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Biology

Sistema proteína verde fluorescente para visualizar efectores entregado de las bacterias durante una infección

doi: 10.3791/57719 Published: May 24, 2018

Summary

Enfoques basados en proteína fluorescentes para monitorear efectores secretados por las bacterias en las células del huésped son desafiantes. Esto es debido a la incompatibilidad entre proteínas fluorescentes y el sistema de secreción tipo III. Aquí, un optimizado superfolder GFP sistema se utiliza para la visualización de efectores secretados por las bacterias en la célula de la planta huésped.

Abstract

Las bacterias, uno de los más importantes agentes causantes de varias enfermedades de planta, secretan una serie de proteínas efectoras dentro de la célula de la planta de host para subvertir el sistema de inmunológico de la planta. Durante la infección los efectores citoplásmicos se entregan al citosol anfitrión vía un tipo sistema de la secreción de III (T3SS). Después de la entrega en la célula de la planta, el effector(s) apunta a la compartment(s) específicos para modular los procesos de la célula huésped para la supervivencia y replicación del patógeno. Aunque ha habido algunas investigaciones sobre la localización subcelular de proteínas efectoras de las células hospedadoras para entender la función de patogenicidad mediante el uso de proteínas fluorescentes, investigación de la dinámica de efectores inyectados directamente de las bacterias ha sido un desafío debido a la incompatibilidad entre el T3SS y proteínas fluorescentes.

Aquí, describimos nuestro método reciente de un sistema de la proteína verde fluorescente de superfolder de split optimizado (sfGFPOPT) para visualizar la localización de efectores entregados vía el T3SS bacteriana de la célula huésped. El sfGFP11 (11 ath β-filamento de sfGFP)-etiquetado efectoras secretadas a través del T3SS se pueden montar con un orgánulo específico dirigido 10 sfGFP1OPT (1-10th β-filamento de sfGFP) líder para la emisión de fluorescencia en el sitio. Este protocolo proporciona un procedimiento para visualizar la señal de fluorescencia sfGFP reconstituido con una proteína efectora de Pseudomonas syringae en un orgánulo especial en las plantas de Arabidopsis y Nicotiana benthamiana .

Introduction

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Las plantas son organismos sésiles que encuentran numerosos patógenos invasores como bacterias, hongos, virus, insectos y nematodos en todo su ciclo de vida. Entre los fitopatógenos, las bacterias patógenas Gram negativas como Pseudomonas spp. y Ralstonia spp., infecta sus plantas hospederas ingresando a través de heridas o aberturas naturales como las estomas y los hidatodos1. Colonizar con éxito plantas huésped, patógenos bacterianos han evolucionado para desarrollar una variedad de factores de virulencia2. Cuando las bacterias invaden una planta del anfitrión, inyectan una serie de proteínas de virulencia — conocidas como efectores, directamente en las células de la planta para promover su patogenicidad. Estos efectores suprimen o modulan la inmunidad innata de la planta y manipulan los procesos celulares del anfitrión para dar lugar a supervivencia bacteriana3.

Bacterias patógenas principalmente usan un T3SS para proporcionar proteínas efectoras directamente a host células4. El T3SS se asemeja a una jeringa molecular con un canal de aguja-como conectar desde una estructura de la proteína del andamio en el interior y el exteriores membranas bacterianas para el sitio de la inyección del anfitrión célula5. Este mecanismo de secreción de T3SS mediada por efectores (T3E) está bien conservado en varios patógenos bacterianos Gram negativos de la planta como humano. Uno de los patógenos de plantas representativas, la p. syringae pv. Tomate DC3000 CCDH mutante, que tiene típicamente una T3SS defectuoso, ha restringido el crecimiento de las plantas probablemente debido a la incapacidad de este mutante para suprimir completamente la planta inmunidad (mediante la inyección de proteínas efectoras)6. Sobre desplazamiento en las células hospedadoras, efectores dirigidos a diversas proteínas del huésped que son importantes para el sistema de célula de host, incluyendo respuestas de defensa de la planta, transcripción genética, muerte celular, proteasoma, tráfico de vesículas y hormona vías7 , 8 , 9 , 10. por lo tanto, el seguimiento de la localización celular de las proteínas efectoras de las células hospedadoras es un objetivo atractivo para comprender sus funciones con respecto a la modulación de la inmunidad de la planta.

