Summary
Protein-protein og protein-metabolitten interaksjoner er avgjørende for alle cellular funksjonene. Her beskriver vi en protokoll som tillater parallelle analyse av disse interaksjoner med en protein valg. Våre var optimalisert for plante cellekulturer og kombinerer affinitet rensing med masse massespektrometri-basert protein og metabolitten gjenkjenning.
Abstract
Cellulære prosesser er regulert av samspillet mellom biologiske molekyler som proteiner, metabolitter og atomer syren. Mens etterforskningen av protein-protein interaksjoner (PPT) er ingen nyhet, utgjør eksperimentelle metoder å karakterisere endogene protein-metabolitten samhandlinger (PMI) en ganske ny utvikling. Her presenterer vi en protokoll som tillater samtidig karakterisering av PPT og PMI av et protein valgfrihet, referert til som agn. Våre protokollen var optimalisert for Arabidopsis celle kulturer og kombinerer affinitet rensing (AP) med massespektrometri (MS)-basert protein og metabolitten gjenkjenning. Kort sagt, er transgene Arabidopsis linjer, uttrykke agn protein smeltet en affinitet-koden første lysed for å få en innfødt mobilnettet pakke. Anti-tag antistoffer brukes til å trekke ned protein og metabolitten partnere av agn protein. Affinitet-renset komplekser er trukket ut ved hjelp av en ettrinns metyl tert-butyl-Eter (MTBE) metanol/vann metoden. Mens metabolitter skille til polar eller hydrofobe fasen, finner proteiner i pellet. Både metabolitter og proteiner analyseres deretter av ultra ytelse flytende kromatografi-massespektrometri (UPLC-MS eller UPLC--MS-/ MS). Tom-vektor (EV) kontrollen linjer brukes til å ekskludere falske positiver. Hovedfordelen med våre protokollen er at den lar identifikasjon av protein og metabolitten partnere av et mål protein parallelt i nær-fysiologiske forhold (mobil lysate). Presentert metoden er enkel, rask, og kan tilpasses enkelt biologiske systemer enn anlegget cellekulturer.
Introduction
Metoden beskrevet her tar sikte på identifisering av metabolitten og protein partnere av et protein valg i nesteni vivo mobilnettet lysate forhold. Det har vært spekulert at mange flere metabolitter enn preget i dag har en viktig regulatoriske funksjon1. Metabolitter kan fungere som biologiske brytere, endre aktivitet, funksjonalitet og/eller lokalisering av deres reseptor proteiner2,3,4. I det siste tiåret har flere gjennombrudd metoder, aktivere identifikasjon for PMI vivo eller i nesteni vivo forhold, vært utviklet5. Tilgjengelige tilnærminger kan deles i to grupper. Den første gruppen består av teknikker som starter med en kjent-metabolitten agn for å fange roman protein partnere. Metoder omfatter affinitet kromatografi6, narkotika affinitet forståelsesfull mål-stabilitet analysen7, chemo-Proteomikk8og termisk proteom profilering9. Den andre gruppen består av en enkelt metode som starter med et kjent protein for å identifisere små molekyl ligander10,11.
AP kombinert med baserte lipidomics ble brukt til å analysere protein-lipid komplekser Saccharomyces cerevisiae12. Som utgangspunkt, forfatterne brukte gjær påkjenningen uttrykke 21 enzymer som er involvert i ergosterol biosyntesen og 103 kinaser smeltet sammen til en tandem-affinitet rensing (TAP) kode. 70% av enzymer og 20% av kinaser fant binde ulike hydrofobe ligander, feriere i intrikate protein-lipid samhandling nettverket.
Tidligere kunne vi vise at tilsvarende til lipider, polar og semi polare forbindelser også forblir bundet til protein komplekser isolert fra mobilnettet lysates13. Basert på disse resultatene, bestemte vi oss å optimalisere AP metoden publisert tidligere10,11 for anlegget celler og hydrofile forbindelser14. For dette formålet brukte vi trykk vektorer beskrevet av Van Leene et al. 2010, brukt i anlegget PPI studier15. For å forkorte tiden det tar å få transgene linjer, bestemte vi på Arabidopsis cellekulturer. Vi ansatt en ettrinns metyl tert-butyl-Eter, (MTBE) metanol/vann utvinning metoden, slik at karakterisering av proteiner (pellet), lipider (organisk fase) og hydrofile metabolitter (vandige fasen)16 i én affinitet-rensing eksperiment. EV kontrollen linjer ble innført for å utelate falske positiver, f.eks proteiner binding til koden alene. Som bevis på konseptet vi merket tre (av fem) nukleosid diphosphate kinaser presentere i Arabidopsis genomet (NDPK1-NDPK3). Blant andre funn, vi kunne vise at NDPK1 samhandler med glutation S-transferase og glutation. Derfor kan vi bevise at NDPK1 er utsatt for glutathionylation14.
For å oppsummere, presentert protokollen er et viktig verktøy for å karakterisere protein-protein og protein-liten-molekylet samhandling nettverk og utgjør et stort fremskritt over eksisterende metoder.
Protocol
Utarbeidelse av transgene Arabidopsis kultur cellelinjer, herunder kloning, transformasjon, utvalg og vekst kan finnes i17. Merk at EV kontrollen linjer er anbefalt å korrigere for falske positiver. Før eksperimentet, Bekreft overuttrykte proteinet som agn ved western blot analyse, f.eks bruke IgG-antistoffer mot G-protein delen av tandem affinitet koden. Det er viktig å skille vekst media fra celle kultur plantemateriale.
1. klargjør celle plantemateriale før eksperimentet
- Vokse en PSB-L A. thaliana celle kultur linje overexpressing protein rundt18.
