwbare varianten van het GFP, dat wil zeggen, sfGFP en sfGFPOPT, later ontwikkeld voor de split GFP systeem20,21,22. Onlangs, één aminozuur gemuteerd varianten van sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT en sfCFP1-10OPT- dat kan reconstrueren met een fragment van de sfGFP11, en Toon geel en cyaan fluorescentie respectievelijk werden gegenereerde23 . Bovendien, sfCherry, een afgeleide van mCherry, kan worden opgesplitst in sfCherry1-10 en sfCherry11 fragmenten op dezelfde wijze als sfGFP23.

Dit systeem is aangepast label en bijhouden van de effectoren van de T3SS in HeLa cellen tijdens de infectie met behulp van de effectoren van Salmonella24. Echter, het was eerder niet geoptimaliseerd voor het hostsysteem plant-bacteriële pathogenen. Onlangs, geoptimaliseerd we het split GFP systeem op basis van de verbeterde sfGFP1-10OPT te controleren de subcellular localisatie van de T3Es verlost van P. syringae in plantaardige cellen25. Ter vergemakkelijking van de studies van de lokalisatie van de T3Es naar verschillende subcellular compartimenten in de plantencellen, een set van transgene Arabidopsis thaliana werden planten gegenereerd om uit te drukken van sfGFP1-10OPT in de diverse compartimenten van subcellular 25. Bovendien, de uitvoering van een verscheidenheid van plasmiden organel-gerichte sfGFP1-10OPT voor de Agrobacterium-gemedieerde voorbijgaande overexpressie en de sfGFP11-gelabeld vectoren voor de T3SS gebaseerde effector levering ook werden gegenereerd. De zaden van verschillende transgene Arabidopsis lijnen en de plasmiden wil de T3Es van belang kunnen worden verkregen uit bronnen die zijn vermeld in de Tabel van materialen26,27.

In het volgende protocol beschrijven we een geoptimaliseerde systeem voor het controleren van de dynamiek van de effectoren geleverd door bacteriën in de cellen van de gastheer met behulp van de split sfGFP-systeem. Infectie van planten uiting van sfGFP1-10OPT met transgene Pseudomonas uitvoering van recombinante sfGFP11 plasmide resulteert in een levering van de sfGFP11-gelabeld effector van Pseudomonas in de gastheercel. Daarom deze eiwitten worden gereconstitueerd en translocate aan de specifieke effector doel compartment(s). De Pseudomonas syringae pv. tomaat CUCPB5500 stam waarin 18 effectoren zijn verwijderd, werd gebruikt omdat deze soort toonde weinig of geen celdood in zowel A. thaliana en N. benthamianas28. Alle materialen en stappen die hier worden beschreven kan echter worden vervangen of gewijzigd om aan te passen van het systeem van de split-sfGFP voor onderzoek van andere biologische vragen of optimalisatie in de gegeven laboratoriumomstandigheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld.

1. bereiding van plantaardige materialen (4 weken)

