Summary
Fluorescerende protein-baserte tilnærminger til overvåke effektor utskilles av bakterier i vertsceller er utfordrende. Dette skyldes inkompatibilitet mellom fluorescerende proteiner og type-III sekresjon systemet. Her, brukes en optimalisert delt superfolder GFP system for visualisering av effektor utskilles av bakterier i verten anlegget celle.
Abstract
Bakterier, en av de viktigste forårsaker agentene fra ulike anlegg sykdommer, skiller en rekke effektor proteiner til verten anlegget celle å styrte immunsystemet anlegget. Under infeksjon leveres cytoplasmatiske effektor til verten stoffer via en type III sekresjon system (T3SS). Etter levering i anlegget celle mål effector(s) den spesifikke compartment(s) for å modulere verten celleprosesser for overlevelse og replikering av patogen. Selv om det har vært noen undersøkelser på den subcellular lokaliseringen av effektor proteiner i verten cellene å forstå deres funksjon i virusets ved å bruke fluorescerende proteiner, undersøkelse av dynamikken i effektor direkte injiseres fra bakterier har vært utfordrende på grunn av inkompatibilitet mellom T3SS og fluorescerende proteiner.
Her beskriver vi vår siste metode for en optimalisert delt superfolder grønne fluorescerende protein system (sfGFPOPT) å visualisere lokalisering av effektor levert via bakteriell T3SS i vert cellen. SfGFP11 (11th β-strand av sfGFP)-merket effektor skilles ut gjennom T3SS kan settes sammen med en bestemt organelle målrettet sfGFP1-10OPT (1-10th β-strand i sfGFP) ledende til fluorescens utslipp på stedet. Denne protokollen gir en prosedyre for å visualisere rekonstituert sfGFP fluorescens signalet med en effektor protein fra Pseudomonas syringae i en bestemt organelle på Arabidopsis og Nicotiana benthamiana planter.
Introduction
Planter er fastsittende organismer som møter mange invaderende patogener inkludert bakterier, sopp, virus, insekter og nematoder gjennom hele livssyklusen. Blant phytopathogens, gram-negative bakteriell patogener som Pseudomonas spp. og Ralstonia spp., infisere sine Salix ved å angi gjennom sår eller naturlig åpninger, som stomata og hydathode1. For å lykkes kolonisere Salix, bakteriell patogener utviklet seg for å utvikle en rekke virulens faktorer2. Når bakterier invaderer næringsplante, de injiserer en rekke virulens proteiner, kjent som effektor-direkte inn i anlegget celler å fremme deres virusets. Disse effektor undertrykke eller modulerer anlegget medfødt immunitet og manipulere vert cellulære prosesser for å føre til bakteriell overlevelse3.
Patogene bakterier bruker hovedsakelig en T3SS for å levere effektor proteiner direkte til verten cellene4. T3SS ligner en molekylær sprøyte med en nål som kanal koble fra en stillaset proteinstruktur over indre og ytre bakteriell membraner til injeksjonsstedet verten celle5. Denne T3SS-mediert effektor (T3E) sekresjon mekanismen er godt bevart i ulike gram-negative bakteriell patogener av anlegget samt menneskelige. En representant anlegget patogener, P. syringae pv. Tomat DC3000 hrcC mutant som vanligvis har en defekt T3SS, har begrenset vekst i planter sannsynlig på grunn av manglende evne av denne mutant å fullstendig undertrykke anlegget immunitet (ved å injisere effektor proteiner)6. På translokasjon inn i vertsceller målrette effektor ulike vert proteiner som er viktig for celle vertssystemet, inkludert anlegget forsvar svar, gene transkripsjon, celledød, proteasome, vesicle smugling og hormon trasé7 , 8 , 9 , 10. sporing av mobilnettet lokalisering av effektor proteinene i verten cellene er derfor et attraktivt mål å forstå deres funksjoner med hensyn til modulering av anlegget immunitet.
De fleste av lokalisering studier av T3Es har ansatt Agrobacterium -mediert overuttrykte med en stor fluorescens protein i verten anlegget9. Metoden heterologous uttrykk for gener som er innført i andre arter har imidlertid vist seg å være mis lokaliserte eller noen ganger ikke-fungerende11,12,13. I tillegg viste flere studier at bakteriell effektor gjennomgå modifikasjon for riktig målgruppe i de vert celler14,15,16,17. Derfor uttrykt transiently effektor i stoffer av plante celler ikke kan være funksjonelt eller kvantitativt identisk effektor som leveres av T3SS på patogen infeksjon18. Videre kan fusjon av store fluorescerende tags effektor proteiner forstyrre riktig effektor levering og visualisering18,19. Derfor kan disse tilnærminger til analysen funksjonen T3E ikke fullt gjenspeiler den opprinnelige lokaliseringen av T3SS-utskilles effektor.
En grønn fluorescerende protein (GFP) består av en 11-strandet β-fat omslutter en sentral strand som inkluderer en chromophore20. Waldo et al. rapportert en roman split-GFP system som består av en liten del (GFP β tråd 11; GFP11) og en stor supplerende fragment (GFP β strand 1-10; GFP1-10)21. Fragmenter fluoresce ikke av seg selv, men fluoresce på tilknytningen selv når begge fragmentene er i nærheten med hverandre. For optimalisering av protein folding effektiviteten, ble robust folding varianter av GFP, dvs., sfGFP og sfGFPOPT, senere utviklet for delt GFP systemet20,21,22. Nylig mutert enkelt aminosyre varianter av sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT og sfCFP1-10OPT- som kan gjeninnføre med sfGFP11 fragment og Vis gule og cyanfargede fluorescens henholdsvis, ble generert23 . Videre sfCherry, et derivat av mCherry, kan deles inn i sfCherry1-10 og sfCherry11 fragmenter på samme måte som sfGFP23.
Dette systemet har vært tilpasset etikett og spore T3SS effektor i HeLa celler under infeksjon med effektor fra Salmonella24. Men var det tidligere ikke optimalisert for plante-bakteriell patogen vertssystemet. Nylig optimalisert vi delt GFP systemet basert på forbedret sfGFP1-10OPT å overvåke den subcellular lokaliseringen av T3Es levert fra P. syringae i anlegget celler25. For å lette lokalisering studier av T3Es til forskjellige subcellular rom i anlegget celler, et sett av transgene Arabidopsis thaliana ble planter generert for å uttrykke sfGFP1-10OPT i de ulike subcellular avdelinger 25. videre plasmider bærer en rekke organelle målrettet sfGFP1-10OPT for Agrobacterium-mediert forbigående overuttrykte og sfGFP11-merket vektorer for levering av T3SS-baserte effektor også genereres. Frøene av ulike transgene Arabidopsis linjer og plasmider å uttrykke T3Es rundt kan fås fra kilder som er nevnt i Tabellen for materiale26,27.
I den følgende protokollen beskriver vi en optimalisert system for å overvåke dynamikken i effektor av bakterier i verten cellene med delt sfGFP systemet. Infeksjon av planter uttrykke sfGFP1-10OPT med transgene Pseudomonas bærer rekombinant sfGFP11 plasmider resulterer i en levering av sfGFP11-merket effektor fra Pseudomonas inn i vert-cellen. Derfor disse proteinene er rekonstituert og translocate til bestemte effektor målet compartment(s). Pseudomonas syringae pv. tomat CUCPB5500 belastningen som slettes 18 effektor, ble brukt fordi denne belastningen viste lav eller ingen celledød i både A. thaliana og N. benthamianas28. Imidlertid kan alle materialer og trinnene som beskrives her erstattet eller endret for å tilpasse delt sfGFP systemet for undersøkelse av andre biologiske spørsmål eller optimalisering i de gitte laboratorieforhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Alle trinnene utføres ved romtemperatur, ikke annet er angitt.
1. forberedelse av plantemateriale (4 uker)
- Forberedelse for N. benthamiana planter
- Så 2 frø av N. benthamiana på overflaten av hver pott, dekke skuffen med en plast kuppel og tillate frø til å spire i en 25 ° C, 60% fuktighet vekst kammer med en 16/8-h lys/mørke fotoperiode syklus.
- Etter to uker, plukke ut og kaste den minste frøplante i hver pott og fortsette å vokse planter oppstiller vekst som søkte spiring i trinn 1.1.1. Legg 1 L vann per skuff annenhver dag.
Merk: Vekst betingelsene for planter kan variere mellom laboratorier. Derfor Følg vanlige vanning protokollen å vokse anlegget i en sunn tilstand. - I en uke, overføre plantene til en ny skuff og ordne dem med tilstrekkelig plass for videre vekst. Vokse planter under forholdene som er beskrevet i trinn 1.1.1 før de er klare til infiltrated 4 uker gamle.
Merk: Plantevekst kan variere avhengig av vekst tilstand over labs. Vanligvis finner vi at 4-uke-gamle N. benthamiana planter bærer rundt seks blader.
- Forberedelse for A. thaliana transgene planter
- Se Tabellen for materiale og bestille transgene Arabidopsis frø.
- Nyt ~ 50-100 transgene Arabidopsis frø i 1 mL destillert vann og lagre dem på 4 ° C for 3 dager i mørket synkronisere utbruddet av spiring.
- Så ~ 2-3 frø på overflaten av en plug anlegget brett og dekke skuffen med en plast kuppel. Tillate frø til germinate ved 23 ° C, 60% fukt med en 10/14-h lys/mørke fotoperiode syklus.
Merk: Frøene bør være homozygotes. Vi anbefaler imidlertid hadde tilstedeværelsen av transgene i bunken. I dette tilfellet sterilisere frøene ved å vaske med 70% etanol i 2 minutter, 50% blekemiddel (ca 2% hypokloritt) som inneholder 0,05% triton X-100 for 5 min. følge ved Vask 5 - 6 ganger med sterilt dobbel destillert vann (ddH2O). Etter sterilisering, stratify på 4 ° C for 3 dager og plate dem på anlegget spiring mediet som inneholder 25 µg/L hygromycin B velge transgene planter. - Etter en uke, la bare én plante per plugg og fortsatt voksende planter vekst oppstiller brukes for trinn 1.2.3.
Merk: Fire-uke-gamle planter ble brukt for P. syringae infeksjon. Vann planter hver dag å oppbevare planter rask.
2. forberedelse Pseudomonas kultur (~ 1 uke)
- Byggingen av plasmider for Pseudomonas transformasjon
- Se Tabellen for materiale og Bestill det ønskede vector(s) av T3SS-baserte effektor leveringssystem vektor25.
- Inn effektor levering vektoren bruker områdespesifikke rekombinasjon kloning25effektor genet av interesse.
Merk: Når du overvåker subcellular lokalisering av full lengde effektor protein, sette full lengde genet til pBK-GW-1-2 eller pBG-GW-1-2. Det er også mulig å velge pBK-GW-1-4 eller pBG-GW-1-4 med 2 x sfGFP11 for økt fluorescens signal. Ved en delvis effektor mangler signal peptid, bruk pBK-GW-2-2 eller pBK-GW-2-4. Se Park et al. for detaljert informasjon om effektor levering vektorer25.
- Transformere plasmider bærer en effektor smeltet i sfGFP11 koden til P. syringae pv. Tomat (Pst) CUCPB5500 bruker standard electroporation29.
Merk: Andre Pseudomonas stammer kan brukes om nødvendig. SfGFP11 tag systemet er konstruert for en rekke vektorer30 og genuttrykk av effektor er regulert av AvrRpm1 selskapet, som er sammenlignbare med, f.eks Pseudomonas fluorescens (EthAn)31. - Spre transformert bakterieceller forsiktig over overflaten av kongens B agar plater som inneholder 100 µg/mL og og 25 µg/mL kanamycin eller 25 µg/mL gentamycin. Ruge på 28 ° C i 2 dager.
- Vaksinere one koloni i kongens B flytende media med antibiotika passer for vektor brukes, og vokser cellene overnatting på 28 ° C med skjelvende på 200 rpm.
- Gjøre en glyserol lager. Legge til autoklaveres glyserol en siste konsentrasjon av 50% og butikk på-80 ° C.
3. forbigående uttrykk for Organelle målrettede sfGFP1-10OPT i N. benthamiana (4 dager)
- Utarbeidelse av Agrobacterium kultur
- Bestill det ønskede vector(s) av organelle målrettede sfGFP1-10OPT plasmid(s) (se Tabell for materiale).
- Forvandle plasmid(s) Agrobacterium tumefaciens belastning GV3101 celler32. Vokse cellene på Luria-Bertani (LB) agar medium supplert med 50 µg/mL kanamycin og 50 µg/mL og på 28 ° C i 2 dager.
- Fra en enkelt koloni på LB agar mediet, vaksinere cellene i 5 mL væske LB medier supplert med 50 µg/mL kanamycin og 50 µg/mL og. Vokse cellene overnatting på 28 ° C med skjelvende på 200 rpm.
- Harvest cellene med sentrifugering 3000 x g for 10 min. hell av supernatant media og resuspend pellet i 1 mL av ferske laget infiltrasjon buffer.
- Måle antall Agrobacterium ved å skaffe optisk tetthet (OD) verdien en absorbansen 600 nm (Abs 600 nm). Justere OD600 av bakterier til 0,5 med infiltrasjon buffer.
Note 1 mL av suspensjon er nok til å infiltrere på to steder. - La kulturen ved romtemperatur på en mild rocker for 1-5 h før infiltrasjon.
- Stikk et hull i midten av bladene infiltrated med 10 µL tips. Bruk 1-mL needleless montering for å infiltrere Agrobacterium suspensjoner. Sakte og forsiktig injisere rundt 500 µL av suspensjoner forberedt fra trinn 3.1.5 inn i blad adaxial siden via sprøyten. Gjenta infiltrasjon på minst tre ulike anlegg for eksperimentell gjentak.
Merk: Helse- og sikkerhetsgrunner, vernebriller bør brukes under infiltrasjon. - Tørk av gjenværende bakteriell suspensjon på bladene og merke grensen av regionen infiltrere.
- Holde infiltrere plantene vekst oppstiller brukes for trinn 1.1.1 for 2 dager.
4. vaksinasjon av Pseudomonas (4 dager)
- Strek transformert Pseudomonas belastningen fra glyserol lager i trinn 2.5 på kongens B agar media med aktuelle antibiotika på 28 ° C i 2 dager.
Merk: Helse Pseudomonas er svært kritisk. Hvis koloniene ikke form Vel, strek cellene igjen eller overføre cellene i kongens flytende media før du fortsetter. - Vaksinere en loopful Pseudomonas celleområde i Mannitol-glutamat (MG) flytende medier på 28 ° C med skjelvende på 200 rpm for overnatting.
- Harvest cellene med sentrifugering 3000 x g for 10 min. hell av supernatant media, resuspend pellet i 10 mM MgCl2og justere OD600 til 0,02 (1 x 107 cfu/mL) for N. benthamiana blader og 0,002 (1 x 106 CFU/mL) for Arabidopsis forlater.
- For N. benthamiana, infiltrere Pseudomonas suspensjon inn i området av bladene der Agrobacterium bærer sfGFP1-10OPT konstruere var infiltrert 2 dager tidligere (som i trinn 3.1.7). For den sfGFP1-10OPT transgene Arabidopsis, infiltrere Pseudomonas suspensjon to 4-uke-gamle kort dag dyrket blader.
Merk: minst tre planter er nødvendig for eksperimentell gjentak.
5. observasjon av sfGFP Signal via AC Confocal mikroskopi (1 dag)
- Kuttet ut blad platen fra Pseudomonas-inokulert blader. På bestemte tidspunkt etter infiltrasjon av Pseudomonas, image to 2 cm2 blad plater fra eneste anlegget bruker en laser skanning AC confocal systemet med 40 X / 1.2 NA C-Apochromat vann nedsenking målet eller 63 X / 0,8 NA C-Apochromat oljeneddyp mål. For å unngå døde celler drept av såret, observere cellene fra infiltrasjon hullet.
- Starte observasjon på en strømsparingsmodus innstilling av 488-nm argon laser. Øke laser makt til å oppdage sfGFP.
Merk: Vi vanligvis bruker 2-15% av laser intensiteten for å gjenkjenne fluorescens. Men skal den laser makt og gjenkjenning innstillingen justeres basert på brukerens mikroskopi system. Her ble utslippet filtrene satt til 520-550 nm. De døde cellene avgir ofte auto-fluorescens under 488-nm laser magnetisering. Derfor, som en negativ kontroll, skal samme effektor uten sfGFP11 koden infiltrert og observert oppstiller observasjon. I tillegg kan høy laser eksitasjon indusere klorofyll autofluorescence. Derfor justere laser intensiteten bruker kontroll anlegget celler for ikke for å indusere klorofyll autofluorescence.- For en counterstaining av cellen vegg, infiltrere 20 mM propidium iodide (PI) blad platen på 5-10 min før observasjon.
- For kjernen flekker, dykke blad platene i 0,1% paraformaldehyde for 5 min etterfulgt av vaske med vann. Deretter infiltrere den 10 mM PI i blad platen på 5-10 min før mikroskopiske observasjon. Gjenta eksperimenter minst tre ganger.
Merk: Dette trinnet er ikke kritisk, men nyttig å definere effektor lokalisering i plasma membranen eller kjernen. Hvis effektor rundt viste deres lokalisering i en bestemt organeller, kan du bruke en markør for den gitte organelle for å bekrefte lokalisering av effektor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Β fat oppbygning GFP består av elleve β tråder og kan deles inn i to fragmenter, 1-10th strand (GFP1-10OPT) og den 11th (GFP11)-stranden. Selv om ingen av to fragmenter fluorescerende selv, kan selv montert sfGFP avgir fluorescensen når to fragmenter finnes i nærheten (figur 1A). I dette systemet, sfGFP1-10OPT-uttrykke Arabidopsis eller N. benthamiana planter er inokulert med Pseudomonas bærer en sfGFP11 merket effektor. SfGFP11 merket effektor levert av Pseudomonas i stoffer vert cellen er rekonstruert til sfGFP1-10OPT i stoffer og deretter translocate sammen i målet batterirommet (figur 1B). Figur 2 representerer generelle fremgangsmåten fra utarbeidelse av plantemateriale og Pst til deteksjon av fluorescens signalet i anlegget celle.
Som et eksempel på vår metode brukte vi P. syringae effektor protein, AvrB, som er levert inn i verten anlegget celler grundig i T3SS under infeksjon. I Arabidopsis, er AvrB anerkjent av en tilsvarende motstand protein, RPM1 og utløser immunreaksjoner inkludert overfølsom celle død33. I den tidligere studien avdekket GFP reporter analysen og biokjemiske analysen at AvrB og RPM1 er lokalisert i plasma membranen av anlegget celle33,34,35. For å undersøke lokaliseringen av AvrB ved hjelp av vår metode, ble Agrobacterium skjuler CYTO sfGFP1-10OPT genet infiltrert i N. benthamiana. I to dager, AvrB-sfGFP11-forvandlet Pseudomonas celler ble inokulert i Agrobacterium-infiltrerte området. Supplert sfGFP fluorescens signaler ble observert i Pst -CUCPB5500 som inneholder AvrB-sfGFP11 på plasma membranen (figur 3B). Derimot ble ingen signaler funnet i infiserte cellen av Pst bærer innfødt AvrB (figur 3A).
Figur 1. Optimalisert delt GFP systemet. (A) β fat strukturen til GFP er laget av elleve β-tråder og kan deles inn i 1-10th β-stranden (GFP1-10) og den 11th β-stranden (GFP11). (B) i denne metoden, sfGFP1-10OPT fragmenter ble uttrykt i anlegget celler, mens den sfGFP11 stranden var smeltet til AvrB og forvandlet Pseudomonas. Bare planter celle infisert av Pseudomonas inneholder sfGFP11 vises sfGFP fluorescens (der effektor regionaliserer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Oversikt over prosedyren. Av transgene Arabidopsis eller sfGFP1-10OPT-infiltrert N. benthamiana anlegget er infisert med Pst CUCPB5500 bærer en sfGFP11-merket effektor gjennom sprøyte infiltrasjon. Fluorescens av den sammensatte sfGFP kan registreres via en AC confocal mikroskopi system på stedet av effektor lokalisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. AvrB-sfGFP gjenkjenning på N. benthamiana forlater 3t etter smitte. Pst CUCPB5500 skjuler en sfGFP11-merket AvrB genet ble infiltrere på den 5th eller 6th blad av N. benthamiana, som var infiltrert av Agrobacterium bærer sfGFP1-10OPT 2 dager tidligere. Cellen vegg var farget av propidium iodide. Mens celler som uttrykker sfGFP1-10 OPT med AvrB bare viser ikke alle fluorescens signal (A). GFP signaler (gul pil) ble observert på de infiserte cellene av Pst som inneholder AvrB-sfGFP11 gene på 3t etter infiltrasjon (B). Dette resultatet representerer at bare AvrB-sfGFP11, ikke AvrB, er rekonstruert med sfGFP1-10OPT på stoffer og deretter den sammensatte sfGFP er translocated til plasma membranen. Magenta pseudo fargen representerer cellen vegg og klorofyll autofluorescence. Green representerer den sammensatte sfGFP fluorescensen. Skalere barer = 40 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrives her brukes for overvåking av nøyaktig lokalisering av effektor proteiner injiseres av bakteriell T3SS verten anlegget celle på infeksjon. Tidligere delt GFP systemet ble brukt som et verktøy til å studere subcellular lokalisering av pattedyr proteiner23,36, Salmonella T3E lokalisering, og Agrobacterium VirE2 levering gjennom T4SS i den Plant celler37. Hvis du vil bruke dette systemet i anlegget celler, brukt tidligere studier en transgene mais plante som constitutively uttrykker de cytoplasmatiske GFP1-10 og transgene sopp, Ustilago maydis, som uttrykker GFP11-merket effektor protein. Imidlertid har mais -U. maydis systemet ikke vært vellykket fordi uttrykk nivåene av translocated effektor proteiner var svake og høy bakgrunn autofluorescence forhindret påvisning av rekonstituert GFP signal38. For å bøte på dette problemet, vi brukte en sfGFP1-10 variant, sfGFP1-10OPT, som forbedrer løselighet og fluorescens intensitet21,22.
Til tross for fordelene med delt sfGFP systemet finnes det noen begrensninger til studiet av effektor lokalisering og dynamikk. Først er observert rekonstituert sfGFP fluorescerende signalet relativt svak. Dette kan skyldes en liten mengde effektor molekyler leveres direkte fra P. syringae. Svake signalet kan forbedres ved hjelp av multimerizing sfGFP11 koden. Vektorer med 2 x sfGFP11 koden er også tilgjengelig fra kildene som er oppført i Tabellen for materiale. Andre kunne cytosolic sfGFP1-10 OPT rekonstitueres med sfGFP11 rettet mot Golgi og ER plastid25. Co uttrykk for mitokondrier målrettede sfGFP11 og cytosolic sfGFP1-10OPT resulterte i mislocalization av nytt utgjorde sfGFP stoffer og kjernen25. Derfor bør lokalisering av effektor av interesse re valideres ved å bruke de riktige organelle målrettede sfGFP1-10OPT. Når alle GFP signal ikke oppdages i infiserte celler uttrykke cytosolic sfGFP1-10OPT, anbefaler vi å bruke N. benth uttrykke Golgi, ER, og plastid rettet sfGFP1-10OPT eller bruke den tilsvarende organelle målrettet sfGFP1-10OPT transgene Arabidopsis25.
Denne metoden viste bruk av delt fluorescerende protein systemet som et nyttig verktøy for å undersøke timelige og romlig dynamikken i effektor vert planter25. Fremtidig forskning vil fokusere på fremskritt i enkelt-molekylet bildebehandling, som kan aktivere detaljerte studier av dynamikken i plasma membranen lokalisert effektor. Videre kan en sekresjon analysen med en bakteriell system være nyttig alternativ å studere lokalisering av sopp effektor; det hindrer aggregering av effektor og høy autofluorescence på webområdet fungal penetrasjon.
Det bør bemerkes at det er noen viktige punkter i denne metoden. For det første, både plantemateriale og bakterier skal være sunn og frisk. For å sikre visualisering av effektor, bør både sfGFP1-10OPT fra planter og sfGFP11 fra Pseudomonas sterkt uttrykkes. Derfor er det viktig å dyrke planter under optimale forhold og beskytte dem fra miljømessige stressorer, som skadedyr. Vi anbefaler også at alle bakterier brukes for infiltrasjon tas fra 2 dag dyrket celler på agar plater og ikke fra glyserol aksjer. Dernest ved forbigående uttrykk i N. benthamiana, kan hvor lenge kreves for modning av organelle målrettede sfGFP1-10OPT variere for hver organelle markør protein. For eksempel krever modning av PM-sfGFP1-10OPT mer enn 48 timer etter infiltrasjon. Til slutt, tidspunktet og uttrykk nivåene av rekonstituert sfGFP signaler avhenger av effektor proteiner som kreves for å optimalisere noen eksperimentelle forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av grunnleggende Science Research Program gjennom National Research Foundation av Korea (NRF) av departementet for vitenskap, IKT og fremtidig planlegging (NRF-2018R1A2A1A05019892) til DC og av et stipend fra anlegget molekylær formering Senter ( PMBC) av programmet neste generasjon Biogreen 21 av Rural Development administrasjon (PJ013201) til EP. Vi takker tenkelig midten av National instrumentering Center for miljøledelse å gi AC confocal mikroskop filmingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidopsis transgenic lines | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
| NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
| PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
| Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
| NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
| PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
| ER-sfCherry1-10 | Addgene | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
| CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
| sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| Bacterial strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml) | ||
| Media components | |||
| Plant germination media | Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve. | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | Store at 4 °C. |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| LB media | Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed. | ||
| Tryptone | BD Bioscience | 211705 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| NaCl | Duchefa Biochemie | S0520 | |
| Micro agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
| King's B media | 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed. | ||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 212120 | |
| Anhydrous K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
| Glycerol | Duchefa Biochemie | G1345 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
| Mannitol-Glutamate (MG) liquid media | Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7 | ||
| Mannitol | Duchefa Biochemie | M0803 | |
| L-glutamic acid | Duchefa Biochemie | G0707 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
| Infiltration buffer | 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use. | ||
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize. |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Prepare 100 mM stock in water. Autoclave. |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM stock in DMSO. |
| Confocal microscope equipments/materials | |||
| 710 laser scanning confocal system | Carl Zeiss | ||
| Axio observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| Propidium iodide | ThermoFisher | P1304MP |
References
- Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).
- Buttner, D. Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells. FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 4 (2013).
- Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants. J Bacteriol. 180 (17), 4523-4531 (1998).
- Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Semin Cell Dev Biol. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).
- Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants. Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).
- Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
- Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiol. 122 (4), 999-1001 (2000).
- Courbot, M., et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol. 144 (2), 1052-1065 (2007).
- Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
- Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function. J Biol Chem. 278 (16), 14196-14202 (2003).
- Reinicke, A. T., et al. A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery. J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).
- Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization. Cell. 137 (2), 283-294 (2009).
- Fernandez-Alvarez, A., et al. Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis. PLoS Pathog. 8 (3), e1002563 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, Á Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52 (1), 59 (2008).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).
- Cabantous, S., et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association. Sci Rep. 3, 2854 (2013).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nat Commun. 7, 11046 (2016).
- Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors. Nat Methods. 7 (4), 325-330 (2010).
- Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017).
- Addgene. , Available from: https://www.addgene.org (2018).
- Arabidopsis Biological Resource Center. , Available from: https://abrc.osu.edu (2018).
- Kvitko, B. H., et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4), e1000388 (2009).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Kovach, M. E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Upadhyaya, N. M., et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat. Mol Plant Microbe Interact. 27 (3), 255-264 (2014).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc. 2006 (7), (2006).
- Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).
- Nimchuk, Z., et al. Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae. Cell. 101 (4), 353-363 (2000).
- Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
- Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells. Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).
- Tanaka, S., et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).
