Summary
Défi jeunes neurones dans de nouvelles régions de cerveau peut révéler des renseignements importants sur comment l’environnement sculpte la maturation et le sort neuronale. Ce protocole décrit un procédé pour récolter les précurseurs des interneurones de certaines régions du cerveau et les transplanter soit homotopically ou isotransplantation dans le cerveau des petits après la naissance.
Abstract
Maturation et détermination neuronale sort nécessite une interaction complexe entre des programmes génétiques et signaux environnementaux. Cependant, démêler les rôles d’intrinsèque contre les mécanismes extrinsèques qui régulent ce processus de différenciation est une énigme pour tous les neurobiologistes du développement. Ce problème est amplifié pour les interneurones GABAergiques, une population de cellules incroyablement hétérogène qui naît de structures embryonnaires transitoires et subir une phase prolongée migrateur de se disperser dans le télencéphale. Pour découvrir comment différents cerveau environnements affect interneurone sort et la maturation, nous avons développé un protocole pour la récolte des interneurones immatures fluorescent étiquetés précurseurs de certaines régions du cerveau chez des souris nouveau-nées (P0-P2). À cet âge, migration interneurone est presque terminée et ces cellules sont résidant dans leurs environnements de repos finales avec relativement peu d’intégration synaptique. Après la collecte des solutions unicellulaire par cytométrie en flux, ces précurseurs d’interneurones sont transplantées P0-P2 type sauvage postnatals chiots. En effectuant les deux homotopes (p. ex., cortex-à-cortex) ou hétérotopique (p. ex., cortex-à-hippocampus) transplantations d’organes, on peut évaluer comment contester des interneurones immatures dans de nouveaux environnements de cerveau influe sur leur sort, la maturation et intégration circuit. Cerveau peut être récolté chez les souris adultes et testés avec une grande variété d’analyse posthoc sur les cellules greffées, y compris immunohistochimiques, profilage électrophysiologiques et transcriptionnelle. Cette approche générale fournit des enquêteurs avec une stratégie d’analyser comment différents environnements de cerveau peuvent influer sur nombreux aspects du développement de neurone et identifier les spécificités neuronales sont principalement déterminées par les programmes génétiques câblé ou signaux environnementaux.
Introduction
Bon fonctionnement cortical nécessite un équilibre entre les neurones de projection excitatrices et des interneurones GABAergiques inhibiteurs, une population extrêmement hétérogène avec des morphologies distinctes, les propriétés électrophysiologiques, connectivité et neurochimiques marqueurs. Un développement anormal et la fonction des interneurones (et sous-groupes spécifiques interneurone) a été liée à la pathologie des troubles psychiatriques comme la schizophrénie, l’autisme et d’épilepsie1,2,3. En outre, de nombreux gènes impliqués dans ces troubles cérébraux sont fortement enrichis en interneurones jeune4. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent la maturation et la détermination du sort interneurone est nécessaire pour comprendre le développement normal et les étiologies possibles de nombreuses maladies cérébrales.
Interneurones du prosencéphale sont issus principalement de deux structures embryonnaires transitoires, les éminences ganglionnaires médiales et caudales (MGE et GCE, respectivement). Ces cellules postmitotiques (précurseurs des interneurones) subissent alors une phase de migration tangentielle prolongées de se disperser dans le télencéphale où ils s’intègrent dans une grande variété de circuits. Dérivé de MGE interneurones consistent en trois sous-groupes en grande partie non chevauchantes, neurochemically définies : rapide de fortification interneurones de la parvalbumine (PV+), non EXPRES interneurones de la somatostatine (SST+), de dopage et fin de fortification neuronale nitrique interneurones de synthase (nNOS+) oxyde qui constituent les cellules hippocampiques de neurogliaform et de lierre. Plusieurs laboratoires ont identifié plusieurs mécanismes au sein de la MGE qui régissent les décisions initiales sort en PV+ / SST + interneurones, y compris les gradients spatiaux de morphogènes, date de naissance des précurseurs des interneurones et le mode de division neurogène 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. il a été suggéré que les interneurones initialement se différencient en « classes de cardinales » et ensuite progressivement mûrissent « classes définitifs » pendant qu’ils interagissent avec leur environnement11. Des données récentes indiquent que certains sous-types interneurone matures peuvent être génétiquement câblé fur ces cellules postmitotiques dans les éminences ganglionnaires, indiquant que les premiers programmes de génétiques intrinsèques définies peuvent jouer un rôle plus important qu’auparavant apprécié12,13. Toutefois, la question clé de la façon dont les programmes génétiques intrinsèques interagissent avec signaux environnementaux à la différenciation de la voiture en sous-types distincts interneurone demeure largement inexplorée.