  1. Voorbereiding voor het planten van de N. benthamiana
    1. 2 zaaien van N. benthamiana op het bodemoppervlak van elke pot, bedek het dienblad met een kunststof koepel, en zaden ontkiemen in een 25 ° C, 60% vochtigheid groei kamer met een 16/8-h licht/donker fotoperiode cyclus toestaan.
    2. Na twee weken, uitzoeken en negeren de kleinste zaailing in elke pot blijven groeien planten onder dezelfde voorwaarden groei als de kiemkracht vermeld in stap 1.1.1 aangevraagd. Voeg 1 liter water per lade om de twee dagen.
      Opmerking: De voorwaarden van de groei voor planten kunnen labs varieert. Daarom volgen het reguliere drenken protocol om te groeien de planten in een gezonde toestand.
    3. In een week, de planten overdragen aan een nieuwe lade en schik ze met voldoende ruimte voor verdere groei. Blijven groeien de planten onder de voorwaarden beschreven in stap 1.1.1 totdat ze klaar zijn om op leeftijd van 4 weken worden geïnfiltreerd.
      Opmerking: Plantengroei kan verschillen afhankelijk van de conditie van de groei labs. Meestal vinden we dat de 4-week-oude N. benthamiana planten dragen ongeveer zes bladeren.
  2. Voorbereiding van A. thaliana transgene planten
    1. Verwijzen naar de Tabel van de materialen en de transgene Arabidopsis zaden bestellen.
    2. Geniet van ~ 50-100 transgene Arabidopsis zaden in 1 mL gedestilleerd water en bewaar ze bij 4 ° C voor 3 dagen in het donker te synchroniseren van het begin van de kiemkracht.
    3. Zaaien van ~ 2-3 op het bodemoppervlak van de lade van een plug plant en bedek het dienblad met een kunststof koepel. Zaden ontkiemen bij 23 ° C, 60% vochtigheid met een cyclus van 10/14-h licht/donker fotoperiode toestaan.
      Opmerking: De zaden moeten worden homozygotes. Wij raden echter aan het herbevestigen van de aanwezigheid van de transgenic in de batch. In dit geval de zaden te steriliseren door wassen met 70% ethanol voor 2 min, 50% bleekwater (ongeveer 2% hypochloriet) met 0,05% triton X-100 voor 5 min. volgen door 5 - 6 keer wassen met steriele dubbel gedestilleerd water (ddH2van O). Na sterilisatie, stratificeren bij 4 ° C voor 3 dagen en plaat hen op plant kiemkracht media met 25 µg/L hygromycin B te selecteren de transgene planten.
    4. Na een week, laat slechts één plant per plug en blijven groeien planten onder dezelfde voorwaarden groei gebruikt voor stap 1.2.3.
      Opmerking: Vier weken oude planten werden gebruikt voor de P. syringae infectie. Planten water om de andere dag planten om gezond te houden.

2. voorbereiding van Pseudomonas cultuur (~ 1 Week)

  1. Bouw van de plasmide voor Pseudomonas transformatie
    1. Verwijzen naar de Tabel van de materialen en de gewenste vector(s) van de T3SS gebaseerde effector uitvoeringssysteem vector25bestellen.
    2. Plaats de effector gen van belang in de effector levering vector met behulp van site-specifieke recombinatie klonen van25.
      Opmerking: Bij de bewaking van subcellular localisatie van full-length effector eiwit, zet het full-length gen in pBK-GW-1-2 of pBG-GW-1-2. Het is ook mogelijk om te kiezen van pBK-GW-1-4 of pBG-GW-1-4 met 2 x sfGFP11 voor verhoogde fluorescentie signaal. Gebruik in het geval van een gedeeltelijke effector signaal peptide ontbreekt, pBK-GW-2-2 of pBK-GW-2-4. Verwijzen naar Park et al. voor gedetailleerde informatie over effector levering vectoren25.
  2. Transformatie de plasmide uitvoering een effector gesmolten aan de sfGFP11 tag aan P. syringae pv. Tomaat (Pst) CUCPB5500 met behulp van standaard electroporation29.
    Opmerking: Andere Pseudomonas -stammen kunnen worden gebruikt indien nodig. De sfGFP11 tag systeem is gebouwd voor een breed scala van vectoren30 en de genexpressie van de effector wordt gereguleerd door de promotor van de AvrRpm1, die vergelijkbaar is met, bijvoorbeeld, Pseudomonas fluorescens (EthAn)31.
  3. Verspreid de getransformeerde bacteriecellen zachtjes over het oppervlak van de King's B agar platen met 100 µg/mL rifampicine en 25 µg Mo/mL kanamycine of 25 µg Mo/mL gentamycine. Incubeer bij 28 ° C gedurende 2 dagen.
  4. Enten van een kolonie in King's B vloeibare media met antibiotica geschikt is voor de gebruikte vector, en groeien de cellen 's nachts bij 28 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
  5. Maak een glycerol voorraad. Gesteriliseerde met autoclaaf glycerol toevoegen om een eindconcentratie van 50% en winkel bij-80 ° C.

3. Pre-steady uitdrukking van organel-gerichte sfGFP1-10OPT in N. benthamiana (4 dagen)

  1. Voorbereiding van Agrobacterium cultuur
    1. Om de gewenste vector(s) van sfGFP1-10OPT -plasmid(s) organel-gerichte (Zie de Tabel van de materialen).
    2. Het plasmid(s) omvormen Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 cellen32. Groeien de cellen op de drager van de agar Luria Bertani (LB) aangevuld met 50 µg Mo/mL kanamycine en 50 µg Mo/mL rifampicine bij 28 ° C gedurende 2 dagen.
    3. Uit een één kolonie op de drager van de LB-agar, de cellen te enten in 5 mL vloeibare LB-media, aangevuld met 50 µg Mo/mL kanamycine en 50 µg Mo/mL rifampicine. Groeien de cellen 's nachts bij 28 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
    4. Oogst de cellen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 10 min. Giet af de media supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL vers gemaakt infiltratie buffer.
    5. Meten van de hoeveelheid Agrobacterium door het verkrijgen van de optische dichtheid (OD) waarde op een extinctie van 600 nm (Abs 600 nm). De OD-600 van de bacteriën naar 0,5 met infiltratie buffer passen.
      Opmerking: 1 mL van de opschorting is genoeg om te infiltreren op twee plekken.
    6. Laat de cultuur bij kamertemperatuur op een zacht rocker voor 1-5 h voor infiltratie.
    7. Steken een gat in het midden van de bladeren te worden geïnfiltreerd met een 10 µL-tip. Gebruik een naaldloze spuit van 1 mL om te infiltreren in de Agrobacterium schorsingen. Zorgvuldig en langzaam injecteren ongeveer 500 µL van de schorsingen bereid uit stap 3.1.5 in de adaxial kant van het blad via de spuit. Herhaal de infiltratie op ten minste drie verschillende planten voor experimentele wordt gerepliceerd.
      Opmerking: Om redenen van gezondheid en veiligheid, oogbescherming moet gedragen worden tijdens de infiltratie.
    8. Veeg de overgebleven bacteriële suspensie op de bladeren en de grens van de geïnfiltreerde regio te markeren.
    9. Houd de geïnfiltreerde planten onder dezelfde voorwaarden groei 2 dagen gebruikt voor stap 1.1.1.

4. de inoculatie van Pseudomonas (4 dagen)

  1. Streep de getransformeerde Pseudomonas -stam uit de voorraad van glycerol in stap 2.5 op King's B agarmedia met de juiste antibiotica bij 28 ° C gedurende 2 dagen.
    Opmerking: De gezondheid van Pseudomonas is zeer kritisch. Als kolonies geen goed vormen, strijk de cellen opnieuw of verspreiden van de cellen in het King's vloeibare media voordat u verdergaat.
  2. Inoculeer een entoog van Pseudomonas cellen in Mannitol-glutamaat (MG) vloeibare media bij 28 ° C met schudden bij 200 t/min voor overnachting.
  3. Oogst de cellen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 10 min. Giet af het supernatant media, resuspendeer de pellet in 10 mM MgCl2, en aanpassen van de OD600 tot 0,02 (1 x 107 cfu/mL) voor N. benthamiana bladeren en 0.002 (1 x 106 CFU/mL) voor Arabidopsis . verlaat
  4. Voor de N. benthamiana, infiltreren de Pseudomonas schorsing in het gebied van de bladeren waar het Agrobacterium sfGFP1-10OPT construct uitvoering 2 dagen eerder (zoals in stap 3.1.7) was geïnfiltreerd. Voor de sfGFP1-10OPT transgene Arabidopsis, infiltreren de Pseudomonas schorsing in twee 4-week-oude korte dag geteelde bladeren.
    Opmerking: ten minste drie fabrieken zijn nodig voor experimentele wordt gerepliceerd.

5. waarneming van sfGFP signaal via confocale microscopie (1 dag)

  1. Knip het blad schijf van de Pseudomonas-geïnoculeerd bladeren. Beeld op specifieke tijdstippen na infiltratie van Pseudomonas, twee schijven van 2 cm2 blad van de enkele plant met behulp van een laser scannen confocal systeem met 40 X / 1.2 nb C-Apochromat water onderdompeling doelstelling of 63 X / 0.8 nb C-Apochromat olie-immersie doelstelling. Om te voorkomen dat de dode cellen gedood door verwonding, observeren de cellen uit de buurt van het gat van de infiltratie.
  2. Start de observatie op een instelling van het lage vermogen van de laser 488-nm argon. Verhoog het vermogen van de laser te detecteren van sfGFP.
    Opmerking: We gebruiken meestal 2-15% van de intensiteit van de laser om de fluorescentie-signaal te detecteren. Echter, de kracht van de laser en detectie instelling moeten worden aangepast op basis van microscopie-systeem van de gebruiker. Hier werden de emissie filters ingesteld op 520-550 nm. De dode cellen uitstoten vaak auto-fluorescentie onder de 488-nm laser excitatie. Daarom, als een negatieve controle, moet de dezelfde effector zonder de sfGFP11 tag worden geïnfiltreerd en waargenomen onder dezelfde voorwaarden observatie. Daarnaast kan de hoge laser excitatie chlorofyl autofluorescence veroorzaken. Daarom, pas de intensiteit van de laser met behulp van het besturingselement plantencellen dus niet voor het opwekken van chlorofyl autofluorescence.
    1. Voor een counterstaining van de celwand, 20 mM propidium jodide (PI) te infiltreren in het discstation. blad op 5-10 min vóór observatie.
    2. Voor de kern kleuring, dompelen de blad-schijven in 0,1% paraformaldehyde gedurende 5 minuten, gevolgd door wassen met water. Vervolgens infiltreren de 10 mM PI in het discstation. blad op 5-10 min voor microscopische waarneming. Herhaal de experimenten ten minste driemaal.
      Opmerking: Deze stap is niet kritisch, maar nuttig zijn voor het definiëren van de lokalisatie van de effector op het plasma-membraan of de kern. Als de effectoren van belang hun lokalisatie in een specifieke organel toonde, kunt een marker voor de gegeven organel bevestigen de lokalisatie van de effector.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De structuur van de β-vat van GFP bestaat uit elf β strengen en kan worden onderverdeeld in twee fragmenten, de 1-10th strand (GFP1-10OPT) en het onderdeelth (GFP11) 11. Hoewel geen van de twee fragmenten fluorescerende zelf, kan zelf geassembleerde sfGFP de fluorescentie uitstoten wanneer de twee fragmenten aanwezig zijn in de nabijheid (figuur 1A). In dit systeem, de sfGFP1-10OPT-uiting van Arabidopsis of N. benthamiana planten worden geïnoculeerd met Pseudomonas uitvoering een effector sfGFP11 gelabeld. De sfGFP11 gelabeld effector geleverd door Pseudomonas in het cytosol van de gastheercel is toegevoegd aan de sfGFP1-10OPT uitgedrukt in het cytosol en vervolgens samen translocate in het doel compartiment (figuur 1B). Figuur 2 geeft de totale procedure, vanaf de voorbereiding van de plantaardige materialen en Pst om de opsporing van het signaal van de fluorescentie in de plant cel.

Als voorbeeld van onze methode gebruikten we de P. syringae effector proteïne, AvrB, die wordt geleverd in de host plantencellen grondig de T3SS tijdens de infectie. Arabidopsis, wordt AvrB herkend door een overeenkomstige weerstand eiwit, RPM1 en triggers immuunresponsen inclusief overgevoelig cel dood33. In de vorige studie onthulde de bepaling van de verslaggever GFP de biochemische bepaling dat AvrB en RPM1 zijn gelokaliseerd in het plasma-membraan van de plant cel33,34,35. Onderzoek naar de lokalisatie van AvrB met behulp van onze methode, was Agrobacterium herbergen de CYTO-sfGFP1-10OPT -gene geïnfiltreerd in N. benthamiana. In twee dagen, AvrB-sfGFP11-getransformeerd Pseudomonas cellen waren geënt in de Agrobacterium-regio geïnfiltreerd. De fluorescentie aangevuld sfGFP signalen werden waargenomen in de Pst -CUCPB5500 met AvrB-sfGFP11 op het plasma-membraan (figuur 3B). In tegenstelling, werden geen signalen gevonden in de geïnfecteerde cel door Pst uitvoering van inheemse AvrB (figuur 3A).