- Forberede MSMO medium, som inneholder 4.43 finans MSMO blandet med 30 g/L sukrose. Justere pH i bufferen til 5.7 med 1 M KOH og autoklav løsningen. Før eksperimentet supplement mediet med 0,5 mg/L α-naphthaleneacetic acid, 0,05 mg/L kinetin og 50 μg/mL kanamycin.
- Dyrke transformert anlegget cellekulturer i 50 mL av MSMO medium i en 100 mL kolbe på en orbital plattform shaker med mild agitasjon (130 rpm). Vokse celler i en kultur rom på 20 ° C og lysintensiteten til 80 μmol m-2 s-1.
- Subkultur celler i frisk media hver 7 dager, fortynne dem 1:10.
- Samle celler på den logaritmiske vekstfase bruker glass trakt kombinert med en vakuumpumpe, bruker en nylon maske som filter. Pakk infiltrere i aluminiumsfolie og fryse i flytende nitrogen.
Forsiktig: Husk at flytende nitrogen er ekstremt kaldt. Feil håndtering kan forårsake brannskader. Bruke riktig personlig verneutstyr, inkludert termisk isolert hansker, beskyttende briller og en labfrakk.
2. Trykk protokollen
Merk: Følgende trinn er tilpasset fra Maeda et al. 201411 og Van Leene et al. 201117.
- Homogenize høstes og frosne plante celle kultur materiale med en mikser mill (2 min til 20 Hz) eller morter for å skaffe fint pulver. Aliquot 3 g av bakken materialet (tilsvarende rundt 90 mg totale protein) per prøve. Unngå tiner prøven i dette trinnet ved hjelp av flytende nitrogen pre kjølt utstyr.
Merk: Store bakken plantemateriale i 50 mL tube ved –80 ° C til begynnelsen av en AP-prosedyre. - Triturate prøven i en flytende-nitrogen-forkjøles og lagres morter med 3 mL iskald lyseringsbuffer (0.025 M Tris-HCl pH 7,5; 0,5 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT; 1 mM NaF; 1 mM Na3VO4; 100 x utvannet kommersielle protease hemmer cocktail, 1 mM PMSF) til materialet thaws. Når prøven thaws, umiddelbart videre til neste trinn.
Merk: Forberede lysis buffer frisk. Presentere tom prøver på dette trinnet. Rengjøringsmiddel anbefales ikke som de kan forårsake problemer i MS gjenkjenning. - Hvis du vil fjerne mobilnettet rusk, dele materialet i 2 mL microcentrifuge rør og sentrifuge 20,817 x g for 10 min på 4 ° C. Samle 3 mL den klare lysate i et 15-mL konisk sentrifuge rør.
- Under sentrifugering trinn, equilibrate IgG-Sepharose perler. Aliquot 100 µL av perler per prøve og vaske dem med 1 mL av lyseringsbuffer. Vortex å resuspend perler og flash-spinn. Forkast lyseringsbuffer og gjenta trinnet to ganger. Resuspend perler i 400 µL av lyseringsbuffer.
- Legge perler til samlet anlegget lysate og ruge blandingen på et roterende hjul 1t på 4 ° C.
- Overføring blandingen til en sprøyte kombinert via Luer-lock cap spinn kolonnen med filter pore størrelse 35 µm. Bruk press for å passere i lysate gjennom. Perler med vedlagte komplekser forblir på filteret, mens de lysate vil gå gjennom.
Merk: Alternativt kan du bruke et manifold system. Lage bestemt å bruke lett trykk for ikke å skade perler. - Vask perler på første med 10 mL vaske bufferen (0.025 M Tris-HCl pH 7,5; 0,5 M NaCl), og deretter med 1 mL av elueringsbufferen (10 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1000 x utvannet E64 og 1 mM PMSF). Utføre vask bruker en sprøyte som er knyttet til kolonnen eller manifold vakuumsystem.
Merk: Når bruke et manifold system kontroller bruke lett trykk for ikke å skade perler. - Inkuber perler med 400 µL av elueringsbufferen som inneholder 50 U av en forbedret versjon av tobakk etse virus (AcTEV) protease. Bruk tabellen shaker på 1000 rpm i 30 min på 16 ° C.
Merk: Husk å bruke en plugg for å lukke kolonnen nederst legge elueringsbufferen. - Legge til en ekstra del (50 U) av enzymet i kolonnen og ruge blandingen for de neste 30 min under samme, beskrevet ovenfor, forhold.
- Samle eluate i en 2 mL microcentrifuge rør ved sentrifugering (1 min, 20,817 x g) eller vakuum manifold. For å fjerne gjenværende komplekser, innføre et ekstra elueringsrør steg med 200 µL av elueringsbufferen.
Merk: Oppbevar prøven på –20 ° C eller –80 ° C, eller gå rett til protein og metabolitten utvinning trinn. Tine frosne prøvene på is.
3. Western Blot analyse
- For å bekrefte tilstedeværelse av agnet bruke protein i de innsamlede eluate 10 µL av protein-metabolitten inneholder eluate for å utføre SDS-side og western blot analyse. For å identifisere protein av interesse, kan du bruke musen primære antistoffer mot streptavidin-binding protein (1:200), en del av trykk koden igjen etter TEV protease cleavage, som beskrevet i Van Leene et al. 201117. Deretter Bruk sekundære geit anti-muse-antistoffer kombinert med HRP.
4. metabolitten og Protein utvinning
Merk: Denne protokollen er tilpasset fra Giavalisco et al. 201116.
Merk: Dette trinnet videre bruk UPLC-MS-grade løsninger.
- Legge 1 mL av methyl tert-butyl Eter (MTBE) / metanol/vann løsemiddel (3:1:1) til den innsamlede eluate og bland prøven ved inversjon. Kontroller at løsemiddelet er avkjølt –20 ° c før utvinning trinnet.
Advarsel: MTBE og metanol er skadelige stoffer. Utfør trinn utvinning under avtrekksvifte og bruke riktig personlig verneutstyr, f.eks hansker. - Legg 0,4 mL metanol: vann 1:3 løsning til hvert utvalg og bland innholdet i prøven ved inversjon.
Merk: Tilskudd av blandingen med metanol: vann resulterer i fase separasjon. Den øvre fasen inneholder lipider, lavere fase inneholder polar og semi polar metabolitter og proteiner finnes i pellet. - Separate faser, sentrifuge prøven 20,817 x g i 2 minutter ved romtemperatur, og deretter samle den øvre fasen for lipid målinger (ikke gjort i denne protokollen) bruker en manuell flytende håndtering pipette med 1 mL volumkapasitet.
- Legge til 0,2 mL metanol og bland ved inversjon.
- Sentrifuge prøven 20,817 x g i 2 minutter på RT, deretter samle polar fasen for metabolitten målinger (polar og semi polare forbindelser). For å unngå å forstyrre protein pellet, la rundt 50 µL av flytende fase nederst på røret.
- Tørr innsamlede eksemplene for metabolitten målinger over natten i en sentrifugal fordamperen. Unngå over tørking protein pellets ved å fjerne prøver fra fordamperen etter 30-60 minutter.
Merk: Lagre prøver –20 ° C eller –80 ° C, eller gå rett med utarbeidelse av proteiner for LC--MS-/ MS analyse.
5. forbereder prøver Proteomic analyse
Merk: Dette trinnet er tilpasset fra Olsen et al. 200419 og den teknisk håndboken Trypsin/Lys-C Mix (se Tabell for materiale).
- Utføre enzymatisk fordøyelsen av prøven.
Forsiktig: Løsemidler brukes under enzymatisk fordøyelsen avsalte av utvalget er skadelig. Arbeid under avtrekksvifte og bruke riktig personlig verneutstyr, f.eks hansker.- Oppløse protein pellet i 30 µL av nylagde rødsprit buffer (40 mM ammonium bikarbonat inneholder 2 M thiourea/6 M urea, pH 8). For å oppnå bedre protein løselighet, utføre en 15 minutters sonication trinnet. Gjenta trinnet til pellet oppløses.
- Sentrifuge prøven 20,817 x g i 10 min på 4 ° C, deretter overføre nedbryting til en ny microcentrifuge tube.
- Bestemme protein konsentrasjon bruke Bradford protein analysen.
- For ytterligere analyse, aliquot like 100 µg protein og fyll utvalget inntil 46 µL med rødsprit buffer.
- Legg til i eksempel 2 µL av nylagde reduksjon buffer (50 mM DTT oppløst i H2O) og ruge i 30 min ved romtemperatur.
- Behandle utvalget med 2 µL av ferskt tilberedte alkylation buffer (150 mM iodoacetamide oppløst i 40 mM ammonium bikarbonat buffer) og ruge blandingen i mørket 20 min ved romtemperatur.
- Fortynne prøven med 30 µL 40 mM ammonium bikarbonat bufferen og legge til 20 µL LysC/Trypsin mix.
- Etter 4 h inkubasjon på 37 ° C fortynne prøven med 300 µL av 40 mM ammonium bikarbonat buffer.
- Fortsette med overnatting inkubasjon på 37 ° C.
- Syre prøven med ca 20 µL av 10% trifluoroacetic acid (TFA) å få pH < 2. Sjekk prøven pH med en pH stripe.
Merk: Lagre prøven ved –20 ° C eller fortsette til neste trinn.
- Desalt fordøyd proteiner.
Merk: Bruk helst et manifold system. Unngå over tørking av kolonnen.- Skyll kolonnen C18 SPE (se Tabell for materiale) med 1 mL av 100% MeOH og deretter med 1 mL av 80% acetonitrile (ACN) som inneholder 0,1% TFA fortynnet i vann. Bruk her og i ytterligere protein-avsalte trinn, et manifold system å fremskynde prosessen. Unngå over tørking av kolonnen.
- Equilibrate kolonnen spylt to ganger med 1 mL av 0,1% TFA fortynnet i vann.
- Laste inn prøven på kolonnen. Skyll rør med ytterligere 200 µL av 0,1% TFA og overføre løsningen på kolonnen. Kjøre løsningene gjennom kolonnen.
- Vask kolonnen to ganger med 1 mL av 0,1% TFA.
- Elute avsalte peptider fra kolonnen med 800 µL 60% ACN, 0,1% TFA løsning. Tørr samlet brøken i en sentrifugal fordamperen, unngå over tørking av protein fraksjon ved å fjerne prøver fra fordamperen etter 30-60 minutter.
Merk: Lagre prøver –20 ° C eller –80 ° C eller umiddelbart videre til neste trinn. I de etterfølgende trinnene, holde prøvene på is.
6. målingen utarbeidet Protein prøver ved UPLC--MS-/ MS.
Merk: Før proteomic og metabolomic målinger, filtrere (0,2 µm porestørrelse) og degas alle buffere bruk av en vakuumpumpe 1t.
- Resuspend tørket peptid pellet lagret i 2 mL microcentrifuge tube i 50 µL av buffer C (3% v/v ACN, 0,1% v/v maursyre) bruker manuell flytende håndtering pipette med 200 µL volumkapasitet. Sonicate prøver for en 15 min i ultralydbad med 35 kHz Ultralydutstyr frekvens.
Forsiktig: ACN og maursyre er skadelige stoffer. Arbeid under avtrekksvifte og bruke riktig personlig verneutstyr, f.eks hansker. - Sentrifuge prøven 20,817 x g i 10 min på 4 ° C, deretter overføre 20 µL nedbryting av til en hetteglass.
- Separat fordøyd peptider bruker en C18 reverseres-fase kolonne koblet til en flytende kromatografi og få masse spectra med en masse spectrometer.
- Separat i kolonne 3 µL av prøven ved hjelp av en 300-nl/min flow rate. En mobil fase, bruke buffer C og D (63% v/v ACN, 0,1% v/v maursyre) danner en forløpning gradvis fra 3% ACN 15% ACN over 20 min og deretter til 30% ACN over de neste 10 min.
Merk: Oppbevar resten av utvalget på –20 ° C eller –80 ° C til månedene. Før proteomic måling, refreeze prøven på is. - Bleke forurensninger i 10 min bruker 60% ACN og equilibrate kolonnen med 5 µL bufferen C før måling av neste prøven.
- Få masse spectra data-avhengige MS-/ MS metoden med oppløsning satt til 70.000, AGC målet 3e6 ioner, maksimal injeksjon tid på 100 ms og en m/z varierer fra 300 til 1600. Få maksimalt 15 MS-/ MS skanner på en oppløsning på 17,500, AGC målet 1e5, maksimal injeksjon tid på 100 ms, underfill forholdet mellom 20%, med en isolert vindu på 1,6 m/z og m/z spenner fra 200 til 2000. Aktiver apex utløser (6 – 20 s), angi dynamisk utestenging til 15 s, og utelate kostnader til 1 og > 5.
- Separat i kolonne 3 µL av prøven ved hjelp av en 300-nl/min flow rate. En mobil fase, bruke buffer C og D (63% v/v ACN, 0,1% v/v maursyre) danner en forløpning gradvis fra 3% ACN 15% ACN over 20 min og deretter til 30% ACN over de neste 10 min.
7. behandling av Proteomic Data
- Laste ned den nyeste Arabidopsis thaliana proteom databasen fra http://www.uniprot.org/ og inkluderer miljøgifter databasen. Analysere rådata fra LC-MS kjører med MaxQuant med integrert Andromeda peptid søkemotor bruker standardinnstillingen med aktivert LFQ normalisering20,21,22. Finne detaljert informasjon om parameterne som brukes i Tabellen S1.
- Åpne filen "protein groups.txt" utgang. For ytterligere analyse, filtrere etter protein grupper med minst to unike peptider. Fjerne protein grupper definert av MaxQuant som potensielle miljøgifter og filter for A. thaliana proteiner (ARATH i Fasta hoder kolonnen) i databasen.
- For å teste betydningen av protein berikelse mellom prøvene, bruk LFQ normalisert intensitet og utføre hender, tosidige Student t-test etterfulgt av flere sammenligning korreksjon (f.eks Benjamini og Hochberg false oppdagelsen rate (FDR) korreksjon eller Bonferroni korreksjon).
- Beregne p-verdi ved å sammenligne LFQ intensiteter innhentet for EV kontroll og NDPK1. Filtrere ut alle ubestemt verdier. P-verdier i stigende rekkefølge og bruke R skript eller online kalkulator (f.eks https://www.sdmproject.com/utilities/?show=FDR) til å beregne FDR korreksjon. Filtrere FDR verdier under 0.1.
Merk: Vurdere form av dataanalyse egnet for forskning. Kvantitative studier (analyse av protein berikelse mellom prøvene) bruke "LFQ intensitet" verdi, mens kvalitativ forskning (tilstedeværelse eller fravær av spesielle proteinet) Velg "Intensitet" verdien. - Filtrere protein grupper som er mer rikelig i NDPK1 sammenligne EV kontroll. Avgjøre lokaliseringen av potensielle protein partnere bruker en SUBA database23 og riktig for protein Co-lokalisert med NDPK1.
- Beregne p-verdi ved å sammenligne LFQ intensiteter innhentet for EV kontroll og NDPK1. Filtrere ut alle ubestemt verdier. P-verdier i stigende rekkefølge og bruke R skript eller online kalkulator (f.eks https://www.sdmproject.com/utilities/?show=FDR) til å beregne FDR korreksjon. Filtrere FDR verdier under 0.1.
8. måling av prøver som inneholder Polar fase med UPLC-MS.
- Resuspend tørket polar fase fra trinn 4.5 i 200 µL av vann og sonicate utvalget for 5 min.
- Sentrifuge prøven 20,817 x g i 10 min på 4 ° C, deretter overføre nedbryting til et hetteglass.
Merk: Oppbevar resten av utvalget på –20 ° C eller –80 ° C i opptil flere måneder. Før metabolomic måling, refreeze prøven på is. - Utføre en separasjon trinnet med UPLC koblet til C18 reverseres-fase kolonne og få masse spectra med MS.
- Laste inn kolonne 2 µL av utvalget per injeksjon for hver ionisering modus (positive og negative) og skille brøken bruker 400 µL/min strømningshastighet. For å opprette nødvendige graderingen for metabolitten måling, forberede mobile fase løsning som følger: bufferen er en (0,1% maursyre i H2O) og buffer B (0,1% maursyre i ACN).
- Separat metabolitter på 400 µL/min og følgende graderingen: 1 min 99% av buffer A, 11-min lineær gradient fra 99% av buffer A til 60% av buffer A, 13-min lineær gradient fra 60% av buffer A til 30% av buffer A, 15 minutter lineær gradient fra 30% av buffer A til 1% bufferen A, hold 1% konsentrasjon til 16 min. fra 17 min, bruk lineær gradient fra 1% av buffer A til 99% av buffer A. re equilibrate kolonnen for 3 min med 99% konsentrasjon av bufre A før måling av neste prøven.
- Få masse spectra dekker massen utvalg mellom 100 og 1500 m/z med oppløsning satt til 25.000 og lastetiden er begrenset til 100 ms. satt AGC mål til 1e6, kapillære spenning til 3kV med en kappe gass flyt og auxiliary gass verdien av 60 og 20 , henholdsvis. Angi kapillær temperaturen til 250 ° C og skimmer spenning til 25V.
9. behandling av Metabolomics Data
- Prosessen samlet chromatograms fra både ionisering moduser. Bruk programvare for å ekstra mass ansvaret forholdet (m/z), tiden (RT) og intensiteten av tilknyttede topper, f.eks kommersiell programvare (se Tabell for materiale) eller alternativ24.
- Start behandling programmet ved å dobbeltklikke det .exe arkiv
- Opprett ny arbeidsflyt, Søk etter aktivitet "Last fra fil" og flytte denne aktiviteten av "dra og slipp" inn i det tomme arbeidsflyt. Trykk aktiviteten med høyre museknapp og åpne innstillinger for aktiviteten.
- I kategorien som inneholder "Generelt" innstillinger, angi et navn på eksperimentet i "Navn"-feltet Neste klikk "Velg fil-størrelse og brosjyre" og markere rå chromatograms.
- I kategorien som inneholder "Avansert" satt "Profil Data Cutoff" til 0 intensitet. Klikk "Apply" og "OK".
- Søke etter og legge til aktivitet "Data feie". Trykk aktiviteten med høyre museknapp og åpne innstillinger for aktiviteten.
- I kategorien som inneholder innstillinger for "Generelt" Merk "Centroid" og "MS-/ MS Data". Fjerne alle MS-/ MS data ved å velge "Alt" i valg-panelet.
- Søke etter og legge til aktiviteten "Chromatogram kjemiske støy subtraksjon". Trykk aktiviteten med høyre museknapp og åpne innstillinger for aktiviteten.
- I kategorien som inneholder innstillinger for "Generelt" merker "Chromatogram utjevning" og angi antall søk "3" og "Estimator" til "Glidende gjennomsnitt". Angi "RT vindu" 51 skanner, "Quantile" til 50%, subtraksjon "Metoden" og 750 intensitet "Terskelen".
- I kategorien som inneholder "Avansert" merke "RT strukturen fjerning" og sett "Minimum RT lengde" til 5 skanninger.
- I kategorien som inneholder "avanserte" merke "m/z strukturen fjerning" og sett "Minimum m/z lengde" til 3 poeng.
- Søke etter og legge til aktiviteten "Chromatogram RT justering". Trykk aktiviteten med høyre museknapp og åpne innstillinger for aktiviteten.
- I kategorien som inneholder innstillinger for "Generelt" satt "Justering ordningen" å "Parvis justering Base Tree" og "RT Søkeintervall" til 0,5 min.
- Bruk standardparametere i kategorien som inneholder "Avansert".
- Søke etter og legge til aktiviteten "Peak oppdagelsen" i "Chromatogram" gruppe av aktiviteter. Trykk aktiviteten med høyre museknapp og åpne innstillinger for aktiviteten.
- I kategorien som inneholder innstillinger for "Generelt" satt "Summering vindu" til 0.09 min, "Minimum Peak størrelse" til 0,03 min, "Maksimal flette avstand" 5 poeng og "Flette strategi" til "Centers". I "Topp RT kløyvingen" samleboks "Gap/topp forhold" til 50%.
- I kategorien som inneholder "Avansert" satt "Utjevning vindu" til 5 poeng, "Raffinement terskelen" til 80% og "Konsistens terskelen" til 1. Angi "Center beregning" som "Intensitet-vektet" med "Intensitet terskelen" satt på 70%.
- Søke etter og legge til aktiviteten "Isotop klynger" i "Chromatogram" gruppe av aktiviteter. Trykk aktiviteten med høyre museknapp og åpne innstillinger for aktiviteten.
- I kategorien sett inneholder "Generelt" innstillinger, "RT toleranse" 0.015 min og "m/z toleranse" til 5 ppm.
- I kategorien angi inneholder "Konvolutt passende" innstillinger, "Metoden" som "No figur restriksjoner" og "Ionisering" "Protonation (for positiv modus) og"Deprotonering"(for negative modus). Sett "Minimum og maksimum lade" til 1 og 4, henholdsvis.
- Bruk standardparametere i kategorien som inneholder "Avansert".
- Søke etter og legge til aktivitet "Singleton Filter".
- For å eksportere resultatene av databehandling, søke etter og legge til aktiviteten "Analytiker" i "Export" gruppe av aktiviteter.
- I kategorien som inneholder "Generelt" innstillinger, angi "Type" som "Klynger" og "Observerbare" som "Oppsummerte intensitet". Velg "Tilpasset destinasjon" og angi mappen i eksportfilen.
- Bruk standardparametere i kategorien som inneholder "Avansert".
- Kommentere masse funksjoner bruker interne referanse-sammensatte database.
- Analysere ett eller flere MS klasse referanse-sammensatte bruker UPLC-MS. Bruk samme LC-MS metode for analyse av referanse-forbindelser og metabolitter co renset med protein av interesse.
Merk: For denne studien, var et sett med nesten 300 dipeptides analysert og brukes som referanse-sammensatt bibliotek. - Bruk analyse (se Tabell for materiale) programvare for å åpne rå chromatogram filen og søke for bestemte m/z og RT tilknyttet målt referanse-sammensatte (se brukerhåndboken).
Merk: Sekundær metabolitter forskjellige typer ionisering. Sjekk for tilstedeværelsen av felles addukter ved å søke etter ion masse lik M-1.007276, M + 1.007276, M + 18.033823 og M + 22.989218 [M-h], [M + H], [M + NH4] og [M + Na], henholdsvis. - Bruk regneark åpne eksportert "Analytiker" filen etter behandling av chromatograms og søk etter bestemte ion masse. Sammenligne RT av funksjonen masse målt i eksperimentet og RT av referanse sammensatte. Tillat et avvik 0.005 Da for m/z og 0,1 min for RT.
- Analysere ett eller flere MS klasse referanse-sammensatte bruker UPLC-MS. Bruk samme LC-MS metode for analyse av referanse-forbindelser og metabolitter co renset med protein av interesse.
- For å teste betydningen av metabolitten berikelse co renset med spesielle proteinet mellom eksempler (linje med overexpressed protein interesse vs EV kontroll), sammenligne toppbelastning verdier ved hjelp av tosidige ikke sammenkoblet Student t-test etterfulgt av flere sammenligning korreksjon (f.eks Benjamini & Hochberg false oppdagelsen rate korreksjon eller Bonferroni korreksjon).
Representative Results
I den opprinnelige studien, tre A. thaliana NDPK gener var overexpressed i PSB-L cellekulturer suspensjon under kontroll av den grunnleggende 35S promoter14 (figur 1). Tandem affinitet koden var smeltet enten carboxy - eller amino-terminal slutten av et protein som agn. Affinitet-renset komplekser ble utsatt for MTBE/metanol/vann utvinning16. Affinitet, trakk proteiner og små molekyler ble identifisert med MS (tabeller S2 og S3).
Til rette for falske positiver, ble tom prøver brukt til å utelate små molekyl forurensninger fra kjemikalier og laboratoriet forbruksvarer. Videre var metabolitter og proteiner som binder til enten en affinitet kode eller harpiks alene rede for ved hjelp av EV kontrollinjer. For å hente sant positive, tosidige ikke sammenkoblet Student t-test og Benjamini og Hochberg false oppdagelsen rate ble korreksjon brukt til å identifisere metabolitter (Tabell S4) og proteiner (Tabell S5) betydelig beriket i NDPKs AP eksperimenter (N - og C-terminalt merket NDPKs) i forhold til EV kontrollen linjer (FDR < 0.1). Merk at i tidligere arbeid, vi fravær/tilstedeværelse kriterier for å avgrense protein og små-molekylet interaktører.
Representant resultatene er angitt for NDPK1, mens metabolitten data fokuserer på dipeptides, en roman klasse av små-molekylet regulatorer i vår gruppe. Proteomic analyse viste 26 antatte protein partnere av NDPK1. Ved ytterligere filtrering for proteiner Co lokalisert i samme subcellular rommet som NDPK1 (stoffer) listen snevret ned til 13 antatte protein interaktører. Blant de identifiserte proteinene var glutation S-transferase, to forlengelse innvielsen faktorer, tubulin og aconitate hydratase. Metabolomic analyse viste fire dipeptides Val-Leu, Ile-Glu, Leu-Ile og Ile-Phe som spesielt co elut med NDPK1 (figur 2). Merk at alle fire dipeptides dele en hydrofobe rester i sin N-terminus, tyder delte bindende spesifisitet.
Se etter kjente protein-protein og protein-metabolitten komplekser vi identifisert spurte 13 proteiner og fire dipeptides mot Stitch databasen25 (Figur 3). Flere observasjoner kunne gjøres: (i) ingen av interaktører tidligere rapportert for NDPK1. (ii) APX1 ortholog ble rapportert å samhandle med aldehyd dehydrogenase slekt medlem ALDH7B4, mens oversettelse initiering faktor FBR12 med en annen oversettelse initiering faktor kodet av genet AT2G40290. (iii) identifisert dipeptides har ikke rapportert protein partnere. Co elut dipeptides ble ikke rapportert tidligere som knyttet til alle hentede planteprotein. Men de spiller viktige roller i andre organismer: Leu-Ile, f.ekshar en neurotrophin-aktivere effekt i en human celle linje26. Merk at eksperimentet ikke tillater identifisere nøyaktig topologien for systemet. For eksempel en dipeptide kan samhandle direkte med NDPK1, men kan også være relatert til noen av co renset proteiner.
Samlet våre resultater viser at den etablerte prosedyren, ansette AP sammen med massespektrometri, forenkler identifikasjon av protein-protein og protein-liten-molekylet interaktører og hjelper generere omfattende informasjon om den interactome av målet protein.
Figur 1. Ordningen av AP-MS arbeidsflyt. (A) utarbeidelse av en innfødt løselig brøkdel fra anlegget cellekultur. (B) neste skritt i AP prosedyren. Etter lasting prøven på kolonnen, binder protein av interesse (POI) smeltet til et trykk merke til IgG-antistoffer immobilisert på agarose perler. Vask av kolonnen forenkler fjerning av ubundet proteiner og metabolitter. Etter utfører AcTEV cleavage, er POI protein-metabolitten komplekser elut. (C) separasjon av komplekser i protein og metabolitten brøkdel etterfulgt av semi kvantitative MS analyse. Del av dette tallet er gjengitt fra Luzarowski et al. 201714. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Dipeptides spesielt co eluting med NDPK1. Gjennomsnittlig intensiteter av fire dipeptides Val-Leu (A), Ile-Glu (B), Leu-Ile (C)og Ile-Phe (D) målt i AP eksperimentet var plottet. Alle fire dipeptides viser betydelig berikelse i NDPK1 prøver i forhold til EV kontroll (stjerner representerer FDR < 0.1). Feilfelt representerer standardfeil for 6 målinger (3 gjenskapninger av N- og 3 C-terminalt merket proteiner). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Samhandling nettverk av alle molekyler co eluting med NDPK1, spørres mot STITCH database vurderer bare tidligere eksperimentelle og databasen bevis (tillit > 0,2). Høyere angir høyere sjansene for samhandling og beregnes basert på datatypen avsatt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell S1. MaxQuant utgang tabell "parameters.txt". Tabell inneholder terskelverdier for identifikasjon og kvantifisering, samt informasjon om databaser brukes. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tabell S2. Informasjon fra MaxQuant utgang tabell "proteinGroups.txt". Tabellen inneholder en liste over alle identifiserte protein grupper, intensitet og ekstra informasjon som antall unike peptider og score. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tabell S3. Utdatafilen inneholder analyse av polar metabolitter. Tabellen inneholder en liste over alle identifiserte masse funksjoner preget av bestemte m/z, RT og intensitet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tabell S4. Dipeptides funnet i AP eksempler der NDPK1, NDPK2 og NDPK3 ble brukt som agn. Dipeptides i tomme prøver ble ekskludert fra listen. To uavhengige linjer (merket i enten N - eller C-terminus) for hver NDPK ble kjørt i tre eksemplarer. Student t-test og ytterligere korrigering av p-verdi ved hjelp av Benjamini & Hochberg-metoden ble brukt til å bestemme betydelig beriket interactor partnere av NDPKs (FDR < 0.1). Gitt beregnes ΔRT referanse forbindelser og Δppm i forhold til monoisotopic masse gitt i Metlin27. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tabell S5. Proteiner co renset med NDPK1. To uavhengige linjer (merket i enten N - eller C-terminus) for hver NDPK ble kjørt i tre eksemplarer. Student t-test og ytterligere korrigering av p-verdi ved hjelp av Benjamini & Hochberg-metoden ble brukt til å bestemme betydelig beriket interactor partnere av NDPKs (FDR < 0.1). Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Presentert protokollen tillater parallelle identifikasjon av PP og PM komplekser av et mål protein. Fra kloning endelige resultater, kan eksperimentet være ferdig i så lite som 8-12 uker. Komplett AP tar ca 4-6 h for et sett med 12 til 24 prøver, rendering våre protokollen egnet for midten av gjennomstrømning analyse.
Protokollen, selv generelt grei, har en rekke viktige trinn. (i) tilstrekkelig mengde input protein og affinitet perler er avgjørende for å nå et dynamisk område metabolitten gjenkjenning. Effektiv celle lysis er derfor et viktig skritt i prosedyren. Dårlig protein avlinger kan være en konsekvens av utilstrekkelig pulverisering av materialet eller suboptimal lysis-buffer/materielle forhold. (ii) forsiktighet bør utvises at brukte reagenser er MS-vennlig. Sterk vaskemidler, glyserol eller store mengder salt bør unngås så de forstyrre MS gjenkjenning. (iii) Agarose perler bør ikke være over tørket under vaske trinn, og når du bruker en vakuum manifold er det viktig å bruke en langsom flow rate for ikke å ødelegge perler eller påvirke komplekse stabilitet.
Det er noen viktige endres til presentert protokollen: (i) vi bruker konstituerende CaMV35S selskapet for å maksimere mengden av agn protein. Overuttrykte, kan mens svært nyttig, ha alvorlige virkninger på cellen homeostase28 og føre til dannelse av fysiologisk irrelevante interaksjoner. Uttrykk for merket proteiner innfødt arrangører og hvor mulig i en tap-av-funksjon-bakgrunn anses overlegen for å hente ekte biologiske interaktører. For proteiner normalt ikke uttrykt i cellekulturer plante, kan plante bakgrunn være nødvendig å identifisere relevante interaktører. (ii) når du arbeider med membran proteiner, må lyseringsbuffer suppleres med en MS-kompatible vaskemiddel. (iii) innføring av andre affinitet-rensing trinnet kan forbedre falske positiver sann-positive forhold og eliminere behovet for EV kontroller29. En roman tandem kode med to uavhengige protease-cleavage områder presenterer et attraktivt alternativ til størrelse-utestenging kromatografi trinn lagt til av Maeda et al. 201411, som er både arbeidskrevende og tidkrevende.
De mest alvorlige ulempen av AP er høyt antall falske positiver. Årsakene er mange. Grunnleggende overuttrykte var allerede nevnt. En annen kilde til fysiologisk irrelevante interaksjoner, er med mindre arbeider med isolert organeller, utarbeidelsen av hele celler lysates som inneholder blandinger av proteiner og metabolitter fra ulike subcellular rom. Subcellular lokalisering bør brukes til å filtrere etter ekte interaktører. Likevel, fleste av falske positiver resultat uspesifikke binding mellom proteiner og agarose harpiks. Innføring av andre rensing trinnet, som beskrevet ovenfor, tilbyr den beste løsningen på problemet, men kommer på bekostning av tid og gjennomstrømning. Videre kan svakere samhandling gå tapt som protokollen forlenger. En annen påminnelse av AP er at til tross for omfattende informasjonen den gir om interactome av et protein som mål, skille mellom direkte og indirekte mål av agnet protein er umulig. Målrettede resultatet av dette tilnærminger for å bekrefte interaksjoner.
AP kombinert med baserte metabolomics ble brukt til å studere protein-komplekser i S. cerevisiae12. Dette arbeidet, sammen med våre tidligere observasjon13 , tilsvarende til lipider, polar og semi polare forbindelser forblir bundet til protein komplekser isolert fra mobilnettet lysates, gitt konseptuelle grunnlaget for presentert protokollen. Våre protokollen er preget av tre unike punkter: (i) i motsetning til gjær strikk12, det viser at AP er egnet for å hente ikke bare hydrofobe men også hydrofile protein ligander. (ii) ved å introdusere en tre-i-ett utvinning protokoll, kan et enkelt Tilgangspunkt brukes å studere protein og metabolitten interaktører av agn protein. (iii) vi tilpasset protokollen for å plante celler.
Arbeidet vil fokusere på å lage en roman tandem kode med to uavhengige protease-cleavage steder. Vi ønsker også å utforske egnetheten av protokollen til lav-overflod små molekyler som plantehormoner.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å erkjenne vennlige Prof. Dr. Lothar Willmitzer for hans engasjement i prosjektet, produktiv diskusjoner og god veiledning. Vi er takknemlige for Dr. Daniel Veyel for å hjelpe med proteomic MS målinger. Vi setter pris på fru Änne Michaelis som ga oss uvurderlig teknisk hjelp LC-MS målinger. Videre vil vi gjerne takke Dr. Monika Kosmacz og Dr. Ewelina Sokołowska for deres hjelp og engasjement i arbeidet på den opprinnelige manuskriptet til Weronika Jasińska for kundestøtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics | Sigma-Aldrich | M6899 | |
| 1-Naphthylacetic acid | Sigma-Aldrich | N1641 | |
| Kinetin solution | Sigma-Aldrich | K3253 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| MgCl2 | Carl Roth | 2189.1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
| NaF | Sigma-Aldrich | S6776 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| E-64 protease inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| AcTEV Protease | Thermo Fischer Scientific | 12575015 | |
| Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.2 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fischer Scientific | 26616 | |
| SBP Tag Antibody (SB19-C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-101595 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| MTBE | Biosolve | 138906 | |
| Methanol | Biosolve | 136806 | |
| Water | Biosolve | 232106 | |
| Acetonitrile | Biosolve | 12006 | |
| Trifluoroacetic acid | Biosolve | 202341 | |
| Formic acid | Biosolve | 69141 | |
| Unimax 2010 Platform Shaker | Heidolph | 5421002000 | |
| Nylon Mesh (Wire diameter 34 µM, thickness 55 µM, open area 14%) | Prosepa | Custom order | |
| Glass Funnel, 47 mm, 300 ml | Restek | KT953751-0000 | |
| Filter Bottle Top 500 mL 0,2 µM Pes St | VWR International GmbH | 514-0340 | |
| Mixer Mill MM 400 | Retsch GmbH | 207450001 | |
| IgG Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0969-02 | |
| Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filters | MoBiTec GmbH | M1002 | |
| Filter (small) 35 µM pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053 | MoBiTec GmbH | M513515 | |
| Variable Speed Tube Rotator SB 3 | Carl Roth | Y550.1 | |
| Rotary dishes for rotators SB 3 | Carl Roth | Y555.1 | |
| Resprep 24-Port SPE Manifolds | Restek | 26080 | |
| Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml | Teknokroma | TR-F034000 | |
| Autosampler Vials | Klaus Trott Chromatographie-Zubehör | 40 11 01 740 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 LC Column | Thermo Fischer Scientific | 164534 | |
| EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | Thermo Fischer Scientific | LC120 | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fischer Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Acquity UPLC system | Waters | Custom order | |
| ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg | Waters | 186003533 | |
| High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions | Bandelin | RK 31 | |
| Genedata Expressionist | Genedata | NaN | |
| Xcalibur Software | Thermo Fischer Scientific | NaN | |
| MaxQuant | NaN | NaN |
References
- Li, X., Snyder, M. Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation. Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).
- Schlattner, U., et al. Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).
- Ramírez, M. B., et al. GTP binding regulates cellular localization of Parkinson's disease-associated LRRK2. Human Molecular Genetics. , ddx161 (2017).
- Jung, H. J., Kwon, H. J. Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery. Archives of Pharmacal Research. 38 (9), 1627-1641 (2015).
- Harding, M. W., Galat, A., Uehling, D. E., Schreiber, S. L. A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase. Nature. 341 (6244), 758-760 (1989).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
- Manabe, Y., Mukai, M., Ito, S., Kato, N., Ueda, M. FLAG tagging by CuAAC and nanogram-scale purification of the target protein for a bioactive metabolite involved in circadian rhythmic leaf movement in Leguminosae. Chemical Communications. 46 (3), 469-471 (2010).
- Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. Journal of Biomolecular Screening. 6 (6), 429-440 (2001).
- Li, X., Snyder, M. Analyzing In vivo Metabolite-Protein Interactions by Large-Scale Systematic Analyses. Current Protocols in Chemical Biology. , 181-196 (2010).
- Maeda, K., Poletto, M., Chiapparino, A., Gavin, A. -C. A generic protocol for the purification and characterization of water-soluble complexes of affinity-tagged proteins and lipids. Nature Protocols. 9 (9), 2256-2266 (2014).
- Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M., Snyder, M. Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses. Cell. 143 (4), 639-650 (2010).
- Veyel, D., et al. System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants. Scientific Reports. 7, (2017).
- Luzarowski, M., et al. Affinity purification with metabolomic and proteomic analysis unravels diverse roles of nucleoside diphosphate kinases. Journal of Experimental Botany. , (2017).
- Van Leene, J., et al. Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana. Molecular systems biology. 6 (1), 397 (2010).
- Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using 13C, 15N and 34S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).
- Van Leene, J., et al. Isolation of transcription factor complexes from Arabidopsis cell suspension cultures by tandem affinity purification. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 195-218 (2011).
- Van Leene, J., et al. A tandem affinity purification-based technology platform to study the cell cycle interactome in Arabidopsis thaliana. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (7), 1226-1238 (2007).
- Olsen, J. V., Ong, S. -E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular & Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301 (2016).
- Hooper, C. M., et al. SUBAcon: a consensus algorithm for unifying the subcellular localization data of the Arabidopsis proteome. Bioinformatics. 30 (23), 3356-3364 (2014).
- Katajamaa, M., Orešič, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. Journal of Chromatography A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Szklarczyk, D., et al. STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data. Nucleic Acids Research. 1277, (2015).
- Tanaka, K. -i, et al. Dipeptidyl compounds ameliorate the serum-deprivation-induced reduction in cell viability via the neurotrophin-activating effect in SH-SY5Y cells. Neurological Research. 34 (6), 619-622 (2012).
- Smith, C. A., et al. METLIN: A metabolite mass spectral database. Therapeutic Drug Monitoring. 27, 747-751 (2005).
- Bhattacharyya, S., et al. Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity. Elife. 5, (2016).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
