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Biology

Proteina fluorescente verde sistema di visualizzare gli effettori consegnati dai batteri durante l'infezione Split

doi: 10.3791/57719 Published: May 24, 2018

Summary

Approcci basati sulla proteina fluorescenti per monitorare gli effettori secernuti dai batteri nelle cellule ospiti sono impegnativi. Ciò è dovuto all'incompatibilità tra proteine fluorescenti e il sistema di secrezione di tipo III. Qui, un sistema GFP superfolder ottimizzato split viene utilizzato per la visualizzazione degli effettori secernuta dai batteri nella cellula della pianta ospite.

Abstract

Batteri, uno dei più importanti agenti causativi di varie malattie delle piante, secernono una serie di proteine effettrici nella cellula ospite pianta di sovvertire il sistema immunitario di pianta. Durante l'infezione effettori citoplasmatici sono consegnati al cytosol host tramite un tipo sistema di secrezione di III (T3SS). Dopo consegna nella cellula della pianta, il effector(s) gli obiettivi i comparti specifici per modulare i processi di cellula ospitante per la sopravvivenza e la replica dell'agente patogeno. Anche se ci sono state alcune ricerche sulla localizzazione subcellulare delle proteine effettrici nelle cellule ospiti per capire la loro funzione nella patogenicità utilizzando proteine fluorescenti, studio della dinamica degli effettori iniettati direttamente da batteri è stato impegnativo a causa di incompatibilità tra la T3SS e proteine fluorescenti.

Qui, descriviamo il nostro metodo recente di un sistema di proteina fluorescente verde superfolder di Spalato ottimizzato (sfGFPOPT) per visualizzare la localizzazione di effettori tramito il T3SS batterica nella cellula ospite. Il sfGFP11 (th 11 β-filo di sfGFP)-taggati effettrici secernuta attraverso la T3SS possono essere assemblato con un organello specifici mirato sfGFP1-10OPT (1-10th . β-filo di sfGFP) leader per l'emissione di fluorescenza nel sito. Questo protocollo fornisce una procedura per visualizzare il segnale di fluorescenza sfGFP ricostituito con una proteina da Pseudomonas syringae in un organello particolare nelle piante di Arabidopsis e Nicotiana benthamiana .

Introduction

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Le piante sono organismi sessili che incontrano numerosi agenti patogeni d'invasione, inclusi batteri, funghi, virus, insetti e nematodi durante il loro ciclo di vita. Tra i fitopatogeni, i batteri patogeni Gram-negativi come Pseudomonas spp e Ralstonia spp., infettare le loro piante ospiti inserendo attraverso ferite o aperture naturali, come gli stomi e Idatodi1. Per colonizzare con successo piante ospiti, batteri patogeni si sono evolute per sviluppare una varietà di fattori di virulenza2. Quando i batteri invadono una pianta ospite, iniettano una serie di proteine di virulenza — conosciuto come effettori — direttamente nelle cellule della pianta per promuovere la loro patogenicità. Questi effettori sopprimono o modulano l'immunità innata di pianta e manipolare i processi cellulari di host per provocare la sopravvivenza batterica3.

Batteri patogeni usano principalmente un T3SS per fornire proteine effettrici direttamente in host cellule4. Il T3SS assomiglia ad una siringa molecolare con un canale di aghiformi collegare da una struttura di proteine impalcatura attraverso l'interno e le membrane batteriche esterne al sito di iniezione della cellula ospitante5. Questo meccanismo di secrezione T3SS-mediata dell'effettore (T3E) è ben conservato in vari batteri patogeni Gram-negativi della pianta così come umana. Uno degli agenti patogeni fitosanitario rappresentativo, il p. syringae pv. Pomodoro Dc3000 CRHC mutante che ha tipicamente un T3SS difettoso, ha limitato la crescita nelle piante probabilmente dovuto l'incapacità di questo mutante per sopprimere completamente la pianta immunità (iniettando proteine effettrici)6. Al momento di traslocazione in cellule dell'ospite, effettori bersaglio varie proteine ospite che sono importanti per il sistema host delle cellule, compreso le risposte di difesa della pianta, trascrizione genica, morte cellulare, proteasoma, traffico delle vescicole e ormone vie7 , 8 , 9 , 10. Pertanto, rilevamento della localizzazione cellulare delle proteine effettrici in cellule dell'ospite è un obiettivo attraente per capire le loro funzioni rispetto alla modulazione dell'immunità pianta.

La maggior parte degli studi di localizzazione della T3Es hanno impiegato la sovraespressione dell'agrobatterio -mediata con una proteina di grande fluorescenza nella pianta ospite9. Tuttavia, il metodo di espressione eterologa di geni che vengono introdotti in altre specie ha dimostrato di essere mis-localizzata o occasionalmente non-funzionali11,12,13. Inoltre, diversi studi hanno rivelato che gli effettori batterici subiscano modifiche per il targeting corretto nel host cellule14,15,16,17. Di conseguenza, espresso transitoriamente effettori nel citosol della pianta cellule non possono essere funzionalmente o quantitativamente identiche agli effettori che sono trasportati da T3SS all'agente patogeno infezione18. Inoltre, la fusione di grandi tag fluorescente da proteine effettrici potrebbe interferire con il corretto effettrici consegna e visualizzazione18,19. Pertanto, questi approcci di saggiare la funzione T3E potrebbero non corrispondere completamente la localizzazione nativa degli effettori T3SS-secreto.

Una proteina fluorescente verde (GFP) è composto da un filamento 11 β-barilotto che racchiude un filo centrale che include un cromoforo20. Waldo et al. segnalato un sistema di romanzo Spalato-GFP che consiste di un piccolo componente (GFP β filo 11; GFP11) e un grande frammento complementare (strand β di GFP 1-10; GFP1-10)21. I frammenti non reagiscono da soli ma reagiscono in su loro autoassociazione quando entrambi i frammenti sono in stretta vicinanza con l'altro. Per l'ottimizzazione dell'efficienza della proteina pieghevole, pieghevole robusti varianti della GFP, vale a dire, sfGFP e sfGFPOPT, sono state successivamente sviluppate per21,20,del sistema GFP Spalato,22. Recentemente, il singolo amminoacido mutato varianti di sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT e sfCFP1-10OPT- che può ricostituire con un frammento di sfGFP11 e fluorescenza giallo e ciano Visualizza rispettivamente, sono stati generati23 . Inoltre, sfCherry, un derivato di mCherry, può essere suddiviso in frammenti sfCherry1-10 e sfCherry11 nello stesso modo come sfGFP23.

Questo sistema è stato adattato per etichettare e traccia gli effettori T3SS in cellule HeLa durante infezione usando gli effettori da Salmonella24. Tuttavia, è stato tradotto non ottimizzato per il sistema di impianto-batterico patogeno di host. Recentemente, abbiamo ottimizzato il sistema GFP Spalato basato sul migliore sfGFP1-10OPT per monitorare la localizzazione subcellulare di T3Es consegnato da p. syringae in pianta cellule25. Per facilitare gli studi di localizzazione di T3Es a diversi compartimenti subcellulari nelle cellule della pianta, un insieme di transgeniche di Arabidopsis thaliana piante sono stati generati per esprimere sfGFP1-10OPT in vari compartimenti subcellulari 25. Inoltre, i plasmidi che trasportano una varietà di organello targeting sfGFP1-10OPT per l' agrobatterio-mediata sovraespressione transitoria e i vettori di sfGFP11-etichetta per la consegna di basati su T3SS effettrici inoltre sono stati generati. I semi di varie linee transgeniche di Arabidopsis e i plasmidi per esprimere la T3Es di interesse possono essere ottenuti da fonti menzionate nel Tabella materiali26,27.

Nel seguente protocollo, descriviamo un sistema ottimizzato per monitorare le dinamiche degli effettori consegnati da batteri nelle cellule ospiti utilizzando il sistema di sfGFP di Spalato. Infezione di piante esprimenti sfGFP1-10OPT con transgenici Pseudomonas che trasportano il plasmide ricombinante sfGFP11 provoca una consegna dell'effettore sfGFP11-contrassegnati da Pseudomonas nella cellula ospite. Di conseguenza, queste proteine vengono ricostituite e traslocano nei comparti di destinazione effettrici specifiche. La Pseudomonas syringae pv. pomodoro Ceppo di CUCPB5500 in cui vengono eliminati gli 18 effettori, è stato utilizzato perché questo ceppo ha mostrato bassa o nessuna morte delle cellule in sia a. thaliana e N. benthamianas28. Tuttavia, tutti i materiali e i passaggi descritti qui può essere sostituiti o modificati per adattare il sistema di sfGFP di Spalato per indagine di altre domande biologiche o di ottimizzazione in condizioni di laboratorio dato.

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Protocol

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Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente, se non diversamente specificato.

1. preparazione dei materiali vegetali (4 settimane)

  1. Preparazione per le piante di benthamiana N.
    1. Seminare i 2 semi di N. benthamiana sulla superficie del suolo di ogni piatto, coprire il vassoio con una cupola di plastica e consentire semi di germinare in a 25 ° C, 60% camera di crescita di umidità con un ciclo di 16/8-h chiaro/scuro fotoperiodo.
    2. Dopo due settimane, è possibile scegliere e scartare il più piccolo semenzale in ogni pentola e continuare a coltivare le piante sotto le stesse condizioni di crescita applicati per la germinazione nel passaggio 1.1.1. Aggiungere 1 L di acqua al vassoio ogni due giorni.
      Nota: Le condizioni di crescita per piante possono variare attraverso laboratori. Pertanto, seguire il protocollo di irrigazione regolare per far crescere la pianta in buone condizioni di salute.
    3. In una settimana, trasferire le piante a un nuovo vassoio e disporle con uno spazio adeguato per un'ulteriore crescita. Continuano a crescere le piante nelle condizioni descritte al punto 1.1.1, finché non sono pronti per essere infiltrato a 4 settimane di età.
      Nota: La crescita delle piante può differire a seconda delle condizioni di crescita attraverso laboratori. Di solito, troviamo che il 4-settimana-vecchio N. benthamiana piante sopportano circa sei foglie.
  2. Preparazione di piante transgeniche di a. thaliana
    1. Fare riferimento alla Tabella materiali e ordinare le sementi transgeniche di Arabidopsis .
    2. Immergere le sementi transgeniche di Arabidopsis ~ 50-100 in 1 mL di acqua distillata e conservarli a 4 ° C per 3 giorni al buio per sincronizzare l'inizio della germinazione.
    3. Seminare i semi di ~ 2-3 sulla superficie del suolo di un vassoio di pianta di spina e coprire il vassoio con una cupola di plastica. Consentire semi di germinare a 23 ° C, umidità 60% con un ciclo di 10/14-h chiaro/scuro fotoperiodo.
      Nota: I semi dovrebbero essere omozigoti. Tuttavia, si consiglia di riconfermare la presenza del transgene nel batch. In questo caso, sterilizzare i semi mediante lavaggio con etanolo al 70% per 2 min, 50% candeggina (ipoclorito di 2% circa) contenente 0,05% triton X-100 per 5 min seguite da 5 - 6 volte di lavaggio con acqua distillata doppia sterile (ddH2O). Dopo la sterilizzazione stratifica a 4 ° C per 3 giorni e impiattatelo su supporti di germinazione di piante contenenti 25 µ g/L di igromicina B per selezionare le piante transgeniche.
    4. Dopo una settimana, lasciare solo una pianta per spina e continuare a crescere piante sotto le stesse condizioni di crescita utilizzate per passo 1.2.3.
      Nota: I quattro-settimana-vecchi piante erano usate per l'infezione di p. syringae . Acqua piante ogni giorno per mantenere le piante sane.

2. preparazione della cultura Pseudomonas (~ 1 settimana)

  1. Costruzione del plasmide per trasformazione di Pseudomonas
    1. Fare riferimento alla Tabella materiali e ordinare il tutt' desiderata dell'effettore basati su T3SS consegna sistema vettoriale25.
    2. Inserire il gene dell'effettore di interesse il vettore di consegna effettrici tramite clonazione25site-specific di ricombinazione.
      Nota: Durante il monitoraggio di localizzazione subcellulare delle proteine effettrici full-length, mettere il gene full-length in pBK-GW-1-2 o pBG-GW-1-2. È anche possibile scegliere pBK-GW-1-4 o pBG-GW-1-4 che contiene 2 x sfGFP11 per aumentato il segnale di fluorescenza. Nel caso di un effettore parziale carente peptide segnale, utilizzare pBK-GW-2-2 o pBK-GW-2-4. Fare riferimento a Park et al. per informazioni dettagliate su effettrici consegna vettori25.
  2. Trasformare il plasmide che trasportano un effettore fuso per il tag sfGFP11 a p. syringae pv. Pomodoro (Pst) CUCPB5500 usando elettroporazione standard29.
    Nota: Altri ceppi di Pseudomonas possono essere utilizzati se necessario. Il sistema di tag sfGFP11 è costruito per una vasta gamma di vettori30 e l'espressione genica dell'effettore è regolato dal promotore AvrRpm1, che è paragonabile con, per esempio, Pseudomonas fluorescens (EthAn)31.
  3. Diffondere le cellule batteriche trasformate delicatamente sopra la superficie delle piastre di agar del re B contenente 100 µ g/mL rifampicina e kanamicina di 25 µ g/mL o 25 µ g/mL Gentamicina. Incubare a 28 ° C per 2 giorni.
  4. Inoculare una colonia in mezzi liquidi di B del re con antibiotici appropriati per il vettore utilizzato e far crescere le cellule durante la notte a 28 ° C con agitazione a 200 giri/min.
  5. Fare un magazzino di glicerolo. Aggiungere glicerolo in autoclave ad una concentrazione finale di 50% e conservare a-80 ° C.

3. transitoria espressione di targeting organello sfGFP1-10OPT in N. benthamiana (4 giorni)

  1. Preparazione della cultura dell'agrobatterio
    1. Ordine il desiderato tutt' di targeting organello sfGFP1-10OPT plasmid(s) (fare riferimento alla Tabella materiali).
    2. Trasformare il plasmid(s) in Agrobacterium tumefaciens ceppo GV3101 cellule32. Crescere le cellule su agar di Luria-Bertani (LB), completati con kanamicina di 50 µ g/mL e 50 µ g/mL rifampicina a 28 ° C per 2 giorni.
    3. Da una singola colonia sull'agar LB, inoculare le cellule in 5 mL di terreno liquido LB completati con 50 µ g/mL kanamicina e rifampicina di 50 µ g/mL. Crescere le cellule durante la notte a 28 ° C con agitazione a 200 giri/min.
    4. Raccolto le cellule mediante centrifugazione a 3.000 x g per 10 min versare fuori i media surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di appena fatto buffer di infiltrazione.
    5. Misura della quantità di Agrobacterium ottenendo il valore di densità ottica (OD) presso un'assorbanza di 600 nm (Abs 600 nm). Regolare il OD600 dei batteri a 0,5 con buffer di infiltrazione.
      Nota: 1 mL di sospensione è sufficiente per infiltrarsi su due punti.
    6. Lasciare la cultura a temperatura ambiente su un delicato rocker per 1-5 h prima infiltrazione.
    7. Fare un buco al centro delle foglie per essere infiltrato con una punta di 10 µ l. Utilizzare una siringa senza ago da 1 mL per infiltrare le sospensioni di Agrobacterium . Lentamente e con cautela iniettare circa 500 µ l delle sospensioni preparate dal punto 3.1.5 nel lato adassiale foglia tramite la siringa. Ripetere l'infiltrazione su almeno tre piante diverse per repliche sperimentali.
      Nota: Per motivi di salute e sicurezza, protezione degli occhi deve essere indossato durante l'infiltrazione.
    8. Pulire il restante sospensione batterica sulle foglie e segnano il confine della regione infiltrata.
    9. Mantenere le piante infiltrate sotto le stesse condizioni di crescita usate per passaggio 1.1.1 per 2 giorni.

4. inoculazione di Pseudomonas (4 giorni)

  1. Striscia il ceppo di Pseudomonas trasformato dallo stock di glicerolo nel passo 2.5 su supporti di agar B del re con gli antibiotici adatti a 28 ° C per 2 giorni.
    Nota: La salute di Pseudomonas è molto critica. Se colonie non fanno bene, striscia ancora una volta le cellule o propagare le cellule in liquidi del re prima di procedere.
  2. Inoculare un loopful delle cellule di Pseudomonas in mezzi liquidi di mannitolo-glutammato (MG) a 28 ° C con agitazione a 200 giri/min per una notte.
  3. Raccolto le cellule mediante centrifugazione a 3.000 x g per 10 min versare fuori media surnatante, risospendere il pellet in 10mm MgCl2e regolare il OD600 a 0.02 (1 x 107 cfu/mL) per N. benthamiana foglie e a 0,002 (1 x 106 CFU/mL) per Arabidopsis lascia.
  4. Per il N. benthamiana, infiltrarsi la sospensione di Pseudomonas nell'area delle foglie dove l' agrobatterio che trasportano sfGFP1-10OPT costrutto si è infiltrato in 2 giorni in precedenza (come al punto 3.1.7). Per il sfGFP1-10OPT transgenici Arabidopsis, infiltrarsi la sospensione di Pseudomonas due 4-settimana-vecchio breve giorno-grown foglie.
    Nota: almeno tre impianti sono necessari per repliche sperimentali.

5. osservazione di sfGFP segnale tramite microscopia confocale (1 giorno)

  1. Tagliare il disco di foglia da Pseudomonas-inoculato foglie. A intervalli di tempo specifici dopo l'infiltrazione di Pseudomonas, immagine due dischi di 2 cm2 foglia dalla pianta singola utilizzando un laser a scansione confocale sistema con 40 X / 1.2 obiettivo a immersione in acqua NA C-Apochromat o 63 X / 0,8 NA C-Apochromat olio da immersione obiettivo. Per evitare le cellule morte, uccidere dal ferimento, osservare le cellule via dal foro di infiltrazione.
  2. Iniziare l'osservazione con un'impostazione di bassa potenza del laser di argon a 488 nm. Aumentare la potenza del laser per rilevare sfGFP.
    Nota: Usiamo solitamente 2-15% dell'intensità del laser per rilevare il segnale di fluorescenza. Tuttavia, la potenza del laser e l'impostazione di rilevamento deve essere regolate basata su sistema di microscopia dell'utente. Qui, i filtri di emissione sono stati impostati a 520-550 nm. Le cellule morte emettono spesso auto-fluorescenza sotto l'eccitazione laser 488 nm. Pertanto, come controllo negativo, l'effettore stesso senza il cartellino del sfGFP11 dovrebbe essere infiltrato e osservato nelle stesse condizioni di osservazione. Inoltre, eccitazione laser alta può indurre clorofilla autofluorescenza. Di conseguenza, regolare l'intensità del laser utilizzando cellule della pianta di controllo per non indurre clorofilla autofluorescenza.
    1. Per una colorazione di contrasto della parete delle cellule, infiltrarsi ioduro di propidio 20mm (PI) il disco di foglia a 5-10 min prima osservazione.
    2. Per il nucleo di macchiatura, immergere i dischi di foglia in 0,1% paraformaldeide per 5 min seguita da lavaggio con acqua. Quindi, si infiltrano il 10 mM PI nel disco foglia a 5-10 min prima osservazione microscopica. Ripetere gli esperimenti almeno tre volte.
      Nota: Questo passaggio non è critica ma utili per definire la localizzazione dell'effettore alla membrana plasmatica o il nucleo. Se gli effettori di interesse hanno mostrato la loro localizzazione in un organello specifico, è possibile utilizzare un indicatore per l'organello dato per confermare la localizzazione dell'effettore.

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Representative Results

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La struttura del β-barilotto della GFP è composta da undici filamenti β e può essere diviso in due frammenti, il filo dith di 1-10 (GFP1-10OPT) e il filo dith (GFP11) 11. Anche se nessuno dei due frammenti fluorescenti da soli, sfGFP auto-assemblati è in grado di emettere fluorescenza quando i due frammenti presenti nelle immediate vicinanze (Figura 1A). In questo sistema, sfGFP1-10OPT-esprimendo di Arabidopsis o N. benthamiana piante vengono inoculate con Pseudomonas che trasportano un effettore sfGFP11 etichettate. L'effettore sfGFP11 etichetta consegnato da Pseudomonas nel citosol della cellula ospite viene ricostituito il-sfGFP1-10OPT espresso nel citosol e quindi insieme traslocano nel vano di destinazione (Figura 1B). Figura 2 rappresenta la procedura complessiva, dalla preparazione dei materiali vegetali e Pst per il rilevamento del segnale di fluorescenza nella cellula vegetale.

Come esempio del nostro metodo, abbiamo usato la proteina p. syringae , AvrB, che è trasportato in cellule della pianta ospite approfondite la T3SS durante l'infezione. In Arabidopsis, AvrB è riconosciuto da una proteina di resistenza corrispondente, RPM1 e risposte immunitarie trigger compresi ipersensibile delle cellule morte33. Nello studio precedente, l'analisi del reporter GFP e l'analisi biochimica ha rivelato che AvrB e RPM1 sono localizzati nella membrana plasmatica della pianta cella33,34,35. Per esaminare la localizzazione di AvrB con il nostro metodo, Agrobacterium che harboring il geneOPT sfGFP1-10 CYTO infiltratosi nel N. benthamiana. In due giorni, le cellule AvrB-sfGFP11-trasformato Pseudomonas sono state inoculate in Agrobacterium-infiltrato in regione. La fluorescenza di sfGFP integrato segnali sono stati osservati nel CUCPB5500 Pst contenente AvrB-sfGFP11 alla membrana del plasma (Figura 3B). Al contrario, nessun segnali sono stati trovati nella cellula infettata da Pst che trasportano AvrB nativa (Figura 3A).

Figure 1
Figura 1. Il sistema GFP ottimizzato Spalato. (A) la struttura del β-barilotto della GFP è composto di undici β-fili e può essere suddivisa in 1-10th β-strand (GFP1-10) e 11th β-strand (GFP11). (B) In questo metodo, i frammentiOPT sfGFP1-10 sono stati espressi nelle cellule vegetali, mentre il filo di sfGFP11 fu fusa a AvrB e trasformato in Pseudomonas. Solo delle cellule di piante infettate da Pseudomonas contenenti sfGFP11 mostrerà la fluorescenza di sfGFP (dove si localizza l'effettore). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Panoramica della procedura di. Il transgeniche di Arabidopsis o il sfGFP1-10OPT-infiltrato N. benthamiana pianta sono infettati con Pst CUCPB5500 che trasportano un effettore sfGFP11-etichetta attraverso l'infiltrazione di siringa. La fluorescenza della sfGFP assemblati possa essere rilevata tramite un sistema di microscopia confocale presso il sito della localizzazione dell'effettore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Nella figura 3. Rilevamento di AvrB-sfGFP il N. benthamiana lascia 3 h dopo l'infezione. Il Pst CUCPB5500 che harboring che un gene di AvrB sfGFP11-tag è stato infiltrato su 5th o 6th foglia di benthamiana N., che si è infiltrata da Agrobacterium che trasportano il sfGFP1-10OPT 2 giorni in precedenza. La parete cellulare era macchiata di ioduro di propidio. Mentre le cellule che esprimono sfGFP1-10 OPT con sola AvrB non mostrano alcun segnale di fluorescenza (A). I segnali GFP (freccia gialla) sono stati osservati in cellule infettate da Pst contenente il gene AvrB-sfGFP11 a post-infiltrazione 3h (B). Questo risultato rappresenta che solo AvrB-sfGFP11, non AvrB, viene ricostituito con sfGFP1-10OPT al cytosol e poi la sfGFP assemblato è traslocata sulla membrana plasmatica. Colore magenta pseudo rappresenta la parete cellulare e clorofilla autofluorescenza. Verde rappresenta la fluorescenza sfGFP assemblato. Scala bar = 40 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Il protocollo descritto qui è utilizzato per il monitoraggio la localizzazione esatta delle proteine effettrici iniettato dal T3SS batterica nella cellula ospite pianta al momento dell'infezione. In precedenza, il sistema GFP Spalato è stato utilizzato come strumento per studiare la localizzazione subcellulare delle proteine di mammifero23,36, Salmonella T3E localizzazione e Agrobacterium VirE2 consegna attraverso il T4SS nella impianto di cellule37. Per applicare questo sistema nelle cellule della pianta, gli studi precedenti usato una pianta mais transgenica che esprime costitutivamente il citoplasmico GFP1-10 e il fungo transgenico, Ustilago maydis, che esprime la proteina GFP11-etichetta. Tuttavia, il sistema diU. maydis mais - non ha avuto successo perché i livelli di espressione delle proteine effettrici spostato erano deboli e alto livello di sfondo autofluorescence ostacolato la rilevazione del ricostituito GFP segnale38. Per ovviare a questo problema, abbiamo usato un sfGFP1-10 variante, sfGFP1-10OPT, che migliora significativamente la solubilità e fluorescenza intensità21,22.

Nonostante i vantaggi del sistema sfGFP Spalato, ci sono alcune limitazioni allo studio delle dinamiche e localizzazione dell'effettore. In primo luogo, il segnale fluorescente osservato sfGFP ricostituito è relativamente debole. Questo potrebbe essere a causa di una piccola quantità di molecole effettrici consegnato direttamente da p. syringae. Questo segnale debole potrebbe essere migliorato utilizzando il tag di sfGFP11 di multimerizing. I vettori che trasportano 2 x sfGFP11 tag sono disponibili anche dalle fonti elencate nella Tabella materiali. In secondo luogo, il sfGFP1-10 citosolico OPT non è riuscito a essere ricostituita con sfGFP11 mirate a Plastidio25, ER e Golgi. Co-espressione di sfGFP11 mitocondrio-mirati e citosolica sfGFP1-10OPT è provocato da mislocalization del sfGFP ricostituiti al citoplasma e nucleo25. Di conseguenza, localizzazione dell'effettore di interesse deve essere ri-convalidati applicando l'appropriato targeting organello sfGFP1-10OPT. Quando qualsiasi segnale GFP non è stata rilevata nelle cellule infette esprimendo citosolico sfGFP1-10OPT, si consiglia di utilizzare N. benth esprimendo Golgi, ER, e Plastidio mirati sfGFP1-10OPT o utilizzando il corrispondente organello mirato sfGFP1-10OPT transgenici Arabidopsis25.

Questo metodo ha dimostrato l'uso del sistema proteina fluorescente Spalato come uno strumento utile per esaminare la dinamica temporale e spaziale degli effettori in host piante25. La ricerca futura si concentrerà sugli avanzamenti nella formazione immagine singola molecola, che può attivare studi dettagliati delle dinamiche di effettori localizzata della membrana plasmatica. Inoltre, un'analisi di secrezione usando un sistema batterico può essere alternativa utile per studiare la localizzazione degli effettori fungini; esso impedisce l'aggregazione degli effettori e autofluorescenza alta presso il sito di penetrazione fungine.

Dovrebbe essere notato che ci sono alcuni punti chiave in questo metodo. In primo luogo, sia materiali vegetali e batteri devono essere sana e fresca. Per garantire la visualizzazione del segnale effettore, dovrebbe essere fortemente espresso sia il sfGFP1-10OPT da piante e la sfGFP11 da Pseudomonas . Pertanto, è importante crescere le piante sotto le condizioni di crescita ottimale e proteggerli dagli stress ambientali, come i parassiti. Si consiglia, inoltre, che tutti i batteri utilizzati per infiltrazione siano adottate dalle cellule coltivate giorno 2 sulle piastre di agar e non dalle scorte di glicerolo. In secondo luogo, nel caso di espressione transiente in N. benthamiana, la lunghezza del tempo necessario per la maturazione di targeting organello sfGFP1-10OPT potrebbe variare per ogni proteina marker dell'organello. Ad esempio, maturazione di PM-sfGFP1-10OPT richiede più di 48 h dopo l'infiltrazione. Infine, il punto del tempo e i livelli di espressione dei segnali ricostituita sfGFP dipendono dal tipo di proteine effettrici che sono necessari per ottimizzare alcune condizioni sperimentali.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di base scienza ricerca attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT e pianificazione futura (NRF-2018R1A2A1A05019892) a DC e da una sovvenzione dal centro di allevamento vegetale molecolare ( PMBC) del programma di prossima generazione Biogreen 21 dell'amministrazione di sviluppo rurale (PJ013201) EP. Si ringrazia il centro di imaging del centro nazionale di strumentazione per la gestione ambientale fornire un microscopio confocale per le riprese.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis transgenic lines Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10 ABRC CS69831
NU-sfGFP1-10 ABRC CS69832
PT-sfGFP1-10 ABRC CS69833
MT-sfGFP1-10 ABRC CS69834
PX-sfGFP1-10 ABRC CS69835
ER-sfGFP1-10 ABRC CS69836
GO-sfGFP1-10 ABRC CS69837
PM-sfGFP1-10 ABRC CS69838
Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10 Addgene 97387
NU-sfGFP1-10 Addgene 97388
PT-sfGFP1-10 Addgene 97389
MT-sfGFP1-10 Addgene 97390
PX-sfGFP1-10 Addgene 97391
ER-sfGFP1-10 Addgene 97392
GO-sfGFP1-10 Addgene 97393
PM-sfGFP1-10 Addgene 97394
ER-sfCherry1-10 Addgene 97403
ER-sfYFP1-10 Addgene 97404
CYTO-sfCFP1-10 Addgene 97405
sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2 Addgene 98250 pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4 Addgene 98251 pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2 Addgene 98252 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4 Addgene 98253 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2 Addgene 98254 pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4 Addgene 98255 pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2 Addgene 98256 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4 Addgene 98257 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
Bacterial strains
Agrobacterium tumefaciens GV3101 Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml)
Media components
Plant germination media Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve.
Murashige & Skoog medium including vitamins Duchefa Biochemie M0222 Store at 4 °C.
Sucrose Duchefa Biochemie S0809
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
LB media Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave.  Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed.
Tryptone BD Bioscience 211705
Yeast extract BD Bioscience 212750
NaCl Duchefa Biochemie S0520
Micro agar Duchefa Biochemie M1002
King's B media 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed.
Proteose peptone BD Bioscience 212120
Anhydrous K2HPO4 Sigma-Aldrich 1551128 USP
Glycerol Duchefa Biochemie G1345
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
Bacto Agar BD Bioscience 214010
Mannitol-Glutamate (MG) liquid media Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7
Mannitol Duchefa Biochemie M0803
L-glutamic acid Duchefa Biochemie G0707
KH2PO4 Sigma-Aldrich NIST200B
Infiltration buffer 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use.
MES Duchefa Biochemie M1503 Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize.
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Prepare 100 mM stock in water. Autoclave.
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406 Prepare 150 mM stock in DMSO.
Confocal microscope equipments/materials
710 laser scanning confocal system Carl Zeiss
Axio observer Z1 inverted microscope Carl Zeiss
Propidium iodide ThermoFisher P1304MP

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References

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Proteina fluorescente verde sistema di visualizzare gli effettori consegnati dai batteri durante l'infezione Split
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Lee, H. Y., Lee, S. E., Woo, J., Choi, D., Park, E. Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection. J. Vis. Exp. (135), e57719, doi:10.3791/57719 (2018).More

Lee, H. Y., Lee, S. E., Woo, J., Choi, D., Park, E. Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection. J. Vis. Exp. (135), e57719, doi:10.3791/57719 (2018).

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