Figure 1
Figuur 1. Het geoptimaliseerde split GFP systeem. (A) de structuur van de β-vat van GFP bestaat uit elf β-strengen en de 1-10th β-strand (GFP1-10) en de 11th β-strand (GFP11) kunnen worden gesplitst. (B) bij deze methode wordt de sfGFP1-10OPT fragmenten werden uitgedrukt in plantencellen, terwijl de sfGFP11 streng was gesmolten tot AvrB en omgevormd tot Pseudomonas. Alleen planten cel besmet zijn met Pseudomonas met sfGFP11 zal tonen de sfGFP-fluorescentie (waar de effector lokaliseert). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Overzicht van de procedure. De transgene Arabidopsis of de sfGFP1-10OPT-geïnfiltreerd N. benthamiana plant zijn geïnfecteerd met Pst CUCPB5500 een sfGFP11-gelabeld effector via spuit infiltratie uitvoering. De fluorescentie van de geassembleerde sfGFP kan worden gedetecteerd via een systeem van de confocal microscopie op de site van de effector lokalisatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. AvrB-sfGFP detectie op N. benthamiana 3 h na infectie verlaat. De Pst CUCPB5500 herbergen die een gen AvrB sfGFP11-gelabeld geïnfiltreerde op de 5th of 6th blad van N. benthamiana, die was geïnfiltreerd door Agrobacterium uitvoering van de sfGFP1-10OPT 2 dagen eerder was. De celwand werd gekleurd door propidium jodide. Terwijl de cellen uiten van sfGFP1-10 OPT met alleen-AvrB vertonen geen geen fluorescentie-signaal (A). Het GFP-signalen (gele pijl) werden waargenomen bij de geïnfecteerde cellen door de Pst met AvrB-sfGFP11 gen bij 3 h na infiltratie (B). Dit resultaat vertegenwoordigt dat enige AvrB-sfGFP11, niet AvrB, opnieuw is samengesteld met sfGFP1-10OPT in het cytosol en vervolgens de geassembleerde sfGFP is translocated aan het plasma-membraan. Magenta pseudo kleur vertegenwoordigt de celwand en chlorofyl autofluorescence. Groen vertegenwoordigt de geassembleerde sfGFP fluorescentie. Schaal bars = 40 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het protocol hier beschreven wordt gebruikt voor het toezicht op de nauwkeurige lokalisatie van de eiwitten van de effector geïnjecteerd door de bacteriële T3SS in de gastheercel plant na infectie. Eerder, het split GFP systeem werd gebruikt als een instrument om te studeren de subcellular localisatie van zoogdieren eiwitten23,36, Salmonella T3E lokalisatie en Agrobacterium VirE2 bezorging via de T4SS in de plantaardige cellen37. Voor de toepassing van dit systeem in de plantencellen, eerdere studies gebruikt een transgene maïs plant die constitutively spreekt de cytoplasmatische GFP1-10 en de transgene schimmels, Ustilago maydis, die de GFP11-gelabeld effector proteïne uitdrukt. Echter, de maïs -U. maydis systeem niet geslaagd omdat de niveaus van de expressie van de eiwitten translocated effector zwak waren en hoog niveau van achtergrond autofluorescence belemmerd de detectie van de gereconstitueerde GFP signaal38. U kunt dit probleem oplossen, we gebruikten een sfGFP1-10 variant, sfGFP1-10OPT, die aanzienlijk de oplosbaarheid en fluorescentie intensiteit21,22 verbetert.

Ondanks de voordelen van de split sfGFP-systeem zijn er enkele beperkingen aan de studie van de effector lokalisatie en dynamiek. Ten eerste, het waargenomen gereconstitueerde sfGFP fluorescent signaal is relatief zwak. Dit kan te wijten zijn aan een kleine hoeveelheid effector moleculen rechtstreeks van P. syringaeverlost. Dit zwak signaal kan worden verbeterd met behulp van de tag multimerizing sfGFP11. De vectoren uitvoering 2 x sfGFP11 tag zijn ook beschikbaar vanuit de bronnen die worden vermeld in de Tabel van materialen. Ten tweede, de cytosolische sfGFP1-10 OPT mislukt moet worden toegevoegd met sfGFP11 gericht op Golgi, ER en Plastide25. Co uitdrukking van mitochondriën-gerichte sfGFP11 en cytosolische sfGFP1-10OPT resulteerde in de mislocalization van de gereconstitueerd sfGFP naar het cytosol en kern25. Daarom, lokalisatie van de effector van belang moet opnieuw worden gevalideerd door het toepassen van de juiste organel-gerichte sfGFP1-10OPT. Wanneer geen GFP-signaal wordt niet gedetecteerd in de geïnfecteerde cellen uiten van cytosolische sfGFP1-10OPT, raden we N. benth Golgi, ER, uiten en Plastide gerichte sfGFP1-10OPT of met behulp van de bijbehorende organel gericht sfGFP1-10OPT transgene Arabidopsis25.