De nombreuses études ont transplanté des cellules embryonnaires de MGE directement dans diverses régions du cerveau, avec les résultats d’un consensus qui greffé des cellules matures et libèrent GABA qui empêche généralement les circuits endogène local14,,15, 16,17,18,19. Ces promettant observations ont suscité un intérêt considérable en utilisant les cellules souches humaines pluripotentes induites (hIPSC)-dérivé des interneurones pour traiter une variété de maladies du cerveau. Cependant, très peu de ces études évaluer si ces cellules greffées mûrissent les types attendus des interneurones matures, un élément essentiel quand on pense approches translationnelles.
Pour répondre à comment l’environnement influence interneurones de différenciation et de maturation, une stratégie a été conçue pour transplanter des précurseurs immatures interneurones dans de nouveaux environnements de cerveau pour examiner si des interneurones greffées adoptent des caractéristiques de l’hôte environnement ou conserver les caractéristiques de l' environnement de donateurs20. MGE transplantations ne conviennent pas à répondre à cette question car la MGE contient une population mixte d’interneurones GABAergiques projection les cellules et qui se dispersent tout au long de nombreuses cerveau régions21. Sans savoir où ces cellules MGE auraient migré, on ne peut pas complètement évaluer comment ces transplantations d’organes sont affectées par l’environnement de cerveau. En récoltant les précurseurs des interneurones à intervalles postnatale précoce, ce problème est contourné par l’obtention de cellules immatures qui ont terminé leur migration et ont atteint leur cible région du cerveau, mais ont une interaction minimale avec l’environnement. En mettant l’accent sur des caractéristiques spécifiques des interneurones qui sont exprimés de façon différentielle entre les régions cérébrales distinctes, on peut alors déterminer comment l’environnement hôte modifie les propriétés d’interneurones. L’approche générale proposée dans le présent Protocole s’appliquera à tout enquêteur que veut examiner comment les jeunes neurones comporte quand a contesté dans un nouvel environnement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées selon les directives du National Institutes of Health et ont été approuvés par le Comité de l’emploi (ACUC) et de NICHD animalier. Le protocole décrit ci-dessous utilise Nkx2.1-CreC / +; Ai9+/- chiots pour récolter les précurseurs dérivés de MGE interneurone, mais peuvent être effectuées sur n’importe quelle ligne de souris journaliste fluorescent désirée. Les souris mâles et femelles début postnatals (P0-P2) ont été utilisées sans discernement pour tissu donneur et hôte.
1. préparation de la solution
- Préparer le saccharose artificiel liquide céphalo-rachidien (sACSF) selon la recette suivante (unité en mM) : 87 NaCl, 26 NaHCO3, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 0,5 CaCl2, 7 MgCl2, 10 de glucose, saccharose 75 imprégnée de 95 % O 2, 5 % de CO2 à pH = 7,4.
- Remplir un bécher avec 350 mL ddH pure2O basé sur le volume final souhaité (500 mL de sACSF devrait être suffisant pour litières de 1-2), ajouter un magnétique et placer le bécher sur la plaque de remuer.
- Tous les sels (NaCl, NaHCO3, KCl, NaH2PO4, glucose, saccharose), un à la fois le poids et ajouter à l’eau conformément au tableau suivant. Quantités peuvent être ajustées selon le volume final souhaité.
Réactif Poids moléculaire Concentration (mM) Grammes/500 mL Chlorure de sodium 58.44 87 2.54 Bicarbonate de sodium 84.01 26 1.09 Chlorure de potassium 74.55 2.5 0,09 Phosphate de sodium monobasique 119.98 1.25 0,08 Glucose 180.16 10 0,9 Saccharose 342,3 75 12,84 - Bulle de la solution avec 95 % O2, 5 % CO2 (carboxygen) pendant au moins 20-30 minutes avant d’ajouter la quantité appropriée de CaCl2 (0,25 mL d’une solution 1 M de sACSF de 500 mL) et du MgCl2 (3,5 mL d’une solution 1 M de sACSF de 500 mL) .
- Vérifier le pH à l’aide d’un pH-mètre standard. Si préparé correctement, la solution doit avoir pH = 7,4.
- Porter la solution à un volume final de 500 mL avec les ddH pure2O dans une éprouvette graduée.
- sACSF peut être préparé jusqu'à 1-2 jours à venir. Avant utilisation, placer sur la glace et bulle avec carboxygen pendant au moins 15 minutes avant le début de la dissection et garder la bouteille de sACSF bulles tout au long de la dissection.
2. dissection préparation
- Les outils suivants devraient être stérilisés/autoclave : au moins une petites fines sharp ciseaux, 2 pinces fines (Style #5), courbés pinces fines, cerveau sectionnement matrice moule et plusieurs lames de rasoir. Une petite spatule pour retirer le cerveau du crâne est facultative.
- Mettre en place le poste de travail près de microscopes de dissection avec boîtes de Pétri (9 cm et diamètre de 4 cm), 50 mL coniques tubes en plastique pour recueillir les régions isolées du cerveau et grand alésage de transfert en plastique pipettes, tous conservés dans la glace. Préparer plusieurs tubes de 50 mL pleins de carboxygenated sACSF sur la glace. Si plus d’une région du cerveau de dissection, veillez à correctement et étiqueter clairement tant les tubes de prélèvement et les pipettes de transfert pour éviter toute contamination.
- Avoir un seau à glace supplémentaire pour l’anesthésie de la glace des petits par hypothermie et un sac approprié des déchets dangereux de disposer des carcasses.
- Préparer feu billes de verre que pipettes Pasteur pour la trituration des tissus. Utiliser un bec Bunsen à stériliser et à façonner l’embout de la pipette. Préparer plusieurs pipettes avec alésage différentes ouvertures : grand (~ 600 µm), moyen (~ 300 µm) et petit (~ 100 µm). Tester les flux par le biais de conseils utilise l’eau pour assurer la trituration différentes vitesses. Au moins une pipette de chaque type est nécessaire pour chaque région du cerveau isolé, mais ayant plusieurs supplémentaire pour chaque taille est recommandé en cas de colmatage ou de casser des trucs.
3. transplantation préparation
- Un tire-câble électrode permet de préparer des micropipettes de verre pointu. Casser ou en biseau le bout faire un angle pointu, avec la pointe d’un diamètre d’environ 20 à 40 µm. inspecter visuellement les pointes avec un microscope pour ne s’assurer qu’aucun poussière ou les particules de verre résiduels sont emmêlés dans l’ouverture.
- À l’aide d’une seringue aiguille fine, remplir complètement la micropipette de verre avec de l’huile minérale. Insérez la micropipette dans l’appareil de Nanoject (ou autre périphérique de microinjection). Pour le Nanoject III, mis en place le programme suivant : Volume = 60 nL, taux = 30, Cycles = 25, Delay = 1 s.
- Garantir la Nanoject pour le manipulateur qui est relié à une base magnétique et réglez le manipulateur afin que le Nanoject pointe vers le bas, ne pas incliné le long de le x ou y axe.
- Attacher un mastic adhésif (~ 1-2 cm pour les petits P0-P2) vers le haut du couvercle d’une boîte de Pétri créant une surface surélevée pour se reposer la tête du chiot sur.
- Coupe ~ 6-8 cm longs rayures du laboratoire de bande et faites un trou en forme de losange au milieu. Les bandes serviront à stabiliser la tête du chiot au cours de la procédure, tout en étirant la peau et permettant de faciliter la visualisation des points de repère et de la région ciblée.
- Préparer un coussin chauffant à côté de la station d’injection et allumez au réglage « faible » avant de commencer les injections. Recouvrir la garniture avec des serviettes en papier ou un tampon de couche-culotte.
- Si effectuer plusieurs conditions de transplantation, ont un prêt à effectuer de petits ciseaux découpage d’orteil/queue de balise chiots récepteurs injections différentes.
4. retrait du cerveau de souris P0-P2
- Juste avant de commencer la procédure, remplir plusieurs boîtes de Pétri avec réfrigérés, carboxygenated sACSF. Également remplir les tubes de collection avec sACSF ~ 25 mL.
- Enroulez un chiot P0-P2 dans certains parafilm ou un gant et le lieu que c’est bien couvert sous la glace. Que la minuterie pendant 5 minutes et démarrez-le. Passé ce délai, retirer le chiot et vérifier qu’il ne répond pas au pincement de la hindpaw.
- Décapiter le chiot et recueillir la tête dans une boîte de Pétri remplie de sACSF. Couper la peau le long de la ligne médiane pour exposer le crâne.
- Localisez l’ouverture dans le crâne à la moelle épinière/cerveau postérieur et insérez une extrémité de la pince le long de la partie dorsale du crâne. Doucement, saisir le crâne à la ligne médiane et « peler » morceaux latéralement pour exposer le cerveau, en veillant à ne pas endommager le cerveau.
- Après le retrait des parties dorsales et latérales du crâne, utiliser la pince ou la spatule pour retirer délicatement le cerveau du crâne par excavation au-dessous de la surface ventrale du cerveau, essayant de ne pas endommager n’importe quel domaine. Placer le cerveau dans une autre boîte de Pétri remplie de carboxygenated sACSF.
Remarque : Nous présentons deux stratégies différentes pour la dissection sur l’hippocampe, le striatum et le cortex. La première stratégie (étapes 5.1 à 5.10) est utile pour n’importe quelle ligne de la souris, tandis que la seconde stratégie (étapes 6.1 à 6.7) aurait besoin d’une souris journaliste fluorescent proprement séparer le striatum le globus pallidus et autres structures du cerveau. Si striatum n’est pas souhaitée, ignorez les parties striatum spécifiques des deux techniques
Figure 1 : Schématique et images pour la dissection du cerveau, technique #1
Technique de dissection décrit aux points 5.1 à 5.10. Si les tissus striataux sont souhaitée, placer P1 cerveau dans la face ventrale des matrices cerveau vers le haut. Placez les lames de rasoir dans les fentes de la matrice par le biais de cerveau antérieur pour obtenir des sections coronaires dans le striatum. Enlever les morceaux striatal des deux hémisphères, répéter pour toutes les sections contenant striatum sont antérieures hippocampe. Si tissu striatale n’est pas souhaité, simplement hemisect le cerveau, placer le côté médial hémisphères vers le haut dans le plat et supprimez les structures de bord ventral-medial cerveau (thalamus, noyaux gris centraux, etc.) pour exposer l’hippocampe. Pince à épiler permet de pincer de hippocampe, puis retournez l’hémisphère et utiliser des pinces à disséquer un morceau de tissu cortical. Les lignes verticales noires à travers les hémisphères schématiques où les coupes serait de supprimer les sections striataux. Echelle = 500μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
5. récolte Striatum, hippocampe et le Cortex, Technique #1
- Placez tout le cerveau sur la section matrice moule, face ventrale vers le haut. Placer 1 lame de rasoir par le biais de la portion la plus antérieure du cerveau (à travers le tractus olfactif antérieur).
- Une autre lame de rasoir juste postérieure à la première pour générer une tranche de 0,5 mm et placer une lame de rasoir supplémentaire postérieure à celle-ci.
- Transférer ces tranches sur un plat de Pétri avec carboxygenated sACSF et placer le reste du cerveau dans un plat séparé avec sACSF. Transférer les tranches striatales à une dissection étendue de visualiser le striatum. Ces tranches devraient contenir de larges portions du striatum antérieur et manque hippocampe. Utiliser un fluorescent dissection étendue avec Nkx2.1-Cre+/-; Ai9+/- tranches pour différencier le tdTomato striatum faible signalent du signal fort tdTomato du globus pallidus.
- Avec ou sans fluorescence, pincer sur le striatum des deux hémisphères sur toutes les sections et transfert striatale morceaux de tube correctement étiquetées 50 mL avec sACSF, stocker sur la glace.
- Hemisect le cerveau le long de la ligne médiane à l’aide de pinces ou une lame de rasoir, et poser l’hémisphère afin que la surface médiale est vers le haut.
- Enlever le tissu de cerveau ventral (thalamus, noyaux gris centraux, etc.) en pinçant hors ce tissu avec une pince. Quand complet, l’hippocampe (une structure en forme de saucisse s’étendant sur l’axe antéro-postérieur, le long du cortex dorsal) et côté ventriculaire du cortex doit être clairement visible.
- Pour supprimer l’hippocampe, insérer l’extrémité de la pince devant l’hippocampe antérieur et séparer doucement l’hippocampe du cortex en déplaçant la pince vers l’arrière et pincer le long de la frontière hippocampe-cortical. Transférer l’hippocampe isolé à tube correctement étiquetées 50 mL avec sACSF, stocker sur la glace.
- Pour disséquer le cortex, placez la partie médiane du cortex hemisected vers le bas. Puis utilisez la pince à pincer la plus dorsale, ventrales, antérieures et postérieures des parties du cortex de quitter un morceau carré de cortex somatosensoriel médial, ~ 2 mm x 2 mm. Flip le cortex donc côté médial est propre de tout excès de tissu non-corticale (thalamus et vers le haut les noyaux gris centraux, etc..) sur la surface médiale si nécessaire. Transférer le morceau de cortex à tube correctement étiquetées 50 mL avec sACSF, stocker sur la glace.
- Répétez la procédure avec l’autre hémisphère pour recueillir l’hippocampe et le cortex régions.
- Répétez cette procédure pour tous les chiots, en veillant à remplacer la sACSF dans les boîtes de Pétri entre petits à s’assurer que le sACSF reste fraîche et froide.
Figure 2 : Schématique et images pour la dissection du cerveau, technique #2
Technique de dissection décrit aux points 6.1 à 6.7. Cerveau de broche sur une dissection face dorsale plat vers le haut. Après avoir épluché le cortex vers l’avant, l’hippocampe et le striatum sont visibles et peuvent être supprimés, puis une section du cortex peut être enlevée comme décrit dans la technique précédente. Selon la lignée de souris transgéniques, striatum peut être nettoyé pour enlever le globus pallidus et autres tissus. Dans Nkx2.1Cre ; Ai9 lignée de souris, le globus pallidus a une densité beaucoup plus élevée de cellules tomate + par rapport au niveau du striatum. Echelle = 500 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
6. récolter Striatum, hippocampe et le Cortex, Technique #2
- Placer la face ventrale du cerveau vers le bas dans un enduit de sylgard boîte de Pétri contenant sACSF et circonscrire dans le cervelet et le cortex antérieur ou de bulbes olfactifs.
- Commençant par un hémisphère, utilisez la pince courbée pour séparer délicatement le cortex postérieur de hippocampe sous-jacente et d’autres tissus. Poser délicatement le cortex Pelé plat sur boîte de Pétri. Répétez pour l’autre hémisphère. Hippocampe et du striatum doivent être clairement visibles dans le cerveau exposé.
- Utiliser pince à pincer un hippocampe à la ligne médiane et peler hippocampe latéralement pour supprimer. Placer dans le flacon de collection sur la glace et répéter l’opération avec les autre hippocampe.
- Pour striatum, grattez légèrement sur les bords du striatum pour le desserrer des tissus environnants. Puis retirez le striatum en pinçant il décolla de dessous et ajouter au tube de prélèvement sur la glace. Répétez pour l’autre striatum.
- Les sections corticales peuvent être récoltées comme indiqué au point 5.8.
- Si vous utilisez une lignée de souris transgéniques journaliste (p. ex., Nkx2.1-Cre ; Ai9, Lhx6-GFP, etc.), transférer striatum dans une boîte de Pétri avec sACSF et sous l’onglet fluorescentes dissection étendue. Utiliser des pinces pour enlever n’importe quel tissu non-striatal striatum (en Nkx2.1-Cre ; Ai9 souris, enlever tous les tissus « lumineux », comme le globus pallidus a densité beaucoup plus élevée, dérivé de MGE tdTomato + cellule par rapport au striatum). Répétez pour tous les striatum.
- Répétez cette procédure pour tous les chiots, en veillant à remplacer la sACSF dans les boîtes de Pétri entre petits à s’assurer que le sACSF reste fraîche et froide.
7. génération unicellulaire Dissociations
- Une fois terminée la dissection, préparer un 1 mg/mL solution Pronase pesant 10 mg la Pronase et dissoudre dans 10 mL carboxygenated sACSF.
- Transfert le tissu des flacons de collection de 50 mL à 5 mL autour des tubes du bas contenant 2 mL de la solution de la Pronase-sACSF. Incuber le tissu pendant 20 min à température ambiante, secouant/pichenette le tube 3 - 4 fois avec votre doigt pendant l’incubation pour mélanger les échantillons.
- Durant cette incubation, préparer la solution de Reconstitution : 1 % FBS (100 μL) + DNAse (stock # 1 μL de 1/10 000 DNAse) dans 10 mL carboxygenated sACSF.
- Après les 20 minutes, soigneusement enlever la solution de la pronase ne pas perturber le tissu en bas et remplacez-la par 1 à 2 mL de la solution de Reconstitution (volume total est tributaire de la quantité de tissu de départ).
- Dissocier mécaniquement le tissu par trituration le tissu avec les pipettes de Pasteur poli feu préalablement préparées. À partir de la pipette (~ 600 µm) de grand alésage, aspirer et expulser la solution tissu au moins dix fois pour briser le tissu. Ne pas introduire de bulles dans la solution. Répétez ce processus pour le milieu de l’alésage pipette et le petit alésage pipette. La solution devrait être nuageuse, et aucune pièce claire du tissu ne doit être visible dans les tubes de prélèvement.
- La solution de lysat cellulaire à travers un filtre de 50 µm dans des tubes coniques 5 mL pour enlever n’importe quelle cellule pipette des touffes. Aller de l’avant avec ces solutions monocellulaire de cytométrie en flux (ou potentiellement directement à la cellule de comptage si aucun tri est nécessaire).
8. préparation des Solutions FACS-purifiée cellules destinés à la Transplantation
- Après avoir reçu les solutions de la cellule du cytomètre en flux, transvaser la solution dans une (ou plusieurs) tubes coniques de 1,5 mL et faire tourner les cellules à 500 g pendant 5 min à 4oC. Après centrifugation, retirez le support alors que ~ 20-40 µL de rester dans le tube. Reconstituer les cellules dans ce restant de médias (et combiner la solution si plusieurs tubes sont nécessaires).
- Sur un petit morceau de parafilm, mélanger 2 µL de solution cellulaire + 8 µL sACSF + 10 µL de tache bleu trypan. Déposer 10 µL dans un hémocytomètre avec couvercle coulissant.
- Compter le nombre de cellules vivantes dans chacune des grilles carrés 4 x 4 dans les coins de l’hémocytomètre à l’aide d’un compteur de contrôle de laboratoire standard main (cellules mortes sera bleues de la teinture), et la moyenne de ces 4 chefs d’accusation. Multipliez ce nombre par 100 afin de déterminer le nombre de cellules / µL.
- Si nécessaire, régler le volume de sorte que les cellules sont à une concentration de 10 000-30 000 cellules/µL de solution de Reconstitution. Concentration finale dépend du montant total de cellules et le nombre désiré de transplantations d’organes. Garder les cellules sur la glace à la transplantation
9. la transplantation dans WT P0-2 chiots
- Enroulez un chiot WT dans certains parafilm ou un gant et le lieu que c’est bien couvert sous la glace. Paramétrer une minuterie pour 5 min et démarrez-le. Passé ce délai, retirer le chiot et vérifier qu’il ne répond pas au pincement de la hindpaw.
- Alors que le chiot est sur la glace, mélanger la solution de la cellule de pipetage il plusieurs fois pour s’assurer de la suspension cellulaire est bien mélangée avant l’embarquement (mélanger les cellules avant de charger la micropipette pour chaque injection). Puis videz la micropipette de l’huile minérale et remplissez-le complètement la suspension cellulaire.
- Placez le chiot anesthésié sur la boîte de Pétri avec sa tête se trouvant sur le mastic adhésif afin que le sommet de la tête est relativement plat. Placer le ruban avec le trou de diamant sur la tête du chiot, tirant tendue pour la peau est tendue et la tête soit ferme mais que la souris est bien confortable et respiration. Lambda doit être visible par le trou de diamant.
Figure 3 : Schématique et images pour transplantation
(A) photos de l’installation de l’injection. Notez que lambda est clairement visible à travers le crâne du chiot et doit être utilisé pour la remise à zéro de la micropipette. Echelle = 1 pouce. (B) schéma illustrant la procédure d’injection pour cibler l’hippocampe. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- Déplacez le chiot garanti en vertu de la Nanoject et abaissez la micropipette afin que la pointe de la micropipette est sur directement au-dessus de lambda. Enregistrer les coordonnées x-y sur le manipulateur.
- Réglez les boutons de manipulateur pour déplacer la micropipette aux coordonnées désirées le long de la médio-latérale et l’axe antéro-postérieur de la tête : → Cortex S1 antérieure 1,0 mm et 1,0 mm latéral, hippocampe → 0.75-1.0 mm antérieure et latérale de 1,0 à 1,2 mm, Striatum → 2,0-2,2 mm antérieure et latérale de 1,5 mm. Coordonnées peuvent être ajustées légèrement pour compenser de l’âge du chiot (par exemple, P0 et P2) ou de la souche de souris (par exemple, CD1 souris sont plus grandes qu’et C57/B6 en P2).
- Abaissez la micropipette jusqu'à ce qu’il forme une petite concavité sur la peau. Puis tournez le pommeau de manipulateur fermement mais doucement pour conduire la micropipette à travers la peau et le crâne pour pénétrer dans le cerveau. Lorsque la micropipette pénètre dans le cerveau, la pression sur le crâne qui sortira et la concavité disparaît.
- Rétracter la micropipette légèrement jusqu'à ce que la pointe est entourée d’un cône de peau, la forme d’une tente. Lire les coordonnées le long des axes z : ce sera le point de l’axe z zéro.
- Abaisser la micropipette à la profondeur désirée : Cortex → 0.75-1.0 mm, hippocampe → 1,2 à 1,5 mm, Striatum → 2.0-2.5 mm profondeur pouvez être ajustées pour compenser pour l’âge ou la race du chiot.
- Injecter la suspension cellulaire en utilisant le programme Nanoject III décrit ci-dessus. Après l’injection le programme est terminé, attendre 15 à 20 s avant de lentement se rétracter la micropipette pour minimiser les fuites hors du site d’injection de solution.
- Si vous effectuez des injections bilatérales, remettre à zéro la micropipette au-dessus de lambda et déplacer les coordonnées appropriées dans l’autre hémisphère. Alternativement, on peut faire deux injections dans le cortex de l’hémisphère même en déplaçant la micropipette antérieure de la première injection de 1 mm.
- Une fois que la transplantation est terminée, retirez le ruban et transférer le chiot sur le coussin chauffant. Si nécessaire, étiquetez le chiot par découpage de queue ou de l’orteil. Une fois que le chiot a acquis de nouveau une couleur rouge et se déplace, placez-le dans la cage avec la mère.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ce protocole montre comment récolter des régions précises du cerveau de cerveaux postnatale précoce (Figure 1-2), recueillir des dissociations unicellulaire des précurseurs des interneurones et transplanter ces cellules dans diverses régions du cerveau en naïf WT chiots postnatals (Figure 3). Pour l’analyse posthoc, cerveau qui a reçu d’interneurones précurseur greffes ont été récoltés entre P30-35 pour caractériser la morphologie cellulaire, de marqueurs neurochimiques et propriétés électrophysiologiques. Ces types d’analyses sont souvent réalisées entre P21-P30 chez les souris normales, mais comme la maturation des cellules transplantées pourrait être légèrement retardée en raison de la procédure de dissection/dissociation, attendant une période supplémentaire de 5 à 10 jours est recommandée pour compenser ce retard de la maturation. Le type d’analyse à exécuter dictera la stratégie adéquate pour récolter le cerveau. Notamment, nous n’avons pas observé mort cellulaire préférentiel des sous-groupes spécifiques interneurones qui pourrait biaiser pour ou contre certains sous-types de20.
Pour une analyse immunohistochimique, souris ont été perfusés avec paraformaldéhyde à 4 % et le cerveau ont été supprimé. 50 μm vibratome tranches ont été préparés dans le cadre de la région du cerveau ciblées et stockées dans une solution antigel ou traitées pour immunostaining comme décrit précédemment20. Certains cerveaux ne contenait aucune tomate + cellules, qui pourraient être dû à une mauvaise cible (par exemple, l’injection trop profonde dans le ventricule), cellules perdus ou en apoptose au cours de la procédure de greffe ou rejet des cellules transplantées par l’hôte. Basée sur le nombre de la dernière cellule, on estime que seulement 2 à 5 % des cellules greffées survivre20, qui est conforme à d’autres procédures de transplantation22,23.
Il n’est pas surprenant, il y avait une variabilité significative dans le nombre total de cellules tomate + dans les greffes réussies, allant de quelques dizaines à plusieurs milliers de tomate + cellules (Figure 4 a). Les cellules greffées ont été localisés dans les régions correctes, avec de nombreux affichant des morphologies des interneurones et marqueurs neurochimiques interneurone bien caractérisés (Figure 4 b). Profils de maturation et de nombre de survie des cellules semblables ont été observés même lorsque les cellules ont été greffés dans de nouveaux environnements hétérotopique transplantations d’organes (Figure 4).
En plus de l’analyse immunohistochimique, analyse électrophysiologique des cellules greffées a été effectuée pour confirmer qu’ils ont intégrés dans les circuits cérébraux et affichent les propriétés intrinsèques et tir prévues. Cerveaux ont été récoltées de souris P30-35 et tranches préparées pour des enregistrements physiologiques comme précédemment décrit20. Les interneurones greffées présenté adulte-comme des propriétés physiologiques et tir distinct les modèles pourraient être caractérisés qui témoignaient d’interneurones bien caractérisés sous-types (Figure 5 a), ce qui suggère que greffés interneurones ont pu mûrir correctement dans l’environnement hôte. Pour vérifier que les cellules transplantées ont été intégrés dans le réseau neuronal, sEPSCs ont été également enregistrées (Figure 5 b). En outre, un sous-ensemble des greffes ont été réalisées avec interneurones exprimant ChR2 suivie d’enregistrement à partir de cellules pyramidales localisées près des interneurones transplantés. Ces données ont démontré que des courants GABAergiques post-synaptiques sont évoquées par la lumière bleue (Figure 5-D).
Figure 4 : Interneurone greffées précurseurs peuplent les régions du cerveau hôte des sections représentatives de souris P30 WT qui ont été transplantés avec tomates + des précurseurs interneurone à P1. (A) dans la transplantation de cortex-à-cortex homotopes, les cellules greffées remplir toutes les couches corticales et affichent les morphologies qui imitent les interneurones endogènes. Les images sélectionnées mettent en évidence la variabilité dans le nombre de cellules de différentes greffes, avec l’image de gauche ayant un nombre beaucoup plus grand de tomate + cellules par section par rapport à la greffe du côté droit. (B) faible grossissement (à gauche) et fort grossissement (à droite) sections représentatives des greffes hippocampe-à-hippocampus homotopes. Notez que la majorité des cellules tomate + dans la strate oriens express (SO) SST (cellules susceptibles de O-LM), tandis qu’exprimé par nombreux tomate + cellules dans la strate pyramidale (SP) PV (cellules susceptibles de panier), semblable à des interneurones hippocampe endogènes. (C) exemple d’une greffe hétérotopique (Cortex-à-Striatum) avec tomates + présents dans le striatum. Barreaux de l’échelle = 200 μm à A dans Panneau de faible mag b, 50 μm dans C et mag de haute puissance dans B. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Interneurones greffées rhinophore murissent et intégrer dans le réseau neuronal de l’hôte
(A) des exemples représentatifs des fréquences plus élevées de tirs enregistrement d’interneurones greffées. Gauche, interneurone rapide de dopage d’un greffon de la hanche-à-Ctx, injecté actuel comme suit :-100 pA et pA 520 ; droite, interneurone Non-Fast de dopage d’un greffon de Ctx-à-Ctx, injecté actuel comme suit : -100 pA et 360 PA. (B) exemple de sEPSCs enregistrés dans un interneurone tardif de fortification d’une greffe de la hanche à la hanche. (C) image représentative affichant Nkx2.1-Cre ; Ai32 greffe de cellules (YFP) de Ctx-à-Ctx avec une cellule pyramidale (rouge) la biocytine remplis. Echelle = 50 μm. (D) exemple d’un courants postsynaptiques GABAergique évoquée par des impulsions de lumière bleues enregistré dans les cellules pyramidales, enregistré avec un [145 mM Cl-]. Dans les traces de noirs, moyens ; en rouge, réponse moyenne enregistrée en présence de Gabazine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Un aspect essentiel de ce protocole de maximiser les chances de survie des cellules. Veiller à ce que les tissus et les cellules sont toujours en sACSF de carboxygenated de glace froide est nécessaire pour promouvoir la survie des cellules. Cela nécessite une dissection efficace et une stratégie de dissociation pour minimiser la durée pendant laquelle les cellules passent dans divers solution et à l’extérieur de l’environnement du cerveau. Selon le nombre de régions du cerveau sont disséqués et transplantés, il peut être avantageux d’avoir un partenaire de l’aide dans les étapes de la dissection ou transplantation de réduire la durée de l’expérience. Afin d’assurer la santé et la survie du chiot, il est également essentiel pour minimiser le temps de l’anesthésie de glace (< 4 min) et de garder le chiot chauffé avec la lumière au cours de la procédure de transplantation.
Il peut y avoir une variation importante dans le cerveau greffé, certains ne contienne pas toutes les cellules greffées tandis que d’autres cerveaux contiendra des milliers. La combinaison de plusieurs portées de P0-P2 pour la dissection peut augmenter le nombre de cellules prélevées pour les greffes, qui permet d’augmenter la densité de cellules de transplantation ou augmenter le nombre de chiots greffés, qui permettra d’améliorer la probabilité de greffes réussies. Pour cibler la région du cerveau adéquate, il est essentiel que le chef du pup est stabilisé et ne bouge pas lorsque vous abaissez la micropipette dans le cerveau. Tout déplacement de la tête ou flexion de l’arbre de la micropipette peut entraîner des injections mistargeting et inexactes (tels que la perte de cellules dans le ventricule latéral). Aussi, effectuant de multiples sites d’injection par chiot (unilatéralement ou bilatéralement) peuvent améliorer les taux de réussite dans le cas où un site d’injection est réorienter. À l’avenir, il ne serait pas optimale pour élaborer une stratégie plus efficace stéréotaxique afin de stabiliser le chiot et fournir des injections plus précises et cohérentes.
Laps de temps Th P0-P2 a été choisi pour des raisons scientifiques et techniques. À cet âge, la plupart précurseurs d’interneurones ont migré vers leurs sites terminales mais ont des interactions environnementales minimales. Ce délai ne conserveront pas vrai pour d’autres types de cellules neuronales et des régions du cerveau, donc on peut vouloir régler ces points pour leurs besoins spécifiques. Par exemple, il serait intéressant de comparer le potentiel thérapeutique de ces précurseurs d’interneurones P0-P2 récoltés avec cellules récoltées MGE : un âge peut avoir des avantages plus ou moins indésirables effets secondaires que les autres. En outre, il pourrait être intéressant d’effectuer des transplantations hétérochronique (p. ex., prélèvement de cellules au P0-P2 et le repiquage en P7-10 cerveaux, ou vice versa) pour identifier les modifications comment temporelles dans l’environnement pourrait affecter sort de cellule et de la maturation. L’avantage d’effectuer des injections à P0-2 est que le crâne est relativement mince et peut être facilement pénétré avec une micropipette pointue. Des injections sur P5 exigera de retirer ou d’amincissement du crâne.
L’analyse décrite dans le présent protocole est limitée aux caractéristiques spécifiques de sous-types d’interneurones qui sont exprimés de façon différentielle entre les régions du cerveau. À l’avenir, on pourrait utiliser la puissance du séquençage de cellule unique pour caractériser le transcriptome complet des cellules greffées. Cette approche objective pourrait identifier des gènes spécifiques (ou plus grandes cascades de signalisation) qui sont fortement enrichi ou appauvri en cellules transplantées par rapport aux témoins, ce qui auraient donner un aperçu de candidat des signaux environnementaux qui pourraient influencer le destin détermination ou la maturation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par les National Institutes of Health (K99MH104595) et le programme de recherche intra-muros de NICHD pour T.J.P. Nous remercions Gord Fishell, dans le laboratoire de dont cette approche a été initialement établie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
References
- Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. Epilepsy as a neurodevelopmental disorder. Front Psychiatry. 3 (19), (2012).
- Takano, T. Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances. Dev Neurosci. , (2015).
- Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
- Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function. Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).
- Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).
- Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).
- Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).
- Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex. Science. 339 (6115), 70-74 (2013).
- Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry. Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Mi, D., et al. Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo. Science. 360 (6384), 81-85 (2018).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- De la Cruz, E., et al. Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges. Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).
- Gilani, A. I., et al. Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).
- Larimer, P., et al. Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity. Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).
- Martinez-Cerdeno, V., et al. Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats. Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).
- Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation. Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).
- Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).
- Thompson, L., Bjorklund, A. Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation. Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).
- Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control. Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).