La mayoría de los estudios de localización de la T3Es ha empleado Agrobacterium-mediada por sobreexpresión de una proteína grande de la fluorescencia en el host planta9. Sin embargo, el método de expresión heteróloga de genes que se introducen en otras especies se ha demostrado para ser mal localizado o en ocasiones no funcional11,12,13. Además, varios estudios revelaron que efectores bacterianas sufren modificación para apuntar correctamente en el host células14,15,16,17. Por lo tanto, transitorio expresó efectores en el citosol de la planta las células no pueden ser funcionalmente o cuantitativamente idénticas a los efectores que son entregados por el T3SS al patógeno infección18. Por otra parte, la fusión de grandes etiquetas fluorescentes a proteínas efectoras puede interrumpir la efectora adecuada entrega y visualización18,19. Por lo tanto, estos enfoques para analizar la función T3E no pueden reflejar plenamente la localización nativa de los efectores secretados de T3SS.

Una proteína fluorescente verde (GFP) se compone de un cadena de 11 β-barril que encierra un filamento central que incluye un cromóforo20. Waldo et al. informó un sistema split-GFP novela que consta de un pequeño componente (GFP β strand 11; GFP11) y un gran fragmento complementario (GFP β el filamento 1-10; GFP1-10)21. Los fragmentos no es fluorescente por sí mismos pero es fluorescente sobre su autoasociación cuando ambos fragmentos están muy cerca entre sí. Para la optimización de la eficiencia de proteína plegable robustas plegables variantes de la GFP, es decir, sfGFP y sfGFPOPT, posteriormente fueron desarrollados para el split GFP sistema20,21,22. Recientemente, solo aminoácido mutado variantes de sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT y sfCFP1-10OPT- que puede reconstituir con un fragmento de sfGFP11 y mostrar fluorescencia de color amarillo y cian, respectivamente, fueron generados23 . Por otra parte, sfCherry, un derivado de mCherry, puede ser dividida en fragmentos de 10 sfCherry1 y sfCherry11 de la misma manera que sfGFP23.

Este sistema ha sido adaptado para etiquetar y rastrear los efectores T3SS en células HeLa durante la infección con los efectores de Salmonella24. Sin embargo, que fue previamente no optimizado para el sistema planta-bacteriano patógeno. Recientemente, hemos optimizado el sistema GFP de split basado en el sfGFP1-10 mejoradoOPT para monitorear la localización subcelular de la T3Es entregada de p. syringae en plantas células25. Para facilitar los estudios de localización de T3Es a diferentes compartimentos subcelulares en las células de la planta, un conjunto de transgénicas de Arabidopsis thaliana se generaron plantas para expresar sfGFP1-10OPT en los distintos compartimientos subcelulares 25. Además, la plásmidos llevan una variedad de organelas-destinados a la sfGFP1-10OPT Agrobacterium-sobreexpresión transitoria mediada y los vectores con etiquetas sfGFP11 para la entrega de la base de T3SS efectoras se generaron también. Las semillas de varias líneas transgénicas de Arabidopsis y la plásmidos expresar T3Es de interés pueden obtenerse de fuentes mencionadas en la Tabla de materiales26,27.

En el siguiente protocolo, describimos un sistema optimizado para monitorear la dinámica de los efectores por las bacterias en las células hospedadoras mediante el sistema de sfGFP de split. La infección de plantas que expresan sfGFP1-10OPT con transgénicos Pseudomonas llevando el plásmido recombinante sfGFP11 resulta en una entrega del efector tagged sfGFP11 de Pseudomonas en la célula huésped. En consecuencia, estas proteínas se reconstituyen y translocan a la compartment(s) objetivo de efectores específicos. La Pseudomonas syringae pv. tomate CUCPB5500 cepa en la que 18 efectores se eliminan, se utilizó debido a que esta cepa mostró baja o no la muerte celular en a. thaliana y N. benthamianas28. Sin embargo, todos los materiales y pasos que se describen aquí pueden ser reemplazados o modificados para adaptar el sistema de sfGFP División de investigación de otras cuestiones biológicas o de optimización en las condiciones de laboratorio dado.

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Protocol

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Nota: Todas las medidas se realizan a temperatura ambiente, salvo estipulación en contrario.

1. preparación de materiales de planta (4 semanas)

  1. Preparación de las plantas de N. benthamiana
    1. Sembrar 2 semillas de N. benthamiana de la superficie del suelo de cada maceta, cubrir la bandeja con una cúpula de plástico y permiten las semillas a germinar en un 25 ° C, 60% cámara de humedad con un ciclo de fotoperiodo de 16/8-h luz/oscuridad.
    2. Después de dos semanas, seleccionar y desechar la semilla más pequeña en cada maceta y continúan creciendo las plantas en las mismas condiciones de crecimiento como se aplica para la germinación en el paso 1.1.1. Añadir 1 L de agua por bandeja cada dos días.
      Nota: Las condiciones de crecimiento para las plantas pueden variar entre laboratorios. Por lo tanto, seguir el protocolo riego regular para hacer crecer la planta en condiciones sanas.
    3. En una semana, las plantas de transferencia a una nueva bandeja y organizar con suficiente espacio para seguir creciendo. Seguir creciendo las plantas en las condiciones descritas en el paso 1.1.1 hasta que están listos para ser infiltrado en 4 semanas de edad.
      Nota: El crecimiento de las plantas puede diferir dependiendo de las condiciones de crecimiento a través de laboratorios. Por lo general, encontramos que 4 semanas de edad las plantas de N. benthamiana llevan unas seis hojas.
  2. Preparación de las plantas transgénicas de a. thaliana
    1. Consulte la Tabla de materiales y ordenar las semillas transgénicas de Arabidopsis .
    2. Remoje las semillas de Arabidopsis transgénicas ~ 50-100 en 1 mL de agua destilada y almacenarlos a 4 ° C por 3 días en la oscuridad para sincronizar el inicio de la germinación.
    3. Sembrar semillas de ~ 2-3 en la superficie del suelo de una planta de charolas y cubrir la bandeja con una cúpula de plástico. Permitir que las semillas a germinar a 23 ° C, 60% de humedad con un ciclo de fotoperiodo de 10/14-h luz/oscuridad.
      Nota: Las semillas deben ser homozigotos. Sin embargo, se recomienda reconfirmar la presencia del transgen en el lote. En este caso, esterilizar las semillas por lavado con etanol al 70% por 2 min, 50% cloro (cerca de 2% de hipoclorito) conteniendo 0.05% Tritón X-100 para 5 minutos seguir lavando 5 - 6 veces con agua bidestilada estéril (ddH2O). Después de la esterilización, estratificar a 4 ° C por 3 días y placa en los medios de germinación de planta que contiene 25 μg/L de higromicina B para seleccionar las plantas transgénicas.
    4. Después de una semana, dejar sólo una planta por enchufe y seguir creciendo plantas bajo las mismas condiciones de crecimiento utilizadas para paso 1.2.3.
      Nota: Las plantas de cuatro semanas de edad fueron utilizadas para la infección de p. syringae . Plantas de agua cada día para mantener las plantas sanas.

2. preparación de cultivo de Pseudomonas (~ 1 semana)

  1. Construcción del plásmido para la transformación de Pseudomonas
    1. Consulte la Tabla de materiales y la vector(s) deseada del efector T3SS-basado sistema vector25de la orden.
    2. Introduzca el gen efector de interés en el vector de la entrega de efector mediante recombinación específica del sitio clonación25.
      Nota: Al medirse la localización subcelular de la proteína efectora de larga duración, poner el gen integral en pBK-GW-1-2 o pBG-GW-1-2. También es posible elegir pBK-GW-1-4 o pBG-GW-1-4 que contiene 2 x sfGFP11 para aumentar la señal de fluorescencia. En el caso de un generador de efectos parcial que carecen de péptido señal, usar pBK-GW-2-2 o pBK-GW-2-4. Consulte Park et al. , para obtener información detallada acerca de vectores de entrega efectoras25.
  2. Transformar el plásmido lleva un generador de efectos fundido a la etiqueta sfGFP11 a p. syringae pv. Tomate (Pst) CUCPB5500 mediante electroporación estándar29.
    Nota: Otras cepas de Pseudomonas pueden utilizarse si es necesario. El sistema de etiqueta de sfGFP11 se construye para una amplia gama de vectores30 y la expresión génica de la efectora está reglamentada por el promotor de AvrRpm1, que es comparable con, por ejemplo, Pseudomonas fluorescens (EthAn)31.
  3. Las células bacterianas transformadas se separó suavemente sobre la superficie de las placas de agar del rey con B que contiene 100 rifampicina μg/mL y 25 kanamicina μg/mL o 25 μg/mL gentamicina. Incubar a 28 ° C durante 2 días.
  4. Inocular una colonia en medio líquido de la B del rey con los antibióticos apropiados para el vector utilizado y crecen las células durante la noche a 28 ° C con agitación a 200 rpm.
  5. Hacer un caldo glicerol. Añadir glicerol esterilizado a una concentración final de 50% y conservar a-80 ° C.

3. transitoria expresión de sfGFP1-10 orientada a organeloOPT en N. benthamiana (4 días)

  1. Preparación de cultivo de Agrobacterium
    1. Pedido el vector(s) deseado del organelo blanco sfGFP1 10OPT plasmid(s) (consulte la Tabla de materiales).
    2. Transformar el plasmid(s) en la cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101 células32. Crecen las células en medio de agar Luria-Bertani (LB) suplementado con 50 de μg/mL kanamicina y 50 rifampicina μg/mL a 28 ° C durante 2 días.
    3. De una sola Colonia en el medio de agar LB, inocular las células en 5 mL de medio LB líquido suplementado con 50 de μg/mL kanamicina y 50 rifampicina μg/mL. Crecen las células durante la noche a 28 ° C con agitación a 200 rpm.
    4. Cosecha de las células por centrifugación a 3.000 x g durante 10 minutos retirar el medio sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de recién hecho buffer de infiltración.
    5. Medir la cantidad de Agrobacterium obteniendo el valor de densidad óptica (OD) a una absorbancia de 600 nm (Abs 600 nm). Ajustar el OD600 de las bacterias a 0.5 con tampón de infiltración.
      Nota: 1 mL de la suspensión es suficiente para infiltrarse en dos puntos.
    6. Dejar la cultura a temperatura ambiente en un rockero suave de 1-5 h antes de la infiltración.
    7. Hágale un agujero en el centro de las hojas a ser infiltrado con la punta 10 μl. Utilice una jeringa sin aguja 1 mL para infiltrarse en las suspensiones de Agrobacterium . Cuidadosamente y lentamente inyecte unos 500 μl de las suspensiones preparadas a partir de paso 3.1.5 en el lado adaxial de la hoja a través de la jeringa. Repetir la infiltración en al menos tres diferentes plantas para repeticiones experimentales.
      Nota: Por razones de salud y seguridad, debe usar protección ocular durante la infiltración.
    8. Limpie el restante de la suspensión bacteriana en las hojas y marcar los límites de la región infiltrada.
    9. Mantener las plantas infiltradas en las mismas condiciones de crecimiento utilizadas para paso 1.1.1 para 2 días.

4. la inoculación de Pseudomonas (4 días)

  1. Estría la cepa de Pseudomonas transformada del stock de glicerol en el paso 2.5 de B agar los medios de comunicación King con los antibióticos apropiados a 28 ° C durante 2 días.
    Nota: La salud de Pseudomonas es muy crítica. Si las colonias no se forman bien, las células de la raya otra vez o propagar las células en medio líquido del rey antes de proceder.
  2. Inocular un asa llena de células de Pseudomonas en medio líquido manitol-glutamato (MG) a 28 ° C con agitación a 200 rpm para pasar la noche.
  3. Cosecha de las células por centrifugación a 3.000 x g durante 10 minutos retirar los medios sobrenadante, Resuspender el precipitado en 10 mM de MgCl2y ajuste OD600 a 0.02 (1 x 107 cfu/mL) para hojas de N. benthamiana y 0.002 (1 x 106 UFC/mL) de hojas de Arabidopsis .
  4. Para el N. benthamiana, infiltrarse en la suspensión de Pseudomonas en el área de las hojas donde el Agrobacterium llevando 10 sfGFP1OPT construcción fue infiltrado 2 días antes (como en el paso 3.1.7). Para el sfGFP1-10OPT transgénicas de Arabidopsis, infiltrar la suspensión de Pseudomonas en hojas de crecido día cortas 4 semanas de edad de dos.
    Nota: para repeticiones experimentales se necesitan al menos tres plantas.

5. observación de sfGFP señal a través de Microscopía Confocal (1 día)

  1. Cortar los discos de hoja de Pseudomonas-inocular hojas. En momentos específicos después de la infiltración de Pseudomonas, imagen de dos discos de hoja de 2 cm2 de la planta utilizando un láser de barrido confocal sistema con 40 X / 1.2 objetivo de inmersión de agua NA C-Apochromat o 63 X / 0.8 NA C-Apochromat inmersión de aceite objetivo. Para evitar que las células muertas por heridas, observar las células del orificio de la infiltración.
  2. Comenzar la observación con un ajuste de baja potencia del laser de argón de 488 nm. Aumentar la potencia del láser para detectar sfGFP.
    Nota: Utilizamos generalmente 2-15% de la intensidad del láser para detectar la señal de fluorescencia. Sin embargo, la energía del laser y el ajuste de la detección deben ajustarse basándose en el sistema del usuario microscopia. Aquí, los filtros de emisión se establecieron en 520-550 nm. Las células muertas a menudo emiten auto fluorescencia bajo la excitación de 488 nm láser. Por lo tanto, como un control negativo, el mismo efector sin la etiqueta de sfGFP11 debe ser infiltrado y observado en las mismas condiciones de observación. Además, la excitación láser de alta puede inducir la autofluorescencia de la clorofila. Por lo tanto, regular la intensidad de láser utilizando las células de la planta de control para no inducir la autofluorescencia de la clorofila.
    1. Para una contratinción de la pared celular, infiltrarse en yoduro de propidio (PI) del 20 mM en el disco de hojas en 5-10 minutos antes de la observación.
    2. Para el núcleo de tinción, sumerja los discos de hoja de paraformaldehído al 0.1% por 5 min seguido por lavado con agua. Entonces, infiltrar 10 mM PI dentro del disco de hoja en 5-10 min antes de observación microscópica. Repetir los experimentos al menos tres veces.
      Nota: Este paso no es crítico pero útil para definir la localización de efector en la membrana del plasma o el núcleo. Si los efectores de interés demostraron su localización en un orgánulo específico, utilice un marcador para el orgánulo dado para confirmar la localización de la unidad de efectos.

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Representative Results

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La estructura del β-barril de GFP se compone de once β filamentos y puede dividirse en dos fragmentos, el filamento delth del 1-10 (GFP1-10OPT) y el filamento de la 11th (GFP11). Aunque ninguno de los dos fragmentos fluorescentes por sí mismos, uno mismo-montado sfGFP puede emitir la fluorescencia cuando los dos fragmentos en proximidad cercana (figura 1A). En este sistema, sfGFP1-10OPT-expresando Arabidopsis o N. benthamiana plantas son inoculadas con Pseudomonas llevando un efector sfGFP11 con la etiqueta. El efector de sfGFP11 con la etiqueta entregado por Pseudomonas en el citosol de la célula huésped se reconstituye a la sfGFP1-10OPT en el citosol y luego juntos se translocan en el compartimiento de destino (figura 1B). Figura 2 se representa el procedimiento general, desde la preparación de los materiales de planta y Pst a la detección de la señal de fluorescencia en la célula de la planta.

Como ejemplo de nuestro método, se utilizó la proteína efectora de p. syringae , AvrB, que se entrega en las planta las células del huésped completa el T3SS durante la infección. En Arabidopsis, AvrB es reconocido por una proteína de resistencia correspondientes, RPM1 y desencadena la respuesta inmune incluyendo hipersensibilidad celular muerte33. En el estudio anterior, el análisis de reportero GFP y el análisis bioquímico revelaron que AvrB y RPM1 se localizan en la membrana plasmática de la planta celular33,34,35. Para examinar la localización de AvrB usando nuestro método, Agrobacterium albergar el gen deTPO cito sfGFP1-10 fue infiltrada en N. benthamiana. En dos días, las células transformadas de sfGFP11 AvrB Pseudomonas fueron inoculadas en el Agrobacterium-se infiltraron en la región. La fluorescencia sfGFP complementa las señales se observaron en el Pst CUCPB5500 conteniendo AvrB-sfGFP11 en la membrana plasmática (figura 3B). En contraste, ninguna señal se encontraron en la célula infectada por Pst llevar el nativa AvrB (Figura 3A).

Figure 1
Figura 1. El optimizado sistema GFP. (A) la estructura del β-barril de GFP es de 11 β-filamentos y pueden dividirse en el 1-10th β-filamento (GFP1-10) y la 11th β-filamento (GFP11). (B) en este método, los fragmentosOPT sfGFP1-10 se expresaron en las células vegetales, mientras que el filamento de sfGFP11 fue fundido a AvrB y transformado en Pseudomonas. Sólo células de las plantas infectadas por Pseudomonas que contiene sfGFP11 mostrará la fluorescencia de sfGFP (donde se localiza la unidad de efectos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Resumen del procedimiento de. Los transgénicos Arabidopsis o el sfGFP1-10OPT-se infiltraron en N. benthamiana planta está infectada con el Pst CUCPB5500 llevar un efector sfGFP11 etiquetados a través de la infiltración de la jeringa. La fluorescencia de la sfGFP montada puede detectarse mediante un sistema de microscopía confocal en el sitio de la localización del efector. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Detección de AvrB-sfGFP en N. benthamiana deja 3 h después de la infección. El Pst CUCPB5500 albergar que un gen AvrB sfGFP11 tagged fue infiltrado en elth de 5 o 6 hojas deth de N. benthamiana, que fue infiltrada por Agrobacterium con el sfGFP1-10OPT 2 días antes. La pared celular fue manchada por el yoduro de propidio. Mientras que las células que expresan sfGFP1-10 OPT con sólo AvrB no muestran ninguna señal de fluorescencia (A). Las señales GFP (flecha amarilla) se observaron en las células infectadas por el Pst conteniendo AvrB-sfGFP11 gene en infiltración después de 3 h (B). Ello representa que sólo AvrB-sfGFP11, no AvrB, es reconstituido con 10 sfGFP1OPT en el citosol y luego el montado sfGFP se transloca a la membrana plasmática. Color magenta pseudo representa la pared celular y la autofluorescencia de la clorofila. El verde representa la fluorescencia sfGFP montado. Barras de escala = 40 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El protocolo aquí descrito se utiliza para monitorear la localización exacta de las proteínas efectoras inyectadas por el T3SS bacteriana en la célula de planta huésped a la infección. Anteriormente, el sistema GFP de split fue utilizado como una herramienta para el estudio de la localización subcelular de las proteínas mamíferas23,36 salmonelas T3E localización y Agrobacterium VirE2 entrega a través de la T4SS en la planta células37. Para aplicar este sistema en las células de la planta, los estudios anteriores utilizan una maíz planta transgénica que expresa constitutivamente el GFP1 citoplásmico-10 y hongos transgénicos, Ustilago maydis, que expresa la proteína efectora GFP11 tagged. Sin embargo, el sistema deU. maydis de maíz no ha sido exitoso porque los niveles de expresión de las proteínas efectoras translocados eran débiles y alto nivel de Autofluorescencia de fondo impidió la detección de los reconstituidos GFP señal38. Para solucionar este problema, hemos utilizado un sfGFP1-10 variante, sfGFP1-10OPT, que mejora significativamente la solubilidad y la fluorescencia intensidad21,22.

A pesar de las ventajas del sistema sfGFP, hay algunas limitaciones para el estudio de la localización del generador de efectos y dinámica. En primer lugar, la señal fluorescente observada sfGFP reconstituido es relativamente débil. Esto podría deberse a una pequeña cantidad de moléculas efectoras directamente de p. syringae. Esta señal débil podría mejorarse mediante el uso de la etiqueta de sfGFP11 de multimerizing. Los vectores lleva 2 etiqueta de x sfGFP11 también están disponibles en las fuentes mencionadas en la Tabla de materiales. En segundo lugar, el sfGFP1-10 citosólica OPT no pudo ser reconstituida con sfGFP11 dirigida a Golgi, ER y plastid25. Coexpresión de sfGFP11 orientada a las mitocondrias y citosol sfGFP1 10OPT resultó en mislocalization de la nuevamente constituida sfGFP al citosol y núcleo25. Por lo tanto, localización de la unidad de efectos de interés debe validarse nuevamente aplicando la apropiada orientada a organelas sfGFP1 10OPT. Cuando no se detecta ninguna señal de GFP en las células infectadas expresan citosólica 10 sfGFP1OPT, recomendamos benth N. expresando a Golgi, ER, y plastid blancoOPT 10 sfGFP1 o usando el orgánulo correspondiente dirigido sfGFP1-10OPT transgénicos Arabidopsis25.

Este método demostró el uso del sistema proteína fluorescente como una herramienta útil para analizar la dinámica temporal y espacial de efectores en host plantas25. La investigación futura se centrará en los avances en proyección de imagen de una sola molécula, que puede permitir estudios detallados de la dinámica de efectores localizados en membrana del plasma. Además, un análisis de secreción mediante un sistema bacteriano puede ser una alternativa útil para el estudio de localización de efectores hongos; previene la agregación de los efectores y alta autofluorescencia en el sitio de penetración de hongos.

Cabe señalar que hay algunos puntos clave en este método. En primer lugar, materiales vegetales y bacterias deben ser sano y fresco. Para garantizar la visualización de la señal efectora, sfGFP1-10OPT de las plantas y la sfGFP11 de Pseudomonas deben fuertemente expresarse. Por lo tanto, es importante crecer las plantas en las condiciones de crecimiento óptimo y protegerlos contra factores de estrés ambientales, tales como las plagas. También recomendamos tomar todas las bacterias utilizadas para infiltración de las células cultivadas día 2 sobre las placas de agar y no de las existencias de glicerol. En segundo lugar, en el caso de la expresión transitoria en N. benthamiana, la longitud de tiempo requerido para la maduración de la sfGFP1-10 orientada a organeloOPT puede variar para cada proteína del marcador de organelas. Por ejemplo, maduración de PM-sfGFP1-10OPT requiere más de 48 h después de la infiltración. Por último, el punto del tiempo y los niveles de expresión de las señales sfGFP reconstituido dependen del tipo de proteínas efectoras que se requieren para optimizar algunas condiciones experimentales.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y planificación futura (NRF-2018R1A2A1A05019892) para DC y por una beca del centro de crianza de planta Molecular ( PMBC) del siguiente generación Biogreen 21 programa de la dirección de Desarrollo Rural (PJ013201) a EP Agradecemos al centro de proyección de imagen del Centro Nacional de instrumentación para la gestión ambiental proporcionar un microscopio confocal para el rodaje.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis transgenic lines Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10 ABRC CS69831
NU-sfGFP1-10 ABRC CS69832
PT-sfGFP1-10 ABRC CS69833
MT-sfGFP1-10 ABRC CS69834
PX-sfGFP1-10 ABRC CS69835
ER-sfGFP1-10 ABRC CS69836
GO-sfGFP1-10 ABRC CS69837
PM-sfGFP1-10 ABRC CS69838
Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10 Addgene 97387
NU-sfGFP1-10 Addgene 97388
PT-sfGFP1-10 Addgene 97389
MT-sfGFP1-10 Addgene 97390
PX-sfGFP1-10 Addgene 97391
ER-sfGFP1-10 Addgene 97392
GO-sfGFP1-10 Addgene 97393
PM-sfGFP1-10 Addgene 97394
ER-sfCherry1-10 Addgene 97403
ER-sfYFP1-10 Addgene 97404
CYTO-sfCFP1-10 Addgene 97405
sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2 Addgene 98250 pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4 Addgene 98251 pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2 Addgene 98252 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4 Addgene 98253 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2 Addgene 98254 pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4 Addgene 98255 pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2 Addgene 98256 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4 Addgene 98257 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
Bacterial strains
Agrobacterium tumefaciens GV3101 Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml)
Media components
Plant germination media Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve.
Murashige & Skoog medium including vitamins Duchefa Biochemie M0222 Store at 4 °C.
Sucrose Duchefa Biochemie S0809
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
LB media Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave.  Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed.
Tryptone BD Bioscience 211705
Yeast extract BD Bioscience 212750
NaCl Duchefa Biochemie S0520
Micro agar Duchefa Biochemie M1002
King's B media 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed.
Proteose peptone BD Bioscience 212120
Anhydrous K2HPO4 Sigma-Aldrich 1551128 USP
Glycerol Duchefa Biochemie G1345
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
Bacto Agar BD Bioscience 214010
Mannitol-Glutamate (MG) liquid media Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7
Mannitol Duchefa Biochemie M0803
L-glutamic acid Duchefa Biochemie G0707
KH2PO4 Sigma-Aldrich NIST200B
Infiltration buffer 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use.
MES Duchefa Biochemie M1503 Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize.
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Prepare 100 mM stock in water. Autoclave.
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406 Prepare 150 mM stock in DMSO.
Confocal microscope equipments/materials
710 laser scanning confocal system Carl Zeiss
Axio observer Z1 inverted microscope Carl Zeiss
Propidium iodide ThermoFisher P1304MP

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References

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Sistema proteína verde fluorescente para visualizar efectores entregado de las bacterias durante una infección
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Lee, H. Y., Lee, S. E., Woo, J., Choi, D., Park, E. Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection. J. Vis. Exp. (135), e57719, doi:10.3791/57719 (2018).More

Lee, H. Y., Lee, S. E., Woo, J., Choi, D., Park, E. Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection. J. Vis. Exp. (135), e57719, doi:10.3791/57719 (2018).

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