Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Зеленый флуоресцирующий белок Сплит система для визуализации эффекторов доставлены из бактерий во время инфекции

doi: 10.3791/57719 Published: May 24, 2018

Summary

Флуоресцентный белок подходы к контролировать эффекторы, выделяемая бактериями в клетки хозяина сложной. Это из-за несовместимости между флуоресцентных белков и секреторной системой типа III. Здесь оптимизированный Сплит системы superfolder GFP используется для визуализации эффекторы, выделяемая бактериями в принимающей растительной клетки.

Abstract

Бактерии, один из самых важных возбудителей различных заболеваний растений, выделяют набор эффекторных белков в принимающей растительной клетки для подрыва иммунной системы растений. Во время инфекции цитоплазматических эффекторы, доставляются в цитозоле хоста через тип III секреторной системы (T3SS). После доставки в растительной клетке effector(s) цели конкретных отделении(ях) чтобы модулировать принимающей клеточных процессов для выживания и репликации возбудителя. Хотя там были некоторые исследования на субклеточном локализации эффекторных белков в клетки хозяина, чтобы понять их функции в патогенности с помощью флуоресцентных белков, исследование динамики эффекторы, непосредственно впрыскивается от бактерий была сложной из-за несовместимости между T3SS и флуоресцентных белков.

Здесь мы описываем наши последние метод оптимизированный Сплит системы Зеленый флуоресцирующий белок superfolder (sfGFPОПТ) для визуализации локализации эффекторы, доставлено через бактериальный T3SS в клетки-хозяина. SfGFP11 (11й β-стренги sfGFP)-тегами эффекторных выделяется через T3SS может быть собран с определенных органелл целевых sfGFP1-10ОПТ (1-10й β-стренги sfGFP) ведущий флуоресценции выбросов на сайте. Этот протокол предусматривает процедуру для визуализации сигнала флуоресценции восстановленный sfGFP с эффекторных белков от псевдомонас в частности органелл в растениях Arabidopsis и Nicotiana benthamiana .

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Растения являются сессильных организмов, которые сталкиваются многочисленные вторжения патогенных организмов, включая бактерии, грибки, вирусы, насекомых и нематод на протяжении всего их жизненного цикла. Среди фитопатогенов, грамотрицательных бактериальных патогенов, таких как Pseudomonas spp. и Ralstonia spp., заразить их растений-хозяев, введя через раны или естественных отверстий, например устьиц и Гидатоды1. Успешно колонизировать растений-хозяев, бактериальных патогенов эволюционировали, чтобы разработать целый ряд факторов вирулентности2. Когда бактерии вторгнуться растения-хозяина, они впрыскивают ряда белков вирулентности — известный как эффекторов — непосредственно в клетки растений для содействия их патогенности. Эти эффекторы подавить или модулировать врожденного иммунитета растений и манипулировать принимающей клеточных процессов приведет к бактериальной выживания3.

Патогенных бактерий в основном используют T3SS для доставки эффекторные белки прямо в принимающей ячейки4. T3SS напоминает молекулярной шприц с иглы канал, соединяющий из структуры белка лески через внутренний и наружный бактериальной мембраны для укола принимающей ячейки5. Этот механизм секрецию эффекторные опосредовано T3SS (T3E) хорошо сохраняется в различных грамотрицательных бактериальных патогенов завода, а также человека. Один представитель завода патогенов, P. syringae pv. Помидор DC3000 ККПЧ мутант, который обычно имеет дефектных T3SS, ограничил рост растений, вероятно, из-за неспособности Этот мутант полностью подавить завод иммунитета (путем инъекций эффекторные белки)6. После транслокации в клетки хозяина эффекторов цели различных принимающих белков, которые имеют важное значение для ячейки системы, включая завод обороны ответы, транскрипции гена, смерть клетки, протеасомы, везикул людьми и гормон пути7 , 8 , 9 , 10. Таким образом, отслеживание клеточной локализации эффекторных белков в клетках хост является привлекательной мишенью для понимания их функций в отношении модуляции иммунитета растений.