Deze methode aangetoond dat het gebruik van het split fluorescent proteïne systeem als een nuttig instrument om te onderzoeken van de dynamiek van het temporele en ruimtelijke van effectoren in host planten25. Toekomstig onderzoek zal worden toegespitst op de vooruitgang in de single-molecuul imaging, die gedetailleerde studies van de dynamiek van plasmamembraan-gelokaliseerde effectoren kunnen. Bovendien wellicht een secretie-assay met behulp van een bacteriële systeem nuttig alternatief te bestuderen van de lokalisatie van schimmel effectoren; het voorkomt dat de samenvoeging van de effectoren en hoge autofluorescence op de site van de schimmel penetratie.

Opgemerkt moet worden dat er enkele belangrijke punten in deze methode zijn. Ten eerste, zowel plantaardig materiaal en bacteriën moeten gezond en vers. Om ervoor te zorgen de visualisatie van het effector signaal, moeten zowel de sfGFP1-10OPT uit planten en de sfGFP11 van Pseudomonas sterk worden uitgedrukt. Daarom is het belangrijk om te groeien planten onder de voorwaarden van de optimale groei en hen te beschermen tegen milieustressoren, zoals ongedierte. We raden ook aan dat alle bacteriën gebruikt voor infiltratie worden genomen uit de 2 dag gekweekte cellen op de agar platen en niet uit glycerol voorraden. Ten tweede, in het geval van voorbijgaande expressie in N. benthamiana, de lengte van de tijd die nodig is voor de rijping van het organel-gerichte sfGFP1-10OPT kan variëren voor elke organel marker proteïne. Bijvoorbeeld, vereist rijping van PM-sfGFP1-10OPT meer dan 48 uur na de infiltratie. Tot slot afhangen het punt van de tijd en de niveaus van de expressie van het gereconstitueerde sfGFP signalen van het soort effector eiwitten die nodig zijn om sommige experimentele omstandigheden te optimaliseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd gesteund door fundamentele wetenschap Research Program via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT en toekomstige Planning (NRF-2018R1A2A1A05019892) naar DC en door een subsidie van Plant Molecular Breeding Center) PMBC) van de volgende generatie Biogreen 21-programma van de landelijke ontwikkeling administratie (PJ013201) aan de EP. Wij danken het imaging center van het National Instrumentation Center for Environmental Management om een confocal microscoop voor het filmen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis transgenic lines Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10 ABRC CS69831
NU-sfGFP1-10 ABRC CS69832
PT-sfGFP1-10 ABRC CS69833
MT-sfGFP1-10 ABRC CS69834
PX-sfGFP1-10 ABRC CS69835
ER-sfGFP1-10 ABRC CS69836
GO-sfGFP1-10 ABRC CS69837
PM-sfGFP1-10 ABRC CS69838
Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10 Addgene 97387
NU-sfGFP1-10 Addgene 97388
PT-sfGFP1-10 Addgene 97389
MT-sfGFP1-10 Addgene 97390
PX-sfGFP1-10 Addgene 97391
ER-sfGFP1-10 Addgene 97392
GO-sfGFP1-10 Addgene 97393
PM-sfGFP1-10 Addgene 97394
ER-sfCherry1-10 Addgene 97403
ER-sfYFP1-10 Addgene 97404
CYTO-sfCFP1-10 Addgene 97405
sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2 Addgene 98250 pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4 Addgene 98251 pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2 Addgene 98252 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4 Addgene 98253 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2 Addgene 98254 pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4 Addgene 98255 pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2 Addgene 98256 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4 Addgene 98257 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
Bacterial strains
Agrobacterium tumefaciens GV3101 Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml)
Media components
Plant germination media Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve.
Murashige & Skoog medium including vitamins Duchefa Biochemie M0222 Store at 4 °C.
Sucrose Duchefa Biochemie S0809
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
LB media Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave.  Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed.
Tryptone BD Bioscience 211705
Yeast extract BD Bioscience 212750
NaCl Duchefa Biochemie S0520
Micro agar Duchefa Biochemie M1002
King's B media 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed.
Proteose peptone BD Bioscience 212120
Anhydrous K2HPO4 Sigma-Aldrich 1551128 USP
Glycerol Duchefa Biochemie G1345
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
Bacto Agar BD Bioscience 214010
Mannitol-Glutamate (MG) liquid media Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7
Mannitol Duchefa Biochemie M0803
L-glutamic acid Duchefa Biochemie G0707
KH2PO4 Sigma-Aldrich NIST200B
Infiltration buffer 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use.
MES Duchefa Biochemie M1503 Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize.
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Prepare 100 mM stock in water. Autoclave.
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406 Prepare 150 mM stock in DMSO.
Confocal microscope equipments/materials
710 laser scanning confocal system Carl Zeiss
Axio observer Z1 inverted microscope Carl Zeiss
Propidium iodide ThermoFisher P1304MP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
  2. Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126, (5), 969-980 (2006).
  3. Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).
  4. Buttner, D. Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells. FEMS Microbiol Rev. 40, (6), 894-937 (2016).
  5. Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 4 (2013).
  6. Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants. J Bacteriol. 180, (17), 4523-4531 (1998).
  7. Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Semin Cell Dev Biol. 20, (9), 1055-1063 (2009).
  8. Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).
  9. Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants. Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).
  10. Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol. 12, (1), 37-43 (2009).
  11. Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiol. 122, (4), 999-1001 (2000).
  12. Courbot, M., et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol. 144, (2), 1052-1065 (2007).
  13. Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580, (4), 1094-1102 (2006).
  14. Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function. J Biol Chem. 278, (16), 14196-14202 (2003).
  15. Reinicke, A. T., et al. A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery. J Biol Chem. 280, (15), 14620-14627 (2005).
  16. Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization. Cell. 137, (2), 283-294 (2009).
  17. Fernandez-Alvarez, A., et al. Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis. PLoS Pathog. 8, (3), e1002563 (2012).
  18. Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, (6), 571-579 (2009).
  19. Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, Á Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52, (1), 59 (2008).
  20. Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24, (1), 79-88 (2006).
  21. Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 23, (1), 102-107 (2005).
  22. Cabantous, S., et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association. Sci Rep. 3, 2854 (2013).
  23. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nat Commun. 7, 11046 (2016).
  24. Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors. Nat Methods. 7, (4), 325-330 (2010).
  25. Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29, (7), 1571-1584 (2017).
  26. Addgene. Available from: https://www.addgene.org (2018).
  27. Arabidopsis Biological Resource Center. Available from: https://abrc.osu.edu (2018).
  28. Kvitko, B. H., et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5, (4), e1000388 (2009).
  29. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, (1), 23-28 (1990).
  30. Kovach, M. E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166, (1), 175-176 (1995).
  31. Upadhyaya, N. M., et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat. Mol Plant Microbe Interact. 27, (3), 255-264 (2014).
  32. Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc. 2006, (7), (2006).
  33. Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, (26), 15849-15854 (1998).
  34. Nimchuk, Z., et al. Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae. Cell. 101, (4), 353-363 (2000).
  35. Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (18), 7619-7624 (2011).
  36. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (25), E3501-E3508 (2016).
  37. Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells. Plant J. 77, (3), 487-495 (2014).
  38. Tanaka, S., et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Eur J Cell Biol. 94, (7-9), 349-358 (2015).
Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, H. Y., Lee, S. E., Woo, J., Choi, D., Park, E. Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection. J. Vis. Exp. (135), e57719, doi:10.3791/57719 (2018).More

Lee, H. Y., Lee, S. E., Woo, J., Choi, D., Park, E. Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection. J. Vis. Exp. (135), e57719, doi:10.3791/57719 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter