Summary
Approches protéine fluorescentes pour surveiller les effecteurs sécrétées par des bactéries dans les cellules hôtes sont difficiles. Cela est dû à l’incompatibilité entre protéines fluorescentes et le système de sécrétion de type III. Ici, un système GFP superfolder split optimisé est utilisé pour la visualisation des effecteurs sécrétées par des bactéries dans la cellule de plante hôte.
Abstract
Bactéries, parmi les plus importants agents causals de diverses maladies des plantes, sécrètent un ensemble de protéines effectrices dans la cellule de plante hôte pour subvertir le système immunitaire de plante. Au cours de l’infection effecteurs cytoplasmiques sont livrés dans le cytosol hôte via un type de système de sécrétion III (T3SS). Après l’accouchement dans la cellule végétale, les effecteurs cible le (s) spécifiques pour moduler les processus hôtes de cellule de survie et de la réplication de l’agent pathogène. Bien qu’il y a eu quelques recherches sur la localisation subcellulaire des protéines effectrices dans les cellules hôtes pour comprendre leur fonction dans la pathogénicité en utilisant des protéines fluorescentes, enquête sur la dynamique des effecteurs directement injectés des bactéries a été difficile en raison de l’incompatibilité entre la T3SS et des protéines fluorescentes.
Nous décrivons ici notre méthode récente d’un système de protéine fluorescente verte de superfolder (sfGFPOPT) split optimisé pour visualiser la localisation des effecteurs envoyées via la T3SS bactérienne dans la cellule hôte. Le sfGFP11 (11ème β-brin de sfGFP)-effecteur Taggé sécrétée par le biais de la T3SS peut être assemblé avec un organite spécifique cibléOPT sfGFP1-10 (1-10th β-brin de sfGFP) menant à l’émission de fluorescence sur le site. Ce protocole prévoit une procédure permettant de visualiser le signal de fluorescence sfGFP reconstitué avec une protéine effectrice de Pseudomonas syringae dans un organite particulier chez les plantes Arabidopsis et Nicotiana benthamiana .
Introduction
Les plantes sont des organismes sessiles que rencontrent de nombreux pathogènes envahisseurs, y compris les bactéries, champignons, virus, insectes et nématodes tout au long de leur cycle de vie. Parmi les phytopathogènes, les bactéries pathogènes Gram négatifs telles que Pseudomonas spp. et Ralstonia spp., infecter leurs plantes hôtes en entrant par le biais de plaies ou d’ouvertures naturelles, comme les stomates et hydathode1. Pour coloniser les plantes hôtes avec succès, les bactéries pathogènes ont évolué pour développer une variété de facteurs de virulence2. Lorsque les bactéries envahissent une plante hôte, ils injectent une série de protéines de virulence — appelés effecteurs — directement dans les cellules végétales pour promouvoir leur pathogénicité. Ces effecteurs suppriment ou modulent l’immunité innée de la plante et de manipulent les processus cellulaires de l’hôte pour aboutir à la survie bactérienne3.
Bactéries pathogènes utilisent principalement un T3SS pour fournir des protéines effectrices directement dans hôte cellules4. Le T3SS ressemble à une seringue moléculaire avec un canal aciculaires raccordement d’une structure de protéine d’échafaudage entre l’intérieur et les membranes bactériennes externes vers le site de l’injection des cellules hôte5. Ce mécanisme de sécrétion de médiation T3SS effecteur (T3E) est bien conservée dans diverses bactéries pathogènes Gram négatifs de la plante mais aussi humaine. L’un des agents pathogènes végétaux de représentative, le P. syringae pv. Tomate DC3000 CRHC mutant qui a généralement un T3SS défectueux, a limité la croissance des plantes, probables en raison de l’incapacité de ce mutant pour supprimer entièrement les plantes l’immunité (par l’injection de protéines effectrices)6. Sur la translocation dans les cellules de l’hôte, effecteurs ciblent diverses protéines de l’hôte qui sont importants pour le système de cellule hôte, y compris les réactions de défense des plantes, la transcription de gènes, la mort cellulaire, du protéasome, trafic vésiculaire et hormone voies7 , 8 , 9 , 10. suivi de la localisation cellulaire des protéines effectrices dans les cellules de l’hôte est donc une cible attractive pour comprendre leurs fonctions en ce qui concerne la modulation de l’immunité de la plante.
La plupart des études de localisation de la T3Es ont employé la surexpression agrobactérie -négociée avec une protéine de fluorescence grande plante hôte9. Toutefois, la méthode d’expression hétérologue pour les gènes qui sont introduites dans d’autres espèces s’est avérée être mal localisées ou parfois dysfonctionnement11,12,13. En outre, plusieurs études ont révélé que les effecteurs bactériennes subissent aucune modification pour le ciblage approprié dans les cellules de l’hôte14,15,16,17. Par conséquent, transitoirement exprimé effecteurs dans le cytosol de l’usine de cellules ne peuvent pas être fonctionnellement ou quantitativement identiques pour les effecteurs qui sont livrés par le T3SS sur pathogène infection18. En outre, la fusion de grandes marques fluorescentes protéines effectrices susceptible de perturber le bon effecteur livraison et visualisation18,19. Par conséquent, ces approches pour analyser la fonction T3E ne reflètent pas pleinement la localisation native des effecteurs T3SS-sécrétée.
Une protéine fluorescente verte (GFP) est composée de 11 brins β-tonneau enfermant un brin central qui comprend un chromophore20. Waldo et al. signalé un système nouveau split-GFP qui consiste en une petite composante (GFP β chapelet 11 ; GFP11) et un grand fragment complémentaire (volet GFP β 1-10 ; GFP1-10)21. Les fragments de n’y pas de fluorescence par eux-mêmes mais sont fluorescents sur leur autoassociation lorsque les deux fragments sont très proches entre eux. Pour l’optimisation de l’efficacité de pliage de protéine, les variantes pliants robustes de la GFP, c'est-à-dire, sfGFP et sfGFPOPT, ont été développés par la suite le split GFP système20,21,22. Récemment, le seul acide aminé muté variantes de sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT et sfCFP1-10OPT- qui peut reconstituer avec un fragment de sfGFP11 et voir la fluorescence de jaune et cyan, respectivement, ont généré23 . En outre, sfCherry, un dérivé de mCherry, peut être divisé en fragments sfCherry1-10 et sfCherry11 de la même manière que sfGFP23.
Ce système a été adapté d’étiqueter et de suivre les effecteurs T3SS dans les cellules HeLa au cours de l’infection en utilisant les effecteurs de Salmonella24. Toutefois, il a été précédemment pas optimisé pour le système plante-bactérie pathogène hôte. Récemment, nous avons optimisé le système GFP split basé sur l’amélioration de sfGFP1-10OPT pour surveiller la localisation subcellulaire de la T3Es envoyées de P. syringae en usine cellules25. Afin de faciliter les études de localisation de la T3Es aux différents compartiments subcellulaires dans les cellules végétales, un ensemble de transgéniques Arabidopsis thaliana plantes ont été générés pour exprimer sfGFP1-10OPT dans les divers compartiments subcellulaires 25. par ailleurs, les plasmides portant une variété d’organite ciblées sfGFP1-10OPT pour l' Agrobacterium-médiation surexpression transitoire et les vecteurs sfGFP11-tag pour la prestation de base T3SS effecteur ont également générés. Les graines de diverses lignées transgéniques de Arabidopsis et les plasmides d’exprimer les T3Es d’intérêt peuvent provenir de sources mentionnées dans la Table des matières26,,27.
Dans le protocole suivant, nous décrivons un système optimisé pour suivre la dynamique des effecteurs envoyées par des bactéries dans les cellules de l’hôte en utilisant le système de sfGFP de split. Infection des plantes exprimant sfGFP1-10OPT avec transgéniques Pseudomonas plasmide recombinant sfGFP11 se traduit par une livraison de l’effecteur sfGFP11-tag de Pseudomonas dans la cellule hôte. Par conséquent, ces protéines sont reconstituées et effectuer des transferts à la cible (s) à des effecteurs spécifiques. Le Pseudomonas syringae pv. tomate CUCPB5500 souche dont 18 effecteurs sont supprimées, a été utilisé parce que cette souche ont montré peu ou pas la mort cellulaire dans les a. thaliana et N. benthamianas28. Cependant, tous les matériaux et les étapes décrites ici peuvent être remplacé ou modifié pour adapter le système de sfGFP de split pour enquête d’autres questions biologiques ou l’optimisation des conditions de laboratoire donné.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Remarque : Toutes les mesures sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire.
1. préparation du matériel végétal (4 semaines)
- Préparation pour les N. benthamiana plants
- Semer les 2 graines de N. benthamiana sur la surface du sol de chaque pot, recouvrir le plateau d’un dôme en plastique et laisser les graines à germer dans un 25 ° C, chambre de croissance humidité de 60 % avec un cycle de photopériode de lumière/obscurité de 8 h/16.
- Après deux semaines, choisir et jeter la plantule plus petite dans chaque pot et continuer à faire pousser des plantes dans les mêmes conditions de croissance tel qu’appliqué pour la germination à l’étape 1.1.1. Ajouter 1 L d’eau par bac tous les deux jours.
Remarque : Les conditions de croissance des plantes peuvent varier entre laboratoires. Par conséquent, se conformer au protocole d’arrosage régulier pour pousser la plante dans un état sain. - En une semaine, transférer les plantes à un nouveau plateau et organisez-les avec un espace suffisant pour la poursuite de la croissance. Poursuivre sa croissance les plantes dans les conditions décrites à l’étape 1.1.1 jusqu'à ce qu’ils sont prêts à s’infiltrer à l’âge de 4 semaines.
Remarque : La croissance des plantes peut varier selon la condition de la croissance dans l’ensemble de laboratoires. Généralement, nous constatons que les 4 semaines N. benthamiana plantes portent environ six feuilles.
- Préparation pour les plantes transgéniques a. thaliana
- Se référer à la Table des matières et commander les semences transgéniques d’Arabidopsis .
- Faire tremper les graines d’Arabidopsis transgéniques ~ 50-100 dans 1 mL d’eau distillée et les stocker à 4 ° C pendant 3 jours dans l’obscurité pour synchroniser le début de la germination.
- Semer les graines d’environ 2-3 sur la surface du sol d’un germoir de plante et recouvrir le plateau d’un dôme en plastique. Laissez les graines germent à 23 ° C, humidité de 60 % avec un cycle de photopériode de lumière/obscurité de 10/14 h.
Remarque : Les graines doivent être homozygotes. Cependant, nous recommandons confirmant la présence du transgène dans le lot. Dans ce cas, stériliser les graines en lavant avec de l’éthanol à 70 % pendant 2 min, 50 % eau de Javel (hypochlorite de 2 % environ) contenant 0,05 % de triton X-100 pendant 5 min. Suivez en lavant 5 - 6 fois avec de l’eau bidistillée stérile (ddH2O). Après stérilisation, stratifier à 4 ° C pendant 3 jours et leur plaque sur un milieu de germination de plante contenant 25 µg/L de l’hygromycine B pour sélectionner les plantes transgéniques. - Après une semaine, ne laisser qu’un seul plant par Motte et poursuivre la culture de plantes dans les mêmes conditions de croissance utilisées pour l’étape 1.2.3.
Remarque : Quatre semaines plantes ont été utilisées pour l’infection de P. syringae . Arrose les plantes tous les jours pour garder des plantes en bonne santé.
2. préparation de la Culture de Pseudomonas (~ 1 semaine)
- Construction du plasmide pour transformation de Pseudomonas
- Se référer à la Table des matières et commander le vecteur (s) désirée de l’effecteur T3SS-basé système vecteur25.
- Insérer le gène de l’effecteur d’intérêt dans le vecteur de livraison effecteur à l’aide de recombinaison site-spécifique clonage25.
Remarque : Lors du contrôle de la localisation sous-cellulaire des protéines effectrices pleine longueur, mettre le gène pleine longueur en pBK-GW-1-2 ou pBG-GW-1-2. Il est également possible de choisir pBK-GW-1-4 ou pBG-GW-1-4 contenant 2 x sfGFP11 pour augmenter le signal de fluorescence. Dans le cas d’un effecteur partiel dépourvu peptide signal, utilisez pBK-GW-2-2 ou pBK-GW-2-4. Reportez-vous au parc et coll. pour des informations détaillées sur les vecteurs de livraison effecteur25.
- Transformer le plasmide portant un effecteur fusionné à la balise sfGFP11 de P. syringae pv. Tomate (Pst) CUCPB5500 à l’aide d’électroporation standard29.
Remarque : Les autres souches de Pseudomonas peuvent être utilisés si nécessaire. Le système de tag sfGFP11, est conçu pour un large éventail de vecteurs30 et l’expression du gène de l’effecteur est réglementée par le promoteur de la AvrRpm1, qui est comparable avec, par exemple, Pseudomonas fluorescens (EthAn)31. - Étaler les cellules bactériennes transformées doucement sur la surface des plaques de gélose du roi B contenant 100 rifampicine µg/mL et 25 kanamycine µg/mL ou 25 µg/mL de gentamycine. Incuber à 28 ° C pendant 2 jours.
- Ensemencer une colonie dans un milieu liquide du roi B avec des antibiotiques appropriés pour le vecteur utilisé et poussent les cellules pendant la nuit à 28 ° C sous agitation à 200 tr/min.
- Faire un stock de glycérol. Ajouter glycérol stérilisés à l’autoclave à une concentration finale de 50 % et les conserver à-80 ° C.
3. transitoire Expression sfGFP1-10 Organelle cibléesOPT dans N. benthamiana (4 jours)
- Préparation de la culture Agrobacterium
- Commander le vecteur (s) désiré d’organelle ciblées sfGFP1-10OPT plasmid(s) (reportez-vous à la Table des matières).
- Transformer la plasmid(s) en Agrobacterium tumefaciens souche de cellules GV310132. Cultiver les cellules sur gélose Luria-Bertani (LB) additionné de 50 µg/mL kanamycine et 50 rifampicine µg/mL à 28 ° C durant 2 jours.
- D’une seule colonie sur la gélose LB, ensemencer les cellules dans 5 mL de milieu LB liquide additionné de 50 µg/mL kanamycine et 50 rifampicine µg/mL. Cultiver les cellules pendant la nuit à 28 ° C sous agitation à 200 tr/min.
- Récolte les cellules par centrifugation à 3 000 x g pendant 10 min. égoutter les médias surnageants et Resuspendre le culot dans 1 mL de fraîchement faite tampon d’infiltration.
- Mesurer la quantité d’Agrobacterium en obtenant la valeur de densité optique (do) à une absorbance de 600 nm (Abs 600 nm). Ajuster l' OD600 des bactéries à 0,5 avec le tampon de l’infiltration.
Note : 1 mL de suspension est assez pour s’infiltrer sur deux points. - Laissez la culture à la température ambiante sur un doux rocker 1-5 h avant l’infiltration.
- Introduisez un trou dans le Centre des feuilles pour s’infiltrer à bout 10 µL. Utiliser une seringue sans aiguille de 1 mL pour infiltrer les suspensions d’Agrobacterium . Soigneusement et lentement injecter environ 500 µL de la suspension préparée à partir d’étape 3.1.5 dans le côté adaxial feuille par l’intermédiaire de la seringue. Répétez l’infiltration au moins trois plantes pour répliques expérimentales.
Remarque : Pour des raisons de santé et de sécurité, protection des yeux doit être portée au cours de l’infiltration. - Essuyez la suspension bactérienne reste sur les feuilles et marquent la limite de la région infiltrée.
- Garder les plantes infiltrés dans les mêmes conditions de croissance utilisées pour l’étape 1.1.1 durant 2 jours.
4. inoculation de Pseudomonas (4 jours)
- Ensemencer la souche Pseudomonas transformée sur le stock de glycérol en étape 2.5 du roi B agar Media avec les antibiotiques appropriés à 28 ° C durant 2 jours.
Remarque : La santé des Pseudomonas est très critique. Si les colonies ne font pas bien, ensemencer les cellules à nouveau ou propager les cellules dans un milieu liquide du roi avant de procéder. - Ensemencer une anse de cellules de Pseudomonas dans les milieux liquides Mannitol-Glutamate (MG) à 28 ° C sous agitation à 200 tr/min pour la nuit.
- Resuspendre le culot dans 10 mM MgCl2récolte les cellules par centrifugation à 3 000 x g pendant 10 min. égoutter les médias surnageants, et ajuster l' OD600 à 0,02 (1 x 107 UFC/mL) de feuilles de N. benthamiana et à 0,002 (1 x 10-6 UFC/mL) feuilles de Arabidopsis .
- Pour le N. benthamiana, infiltrer la suspension de Pseudomonas dans la zone des feuilles où l' Agrobacterium transportant constructOPT sfGFP1-10 a été infiltrée 2 jours auparavant (comme dans l’étape 3.1.7). Pour le sfGFP1-10OPT transgéniques Arabidopsis, infiltrer la suspension de Pseudomonas dans 4 semaines deux courtes feuilles cultivées jour.
Remarque : au moins trois usines sont nécessaires pour les répliques expérimentales.
5. observation de sfGFP Signal par l’intermédiaire de la microscopie confocale (1 jour)
- Découper le disque de la feuille de la Pseudomonas-inoculé des feuilles. À des points précis après infiltration de Pseudomonas, image deux disques foliaires de 2 cm2 de la centrale unique à l’aide d’un laser à balayage système confocal avec 40 X / 1.2 objectif à immersion d’eau NA C-Apochromat ou 63 X / 0,8 NA C-Apochromat immersion dans l’huile objectif. Pour éviter les cellules mortes, tuées par blessure, observer les cellules hors du trou de l’infiltration.
- Commencer l’observation à un réglage de faible puissance de laser à argon 488 nm. Augmenter la puissance du laser pour détecter les sfGFP.
Remarque : Nous utilisons habituellement 2 à 15 % de l’intensité du laser pour détecter le signal de fluorescence. Cependant, la puissance du laser et fixer, qui doivent être ajustées selon système de microscopie de l’utilisateur. Ici, les filtres d’émission ont été mis à 520-550 nm. Les cellules mortes émettent souvent auto-fluorescence sous l’excitation de laser 488 nm. Par conséquent, comme témoin négatif, l’effecteur même sans l’étiquette de sfGFP11 devrait être infiltré et observée dans les mêmes conditions d’observation. En outre, excitation laser haute peut induire la chlorophylle autofluorescence. En conséquence, de régler l’intensité du laser en utilisant les cellules végétales de contrôle afin de ne pas d’induire la chlorophylle autofluorescence.- Pour une contre-coloration de la paroi cellulaire, infiltrer l’iodure de propidium 20 mM (PI) dans le disque de feuilles à 5-10 min avant l’observation.
- Le noyau de coloration, submerger les disques foliaires dans paraformaldéhyde 0,1 % pendant 5 min, suivie par lavage à l’eau. Puis, s’infiltrer dans les 10 mM PI dans le disque de feuilles à 5-10 min avant l’observation microscopique. Répéter les expériences au moins trois fois.
Remarque : Cette étape n’est pas critique, mais utile pour définir la localisation d’effecteur à la membrane plasmique ou le noyau. Si les effecteurs d’intérêt ont montré leur localisation dans un organite spécifique, utilisez un marqueur pour l’organite donnée pour confirmer la localisation de l’effecteur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La structure β-baril de GFP est composée d’onze brins β et peut être divisée en deux fragments, le brin deth 1-10 (GFP1-10OPT) et le brin deth (GFP11) 11. Bien qu’aucun des deux fragments fluorescents par eux-mêmes, sfGFP auto-assemblés peut émettre la fluorescence quand les deux fragments existent à proximité (Figure 1 a). Dans ce système, sfGFP1-10OPT-exprimant Arabidopsis ou N. benthamiana plants sont inoculés avec Pseudomonas transportant un effecteur sfGFP11 taggés. L’effecteur sfGFP11 tag livré par Pseudomonas dans le cytosol de la cellule hôte est reconstitué à l' sfGFP1-10OPT exprimée dans le cytosol et ensuite ensemble translocation dans le compartiment de cible (Figure 1 b). La figure 2 représente la procédure globale, de la préparation des matières végétales et Pst à la détection de la fluorescence de signal dans la cellule végétale.
Comme un exemple de notre méthode, nous avons utilisé la protéine effecteur P. syringae , AvrB, qui est livré dans les cellules de la plante hôte approfondies la T3SS lors de l’infection. Chez Arabidopsis, AvrB est reconnu par une protéine de résistance correspondante, RPM1 et déclencheurs des réponses immunitaires dont une hypersensibilité cellulaire mort33. Dans l’étude précédente, le test de journaliste GFP et le dosage biochimique a révélé que AvrB et RPM1 sont localisées dans la membrane plasmique de l’usine cellulaire33,34,35. Pour examiner la localisation de l’AvrB en utilisant notre méthode, Agrobacterium contenant le gèneOPT de CYTO sfGFP1-10 a été infiltré dans N. benthamiana. En deux jours, les cellules transformées par AvrB-sfGFP11 Pseudomonas ont été inoculés à l' Agrobacterium-se sont infiltrés dans la région. La fluorescence sfGFP complétée des signaux ont été observés dans le CUCPB5500 Pst contenant AvrB-sfGFP11 à la membrane plasmique (Figure 3 b). En revanche, aucun signal ont été trouvés dans la cellule infectée par Pst transportant AvrB native (Figure 3 a).
Figure 1. Le système de répartition optimisée GFP. (A) la structure β-baril de GFP est composée d’onze brins β et peut être divisée en le 1-10th β-brin (GFP1-10) et la 11ème β-strand (GFP11). (B) dans cette méthode, les fragmentsd’OPT sfGFP1-10 ont été exprimés dans les cellules végétales, tandis que le brin de sfGFP11 a été fusionné à AvrB et transformé en Pseudomonas. Seulement les cellules de plantes infectées par Pseudomonas contenant sfGFP11 montrera la fluorescence sfGFP (où se localise l’effecteur). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Vue d’ensemble de la procédure. transgénique Arabidopsis ou sfGFP1-10OPT-infiltré N. benthamiana plantes sont infectées avec Pst CUCPB5500 transportant un effecteur sfGFP11 marqués par infiltration de la seringue. La fluorescence de la sfGFP assemblé peut être détectée grâce à un système de microscopie confocale sur le site de la localisation de l’effecteur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 3. AvrB-sfGFP détection sur N. benthamiana laisse 3 h après l’infection. Le Pst CUCPB5500 contenant qu'un gène AvrB sfGFP11-tag a été infiltré sur la 5ème ou 6ème feuilles de N. benthamiana, qui a été infiltré par Agrobacterium transportant sfGFP1-10OPT 2 jours auparavant. La paroi cellulaire a été souillée par l’iodure de propidium. Tandis que les cellules exprimant sfGFP1-10 OPT AvrB seule ne montrent pas de n’importe quel signal de fluorescence (A). Les signaux de la GFP (flèche jaune) ont été observés chez les cellules infectées par le Pst contenant le gène AvrB-sfGFP11 infiltration après 3 h (B). Ce résultat représente que seul AvrB-sfGFP11, pas AvrB, est reconstitué avec sfGFP1-10OPT dans le cytosol et puis le sfGFP assemblé est transloquée vers la membrane plasmique. Couleur magenta pseudo représente la paroi cellulaire et la chlorophylle autofluorescence. Vert représente la fluorescence sfGFP assemblés. Barreaux de l’échelle = 40 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le protocole décrit ici est utilisé pour surveiller la localisation précise des protéines effectrices injecté par la T3SS bactérienne dans la cellule végétale hôte à l’infection. Auparavant, le bibloc GFP a été utilisé comme un outil pour étudier la localisation sous-cellulaire des protéines de mammifères23,36, Salmonella T3E localisation et Agrobacterium VirE2 livraison par l’entremise de le T4SS dans la 37les cellules végétales. Pour appliquer ce système dans les cellules des plantes, des études antérieures utilisé une plante maïs transgénique qui exprime constitutivement le cytoplasmique GFP1-10 et les champignons transgéniques, le Ustilago maydis, qui exprime la protéine effectrice GFP11-tag. Toutefois, le systèmed’u. maydis maïs - n'a pas réussi parce que les niveaux d’expression des protéines effectrices transloqués étaient faibles et un niveau élevé d’arrière-plan autofluorescence entravé la détection du signal reconstitué GFP38. Pour remédier à ce problème, nous avons utilisé un sfGFP1-10 variantes, sfGFP1-10OPT, qui améliore notamment la solubilité et la fluorescence intensité21,22.
Malgré les avantages du système sfGFP split, il y a certaines limites à l’étude de la dynamique et la localisation de l’effecteur. Tout d’abord, le signal fluorescent sfGFP reconstitué observée est relativement faible. Cela pourrait être dû à une petite quantité de molécules effectrices, livrés directement à partir de P. syringae. Ce signal faible pourrait être amélioré en utilisant la balise sfGFP11 de multimerizing. Les vecteurs transportant 2 x sfGFP11 tag sont également disponibles dans les sources énumérés dans la Table des matières. Deuxièmement, le cytosolique de sfGFP1-10 OPT n’ont pas à reconstituer avec sfGFP11 ciblés au Golgi, ER et plastes25. La co-expression de sfGFP11 axés sur les mitochondries et cytosolique sfGFP1-10OPT a entraîné le cytosol et le noyau25localisée de la sfGFP reconstitué. Par conséquent, localisation de l’effecteur d’intérêt doit être re-validée en appliquant l’approprié ciblé organelle sfGFP1-10OPT. Lorsque n’importe quel signal GFP n’est pas détecté dans les cellules infectées exprimant cytosolique sfGFP1-10OPT, nous vous recommandons d’utiliser benth N. exprimant l’appareil de Golgi, ER, et plastes cibléesOPT sfGFP1-10 ou à l’aide de l’organite correspondant ciblé sfGFP1-10OPT transgéniques Arabidopsis25.
Cette méthode a démontré l’utilisation du split système protéine fluorescente comme un outil utile pour examiner la dynamique temporelle et spatiale des effecteurs dans hôte plantes25. Les recherches futures mettra l’accent sur les progrès de l’imagerie molécule unique, qui peut permettre des études détaillées de la dynamique de la membrane plasmique localisée des effecteurs. En outre, un essai de sécrétion à l’aide d’un système bactérien peut être une alternative utile pour étudier la localisation des effecteurs fongiques ; il empêche l’agrégation des effecteurs et autofluorescence élevé sur le site de pénétration fongique.
Il est à noter qu’il y a quelques points clés de cette méthode. Tout d’abord, les végétaux et bactéries doivent être saine et fraîche. Pour vous assurer de visualisation du signal effecteur, tant sfGFP1-10OPT de plantes et les sfGFP11 de Pseudomonas devraient être fortement exprimées. Par conséquent, il est important de faire pousser des plantes dans les conditions de croissance optimales et protégez-les des facteurs de stress environnementaux, tels que les organismes nuisibles. Nous recommandons également que toutes les bactéries utilisées pour l’infiltration extraits des cellules cultivées jour 2 sur les plaques de gélose et pas des stocks de glycérol. Deuxièmement, dans le cas de l’expression transitoire dans N. benthamiana, la longueur du temps nécessaire à la maturation de l’organite ciblées sfGFP1-10OPT peut varier pour chaque protéine de marqueur organite. Par exemple, maturation des PM-sfGFP1-10OPT exige plus de 48 h après l’infiltration. Enfin, le point dans le temps et les niveaux d’expression des signaux sfGFP reconstitué dépendent du type de protéines effectrices qui sont nécessaires pour optimiser certaines conditions expérimentales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par la base Science Research Program grâce à la Fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de la Science, les TIC et la planification future (FRO-2018R1A2A1A05019892) DC et par une subvention du centre de reproduction végétale moléculaire ( PMBC) du programme de prochaine génération Biogreen 21 de l’Administration du développement Rural (PJ013201) d’ép. Nous remercions le centre d’imagerie du Centre National de Instrumentation de gestion de l’environnement fournir un microscope confocal pour le tournage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidopsis transgenic lines | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
| NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
| PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
| Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
| NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
| PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
| ER-sfCherry1-10 | Addgene | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
| CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
| sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| Bacterial strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml) | ||
| Media components | |||
| Plant germination media | Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve. | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | Store at 4 °C. |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| LB media | Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed. | ||
| Tryptone | BD Bioscience | 211705 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| NaCl | Duchefa Biochemie | S0520 | |
| Micro agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
| King's B media | 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed. | ||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 212120 | |
| Anhydrous K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
| Glycerol | Duchefa Biochemie | G1345 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
| Mannitol-Glutamate (MG) liquid media | Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7 | ||
| Mannitol | Duchefa Biochemie | M0803 | |
| L-glutamic acid | Duchefa Biochemie | G0707 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
| Infiltration buffer | 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use. | ||
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize. |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Prepare 100 mM stock in water. Autoclave. |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM stock in DMSO. |
| Confocal microscope equipments/materials | |||
| 710 laser scanning confocal system | Carl Zeiss | ||
| Axio observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| Propidium iodide | ThermoFisher | P1304MP |
References
- Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).
- Buttner, D. Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells. FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 4 (2013).
- Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants. J Bacteriol. 180 (17), 4523-4531 (1998).
- Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Semin Cell Dev Biol. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).
- Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants. Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).
- Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
- Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiol. 122 (4), 999-1001 (2000).
- Courbot, M., et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol. 144 (2), 1052-1065 (2007).
- Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
- Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function. J Biol Chem. 278 (16), 14196-14202 (2003).
- Reinicke, A. T., et al. A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery. J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).
- Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization. Cell. 137 (2), 283-294 (2009).
- Fernandez-Alvarez, A., et al. Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis. PLoS Pathog. 8 (3), e1002563 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, Á Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52 (1), 59 (2008).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).
- Cabantous, S., et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association. Sci Rep. 3, 2854 (2013).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nat Commun. 7, 11046 (2016).
- Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors. Nat Methods. 7 (4), 325-330 (2010).
- Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017).
- Addgene. , Available from: https://www.addgene.org (2018).
- Arabidopsis Biological Resource Center. , Available from: https://abrc.osu.edu (2018).
- Kvitko, B. H., et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4), e1000388 (2009).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Kovach, M. E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Upadhyaya, N. M., et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat. Mol Plant Microbe Interact. 27 (3), 255-264 (2014).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc. 2006 (7), (2006).
- Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).
- Nimchuk, Z., et al. Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae. Cell. 101 (4), 353-363 (2000).
- Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
- Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells. Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).
- Tanaka, S., et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).