Большинство исследований локализации T3Es использовали Agrobacterium -опосредованной гиперэкспрессия с большой флуоресценции белков в принимающей завод9. Однако чтобы быть неправильно локализованных или иногда нефункциональных в11,12,13было показано метод гетерологичных выражение генов, которые внедряются в других видов. Кроме того несколько исследований показали, что бактериальных эффекторов пройти модификация для правильной ориентации в принимающей клетки14,,1516,17. Таким образом временно выразил эффекторов в цитозоль клетки не могут быть количественно или функционально идентичен эффекторы, которые поставляются T3SS на возбудителя инфекции18завода. Кроме того слияние больших флуоресцентные метки эффекторные белки могут нарушить надлежащее эффекторных доставки и визуализация18,19. Таким образом эти подходы к assay T3E функция не может в полной мере отражает родной локализация T3SS-выделяется эффекторов.

Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) состоит из 11-мель β-ствол, включающего центральной стренге, которая включает хромофора20. Вальдо и др. сообщил Роман Сплит GFP система, которая состоит из небольшого компонента (GFP β нити 11; GFP11) и большой дополнительный фрагмент (GFP β прядь 1-10; GFP1-10)21. Фрагменты не флуоресцировать сами по себе, но флуоресцировать после их самостоятельной ассоциацией, когда обоих фрагментов находятся в непосредственной близости друг с другом. Для оптимизации эффективности складные белок надежные Складные варианты GFP, т.е., sfGFP и sfGFPОПТ, впоследствии были разработаны для Сплит GFP системы20,21,22. Недавно один аминокислотный мутировал варианты sfGFP1-10ОПТ- sfYFP1-10ОПТ и sfCFP1-10ОПТ- который можно восстановить с sfGFP11 фрагмент и показать желтый и голубой флуоресценцией, соответственно, были созданные23 . Кроме того, sfCherry, производное mCherry, могут быть разделены на фрагменты sfCherry1-10 и sfCherry11 так же, как sfGFP23.

Эта система была адаптирована для метки и отслеживания эффекторов T3SS в клетки HeLa во время инфекции, используя эффекторов сальмонеллы24. Однако он был ранее не оптимизирован для системы завод бактериальных патогенов. Недавно мы оптимизировали GFP Сплит системы, основанные на улучшение sfGFP1-10ОПТ для мониторинга субцеллюлярные локализации T3Es, доставленных из P. syringae в клетки растений25. Для облегчения локализации исследования T3Es в различных внутриклеточных отсеков в клетках растений, набор трансгенных Arabidopsis thaliana растения были созданы выразить sfGFP1-10ОПТ в различных отсеках внутриклеточных 25. Кроме того, плазмиды, перевозящих различные органеллы ориентированных sfGFP1-10ОПТ за Agrobacterium-опосредованной переходных гиперэкспрессия и sfGFP11-тегами векторов для доставки на основе T3SS эффектор были также созданы. Семена различных трансгенных линий Arabidopsis и плазмид выразить T3Es интерес может быть получены из источников, упомянутых в Таблице материалов26,27.

В следующий протокол мы описываем оптимизированные системы для мониторинга динамики эффекторы, поставляемые бактерий в клетки хозяина, с помощью Сплит системы sfGFP. Заражение растений, выражаяОПТ sfGFP1-10 с трансгенных Pseudomonas , перевозящих sfGFP11 рекомбинантных плазмид приводит поставка sfGFP11-тегами эффекторных от Pseudomonas в клетки-хозяина. Следовательно эти белки являются восстановленный и перемещать отделении(ях) целевых конкретных эффекторные. Псевдомонас сиреневый pv. помидор Штамм CUCPB5500, в котором удаляются 18 эффекторы, был использован потому что этот штамм показал низкий или не смерть клетки в s A. thaliana и н. benthamiana28. Однако все материалы и шаги, описанные здесь можно заменить или изменить адаптировать Сплит системы sfGFP для расследования других биологических вопросов или оптимизации в условиях данной лаборатории.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Примечание: Все шаги выполняются при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Подготовка растительных материалов (4 недели)

  1. Подготовка для растений, н. benthamiana
    1. 2 семена N. benthamiana на поверхности почвы каждого банка, накрыть лоток с пластиковый купол и семена прорастают в 25 ° C, влажность 60% роста камеры с циклом 16/8-h свет/темно фотопериода.
    2. После двух недель подобрать и отбросить маленький саженец в каждом банке и продолжают расти растения на тех же условиях роста, применяемых для прорастания в шаге 1.1.1. Добавите 1 Л воды на лоток каждые два дня.
      Примечание: Условия роста для растений может различаться между лабораториями. Поэтому следуйте регулярного полива протокол расти завод в здоровом состоянии.
    3. В неделю передать новый лоток растения и расположить их с достаточное пространство для дальнейшего роста. Держите выращивания растений в условиях, описанных в шаге 1.1.1 до тех пор, пока они готовы быть проникли в возрасте 4 недель.
      Примечание: Рост растений могут отличаться в зависимости от состояния роста всей лаборатории. Обычно, мы находим, что 4-недельных растений N. benthamiana Медведь около шести листьев.
  2. Подготовка трансгенные растения A. thaliana
    1. Обратитесь к Таблице материалов и заказать трансгенных семян арабидопсиса .
    2. Замочите семена трансгенной Arabidopsis ~ 50-100 в 1 мл дистиллированной воды и хранить их на 4 ° C на 3 дня в темноте, чтобы синхронизировать начала прорастания.
    3. Сеять семена ~ 2-3 на поверхности почвы лотка завод вилки и охватывают лоток с пластиковый купол. Разрешить семена прорастают при 23 ° C, влажность 60% с 10/14-h свет/темно фотопериода циклом.
      Примечание: Семена должны быть рецессивной. Однако мы рекомендуем, подтверждая наличие трансген в пакете. В этом случае стерилизовать семена путем промывания с 70% этанола за 2 мин, 50% отбеливатель (около 2% гипохлорита) содержит 0,05% Тритон X-100 для 5 минут следовать путем промывания 5 - 6 раз с двойной стерильной дистиллированной водой (ddH2O). После стерилизации стратифицировать при температуре 4 ° C в течение 3 дней и пластины их на завод всхожесть носителя, содержащего 25 мкг/Л hygromycin B для выбора трансгенных растений.
    4. После недели оставить только один завод за вилку и продолжать расти растения на тех же условиях роста для шага 1.2.3.
      Примечание: Четыре недельных растений были использованы для P. syringae инфекции. Вода растений каждый день, чтобы сохранить здоровые растения.

2. Подготовка Pseudomonas культуры (~ 1 неделя)

  1. Строительство плазмиду для Pseudomonas преобразования
    1. Обратитесь к Таблице материалов и заказать желаемый vector(s) на основе T3SS эффекторные системы доставки векторных25.
    2. Вставьте эффекторных гена интереса в эффекторных доставки вектора с использованием конкретных рекомбинации клонирования25.
      Примечание: При мониторинге субцеллюлярные локализации полнометражного эффекторных белков, положите полнометражного гена в ПБК GW-1-2 или pBG-GW-1-2. Это также можно выбрать pBK-GW-1-4 или pBG-GW-1-4, содержащий 2 x sfGFP11 для увеличения флуоресценции сигнала. В случае частичного эффекторных отсутствует сигнал пептид используйте pBK-GW-2-2 или pBK-GW-2-4. Обратитесь к et al. парк для подробной информации о эффекторных доставки векторов25.
  2. Преобразование плазмида, перевозящих эффекторных сливается с sfGFP11 тегов для P. syringae pv. Помидор (Pst) CUCPB5500 с помощью стандартных электропорации29.
    Примечание: Другие штаммов Pseudomonas может использоваться при необходимости. Построена система тегов sfGFP11 для широкого круга векторов30 и выражение гена эффекторные регулируется AvrRpm1 промоутер, которая сопоставима с, например, Pseudomonas fluorescens (Этан)31.
  3. Распространение преобразованные бактериальной клетки мягко на поверхности плиты агара B короля, содержащие 100 мкг/мл рифампицин и канамицин 25 мкг/мл или 25 мкг/мл гентамицина. Инкубируйте на 28 ° C в течение 2 дней.
  4. Прививок одной колонии в King's B жидких сред с помощью антибиотиков для вектора используется и расти клеток на ночь на 28 ° C с встряхивания на 200 об/мин.
  5. Сделайте запас глицерина. Добавить газобетона глицерина в конечной концентрации 50% и хранить при температуре-80 ° C.

3. Переходные выражение органеллы ориентированных sfGFP1-10ОПТ в N. benthamiana (4 дня)

  1. Подготовка Agrobacterium культуры
    1. Закажите желаемый vector(s) органеллы ориентированных sfGFP1-10ОПТ plasmid(s) (см. Таблицу материалов).
    2. Преобразование plasmid(s) в Agrobacterium tumefaciens штамм GV3101 клетки32. Рост клеток на носителе агар Бертани Лурия (LB), дополнены канамицин 50 мкг/мл и 50 мкг/мл рифампицин на 28 ° C в течение 2 дней.
    3. От одной колонии на носителе агар LB прививать клетки в 5 мл жидких сред LB, дополненная канамицин 50 мкг/мл и 50 мкг/мл рифампицин. Рост клеток на ночь на 28 ° C с встряхивания на 200 об/мин.
    4. Урожай клетки центрифугированием в 3000 x g для 10 минут слить супернатанта СМИ и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл свежего сделал инфильтрации буфера.
    5. Измерить количество Agrobacterium путем получения оптической плотности (OD) значение поглощения 600 Нм (Abs 600 Нм). Отрегулируйте ОД600 бактерий до 0,5 с буфером инфильтрации.
      Примечание: 1 мл суспензии достаточно, чтобы проникнуть на два места.
    6. Оставьте культуры при комнатной температуре на нежный рокер для 1-5 ч до проникновения.
    7. Засуните отверстие в центр листья, чтобы быть проникли с 10 мкл наконечником. Используйте 1 мл шприц безыгольной проникнуть Agrobacterium суспензий. Тщательно и медленно вводить около 500 мкл суспензии, приготовленный из шага 3.1.5 в adaxial сторону листьев через шприц. Повторите проникновение на по крайней мере три различных растений для экспериментальной реплицирует.
      Примечание: По причинам охраны здоровья и безопасности, защита глаз следует носить во время проникновения.
    8. Стереть оставшиеся бактериальных подвеска на листьях и Марк границы проникли региона.
    9. Держите проникли растений при тех же условиях роста, используемый для шага 1.1.1 на 2 дня.

4. прививки Pseudomonas (4 дня)

  1. Полоска преобразованные Pseudomonas штамм от глицерина складе шаг 2,5 на короля B агар СМИ с соответствующие антибиотики на 28 ° C в течение 2 дней.
    Примечание: Очень важно здоровье Pseudomonas . Если колоний не образуют хорошо, снова полоска клеток или пропагандирующие клетки в жидких средах короля перед.
  2. Прививать loopful Pseudomonas клеток в жидких средах маннит-глютамат (мг) на 28 ° C с встряхивания на 200 об/мин для ночлега.
  3. Урожай, клетки центрифугированием в 3000 x g для 10 минут слить супернатанта СМИ, Ресуспензируйте гранулы в 10 мм MgCl2и отрегулировать ОД600 до 0,02 (1 x 107 кое/мл) для N. benthamiana листья и 0,002 (1 х 106 кое/мл) для выращивания арабидопсиса листьев.
  4. Для н. benthamianaпроникнуть Pseudomonas подвеска в области листья где Agrobacterium , перевозящих sfGFP1-10ОПТ конструкции было проникли 2 дня ранее (как в шаге 3.1.7). Для sfGFP1-10ОПТ трансгенных Arabidopsisпроникнуть в листья короткий день выросли две 4-недельных Pseudomonas подвеска.
    Примечание: по крайней мере три растения необходимы для экспериментальных реплицирует.

5. наблюдение за sfGFP сигнала через Confocal микроскопии (1 день)

  1. Вырезать лист диска от синегнойной-прививку листья. В точках в определенное время после проникновения Pseudomonas, изображение двух 2-cm2 лист дисков из одного растения, с помощью лазерного сканирования конфокальный системы с 40 X / 1.2 NA C-Апохромат цель погружения в воды или 63 X / 0,8 погружения нефти NA C-Апохромат Цель. Чтобы избежать мертвых клеток, убиты, ранены, наблюдать ячеек от проникновения отверстие.
  2. Запуск наблюдения в условиях низкой мощности 488 нм Аргонового лазера. Увеличьте мощность лазера для обнаружения sfGFP.
    Примечание: Обычно мы используем 2-15% от интенсивности лазерного обнаружения сигнала флуоресценции. Однако мощность лазера и параметр обнаружение следует скорректировать основаны на системе пользователя микроскопии. Здесь фильтры выбросов были установлены до 520-550 Нм. Мертвые клетки часто выделяют auto флуоресценции под 488 нм лазер возбуждения. Поэтому, как отрицательный контроль же эффекторных без sfGFP11 тег следует проникли и наблюдается в тех же условиях наблюдения. Кроме того высокие лазерного возбуждения может вызвать аутофлюоресценция хлорофилла. Таким образом регулировать интенсивность лазера, с помощью элемента управления растительных клеток так, чтобы не вызвать хлорофилл аутофлюоресценция.
    1. Для counterstaining клеточной стенки, проникнуть 20 мм пропидий йодидом (PI) в конечный диск на 5-10 мин до наблюдения.
    2. Для окрашивания ядра погружаться конечные диски в 0,1% параформальдегида 5 минут с последующей промывкой водой. Затем проникнуть на 10 мм PI в конечный диск на 5-10 мин до микроскопические наблюдения. Повторите эксперименты по крайней мере три раза.
      Примечание: Этот шаг не является критической, но полезно для определения локализации эффекторных на плазматической мембраны или ядра. Если эффекторов интерес показали их локализация в определенных органелл, используйте маркер для данного органеллы для подтверждения локализации эффекторные.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Β-баррель структура GFP состоит из одиннадцати β пряди и можно разделить на два фрагмента, стренгий 1-10 (ОПТGFP1-10) и стренги 11й (GFP11). Хотя ни один из двух фрагментов флуоресцентные сами, собственн-собранные sfGFP может излучать флюоресценция, когда в непосредственной близости (рис. 1A) существуют два фрагмента. В этой системе, sfGFP1-10ОПТ-выражая Arabidopsis или N. benthamiana растения привиты с Pseudomonas , перевозящих эффекторных sfGFP11 меткой. Меткой sfGFP11 эффектор, поставляемые Pseudomonas в цитозоль клетки-хозяина воссоздается на sfGFP1-10ОПТ в цитозоле и затем вместе перемещают в целевой отсек (рис. 1B). Рисунок 2 представляет общую процедуру, от подготовки растительных материалов и Pst для обнаружения сигнала флуоресценции в растительной клетке.

В качестве примера нашего метода мы использовали P. syringae эффекторных белков, AvrB, который доставляется в клетки растений принимающей тщательное T3SS во время инфекции. В проростках ArabidopsisAvrB признается соответствующее сопротивление белка, RPM1 и триггеров иммунного ответа, включая сверхчувствительным клеток смерть33. В предыдущем исследовании assay репортера GFP и биохимические исследования показали, что AvrB и RPM1 локализованы в мембране плазмы растений клетки33,34,35. Для изучения локализации AvrB, используя наш метод, Agrobacterium укрывательство Цито sfGFP1-10ОПТ гена было проникли в н. benthamiana. В течение двух дней, AvrB-sfGFP11-трансформированных Pseudomonas клетки были привиты в Agrobacterium-проникли региона. Дополняться sfGFP флуоресценции сигналы были замечены в Pst CUCPB5500 содержит AvrB-sfGFP11 на плазматической мембраны (рис. 3B). В отличие от этого сигналы не были найдены в инфицированной клетки Pst перевозящих родной AvrB (рис. 3A).

Figure 1
Рисунок 1. Оптимизированный Сплит система GFP. (A) β-баррель структура GFP состоит из одиннадцати β-нитей и может быть разделен на 1-10й β-стренги (GFP1-10) и 11й β-strand (GFP11). (B) в этом методе, sfGFP1-10ОПТ фрагменты были выражены в клетках растений, в то время как стренги sfGFP11 сливается с AvrB и превращается в Pseudomonas. Только растения клеток, инфицированных Pseudomonas , содержащие sfGFP11 покажет флуоресценции sfGFP (где локализуется эффекторные). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Обзор процедуры. Трансгенные Arabidopsis или sfGFP1-10ОПТ-проникли N. benthamiana растения заражены Pst CUCPB5500 проведение sfGFP11-тегами эффекторных через шприц инфильтрации. Флуоресценции собрал sfGFP могут быть обнаружены через систему конфокальная микроскопия на сайте эффекторных локализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
На рисунке 3. AvrB-sfGFP обнаружения на н. benthamiana листья 3 ч после инфекции. Pst CUCPB5500 укрывательство, ген AvrB sfGFP11-тегами было проникли на 5-й или 6й лист н. benthamiana, который был проникли Agrobacterium перевозящих sfGFP1-10ОПТ 2 дня ранее. Клеточная стенка была запятнана пропидий йодидом. То время как клетки, выражая ОПТ sfGFP1-10 с AvrB только не показывать любой флуоресценции сигнала (A). GFP сигналов (желтая стрелка) наблюдались в инфицированных клетках, Pst , содержащего ген AvrB-sfGFP11 на 3 ч после проникновения (B). Этот результат представляет, что только AvrB-sfGFP11, не AvrB, воссоздается с sfGFP1-10ОПТ в цитозоле, и затем собрал sfGFP перемещен к плазматической мембраны. Псевдо-пурпурный цвет представляет клеточной стенки и аутофлюоресценция хлорофилла. Зеленый представляет флуоресценции собрал sfGFP. Масштаб баров = 40 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Протокол, описанные здесь используется для мониторинга точной локализации эффекторных белков, вводят бактериальный T3SS в принимающей растительной клетки после инфекции. Ранее, Сплит системы GFP был использован как инструмент для изучения субцеллюлярные локализация млекопитающих белки23,36, сальмонеллы T3E локализации и Agrobacterium VirE2 доставки через T4SS в завод клетки37. Для применения этой системы в клетках растений, предыдущие исследования использовали трансгенных кукурузы растение, которое конститутивно выражает цитоплазматических GFP1-10 и трансгенных грибов, пузырчатая maydis, который выражает GFP11-тегами эффекторных белков. Однако системаU. maydis кукурузы - не успешно потому, что уровни выражения арестовано эффекторных белков были слабы, и высокий уровень фона аутофлюоресценция затрудняют обнаружение восстановленного сигнала GFP38. Чтобы устранить эту проблему, мы использовали sfGFP1-10 вариант, sfGFP1-10ОПТ, что значительно повышает растворимость и флуоресценции интенсивности21,22.

Несмотря на преимущества Сплит системы sfGFP существуют некоторые ограничения для изучения эффекторных локализации и динамики. Во-первых наблюдаемых восстановленный sfGFP флуоресцентного сигнала является относительно слабой. Это может быть вызвано небольшое количество эффекторных молекул доставлены непосредственно из P. syringae. Этот слабый сигнал может быть улучшено с помощью тега sfGFP11 multimerizing. Векторы нося 2 x sfGFP11 тег из источников, перечисленных в Таблице материалытакже доступны. Во-вторых цитозольной sfGFP1-10 ОПТ удалось воссоздать с sfGFP11, ориентированные на Гольджи, ER и пластид25. Совместное выражение митохондрий ориентированных sfGFP11 и цитозольной sfGFP1-10ОПТ привели к mislocalization вновь созданной sfGFP в цитозоле и ядро25. Таким образом локализация эффекторных интереса должны проверяться повторно путем применения соответствующих целевых органеллы sfGFP1-10ОПТ. Когда любой GFP сигнал не обнаружен в инфицированных клетках, выражая цитозольной sfGFP1-10ОПТ, мы рекомендуем использовать N. benth выражая Гольджи, ER, и пластид целевыхOPT sfGFP1-10 или с помощью соответствующего органеллы целевых sfGFP1-10ОПТ трансгенных Arabidopsis25.

Этот метод показал использование Сплит системы флуоресцентный белок как полезный инструмент для изучения временных и пространственных динамики эффекторов в принимающих растения25. Будущие исследования будут сосредоточены на успехи в одной молекулы изображений, который может включить подробные исследования динамики плазматической мембраны локализованных эффекторов. Кроме того секрецию анализа с использованием бактериальной системы может быть полезной альтернативой для изучения локализации грибковых эффекторов; Это препятствует агрегации эффекторы и высокой аутофлюоресценция на сайте грибковых проникновения.

Следует отметить, что есть некоторые ключевые моменты в этом методе. Во-первых растительных материалов и бактерии должны быть здоровым и свежим. Для обеспечения визуализации эффекторных сигнала, должны быть сильно выражены sfGFP1-10ОПТ от растений и sfGFP11 от Pseudomonas . Таким образом важно для выращивания растений в условиях оптимального роста и защитить их от экологических стрессоров, таких как вредителей. Также рекомендуется принять все бактерии, используемые для проникновения из 2 день выращенные клетки на плиты агара и не от глицерина запасов. Во-вторых в случае переходных выражение в н. benthamiana, продолжительность времени, необходимого для созревания органеллы ориентированных sfGFP1-10ОПТ могут отличаться для каждого белка маркера органеллы. К примеру созревания PM-sfGFP1-10ОПТ требует более 48 ч после проникновения. Наконец время точкой и выражение уровни сигналов восстановленный sfGFP зависят от типа эффекторных белков, которые необходимы для оптимизации некоторых экспериментальных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано основные программы исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования (СР 2018R1A2A1A05019892) к DC и гранта от центр молекулярной селекции растений ( ВКПМ) следующего поколения Biogreen 21 программы сельского развития администрации (PJ013201) EP. Мы благодарим изображений центр национального центра инструментария для управления природопользованием для предоставления Конфокальный микроскоп для съемок.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis transgenic lines Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10 ABRC CS69831
NU-sfGFP1-10 ABRC CS69832
PT-sfGFP1-10 ABRC CS69833
MT-sfGFP1-10 ABRC CS69834
PX-sfGFP1-10 ABRC CS69835
ER-sfGFP1-10 ABRC CS69836
GO-sfGFP1-10 ABRC CS69837
PM-sfGFP1-10 ABRC CS69838
Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10 Addgene 97387
NU-sfGFP1-10 Addgene 97388
PT-sfGFP1-10 Addgene 97389
MT-sfGFP1-10 Addgene 97390
PX-sfGFP1-10 Addgene 97391
ER-sfGFP1-10 Addgene 97392
GO-sfGFP1-10 Addgene 97393
PM-sfGFP1-10 Addgene 97394
ER-sfCherry1-10 Addgene 97403
ER-sfYFP1-10 Addgene 97404
CYTO-sfCFP1-10 Addgene 97405
sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2 Addgene 98250 pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4 Addgene 98251 pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2 Addgene 98252 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4 Addgene 98253 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2 Addgene 98254 pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4 Addgene 98255 pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2 Addgene 98256 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4 Addgene 98257 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
Bacterial strains
Agrobacterium tumefaciens GV3101 Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml)
Media components
Plant germination media Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve.
Murashige & Skoog medium including vitamins Duchefa Biochemie M0222 Store at 4 °C.
Sucrose Duchefa Biochemie S0809
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
LB media Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave.  Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed.
Tryptone BD Bioscience 211705
Yeast extract BD Bioscience 212750
NaCl Duchefa Biochemie S0520
Micro agar Duchefa Biochemie M1002
King's B media 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed.
Proteose peptone BD Bioscience 212120
Anhydrous K2HPO4 Sigma-Aldrich 1551128 USP
Glycerol Duchefa Biochemie G1345
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
Bacto Agar BD Bioscience 214010
Mannitol-Glutamate (MG) liquid media Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7
Mannitol Duchefa Biochemie M0803
L-glutamic acid Duchefa Biochemie G0707
KH2PO4 Sigma-Aldrich NIST200B
Infiltration buffer 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use.
MES Duchefa Biochemie M1503 Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize.
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Prepare 100 mM stock in water. Autoclave.
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406 Prepare 150 mM stock in DMSO.
Confocal microscope equipments/materials
710 laser scanning confocal system Carl Zeiss
Axio observer Z1 inverted microscope Carl Zeiss
Propidium iodide ThermoFisher P1304MP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
  2. Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126, (5), 969-980 (2006).
  3. Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).
  4. Buttner, D. Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells. FEMS Microbiol Rev. 40, (6), 894-937 (2016).
  5. Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 4 (2013).
  6. Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants. J Bacteriol. 180, (17), 4523-4531 (1998).
  7. Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Semin Cell Dev Biol. 20, (9), 1055-1063 (2009).
  8. Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).
  9. Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants. Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).
  10. Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol. 12, (1), 37-43 (2009).
  11. Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiol. 122, (4), 999-1001 (2000).
  12. Courbot, M., et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol. 144, (2), 1052-1065 (2007).
  13. Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580, (4), 1094-1102 (2006).
  14. Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function. J Biol Chem. 278, (16), 14196-14202 (2003).
  15. Reinicke, A. T., et al. A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery. J Biol Chem. 280, (15), 14620-14627 (2005).
  16. Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization. Cell. 137, (2), 283-294 (2009).
  17. Fernandez-Alvarez, A., et al. Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis. PLoS Pathog. 8, (3), e1002563 (2012).
  18. Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, (6), 571-579 (2009).
  19. Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, Á Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52, (1), 59 (2008).
  20. Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24, (1), 79-88 (2006).
  21. Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 23, (1), 102-107 (2005).
  22. Cabantous, S., et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association. Sci Rep. 3, 2854 (2013).
  23. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nat Commun. 7, 11046 (2016).
  24. Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors. Nat Methods. 7, (4), 325-330 (2010).
  25. Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29, (7), 1571-1584 (2017).
  26. Addgene. Available from: https://www.addgene.org (2018).
  27. Arabidopsis Biological Resource Center. Available from: https://abrc.osu.edu (2018).
  28. Kvitko, B. H., et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5, (4), e1000388 (2009).
  29. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, (1), 23-28 (1990).
  30. Kovach, M. E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166, (1), 175-176 (1995).
  31. Upadhyaya, N. M., et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat. Mol Plant Microbe Interact. 27, (3), 255-264 (2014).
  32. Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc. 2006, (7), (2006).
  33. Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, (26), 15849-15854 (1998).
  34. Nimchuk, Z., et al. Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae. Cell. 101, (4), 353-363 (2000).
  35. Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (18), 7619-7624 (2011).
  36. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (25), E3501-E3508 (2016).
  37. Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells. Plant J. 77, (3), 487-495 (2014).
  38. Tanaka, S., et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Eur J Cell Biol. 94, (7-9), 349-358 (2015).
Зеленый флуоресцирующий белок Сплит система для визуализации эффекторов доставлены из бактерий во время инфекции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, H. Y., Lee, S. E., Woo, J., Choi, D., Park, E. Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection. J. Vis. Exp. (135), e57719, doi:10.3791/57719 (2018).More

Lee, H. Y., Lee, S. E., Woo, J., Choi, D., Park, E. Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection. J. Vis. Exp. (135), e57719, doi:10.3791/57719 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter