Summary
Sfidando i neuroni giovani in nuove regioni del cervello possa rivelare importanti intuizioni come l'ambiente scolpisce maturazione e destino neuronale. Questo protocollo descrive una procedura per raccogliere precursori Interneurone da regioni specifiche del cervello e trapiantarli o homotopically o heterotopically nel cervello dei cuccioli postnatali.
Abstract
Maturazione e la determinazione di destino neuronale richiede un gioco intricato tra programmi genetici e segnali ambientali. Tuttavia, districare i ruoli di intrinseca vs estrinseche meccanismi che regolano questo processo di differenziazione è un enigma per tutti i neurobiologi inerente allo sviluppo. Questo problema è amplificato per interneuroni GABAergici, una popolazione incredibilmente eterogenee delle cellule che è nato da strutture embrionali transitorie e sottoposti a una prolungata fase migratoria per disperdere tutto il telencefalo. Per esplorare come i diversi ambienti di cervello influenzano interneurone destino e maturazione, abbiamo sviluppato un protocollo per la raccolta dei precursori Interneurone immaturo fluorescente contrassegnati da regioni specifiche del cervello in topi neonati (P0-P2). A questa età, migrazione Interneurone è quasi completa e queste cellule risiedono nei loro ambienti di riposo finale con relativamente poca integrazione sinaptica. Dopo il prelievo delle soluzioni di singola cellula tramite citometria a flusso, questi precursori Interneurone sono trapiantati in P0-P2 wildtype postnatali cuccioli. Eseguendo entrambi omotope (per esempio, corteccia di corteccia) o eterotopica (ad es., corteccia di ippocampo) trapianti, si può valutare come impegnativo immaturi interneuroni in nuovi ambienti di cervello colpisce il loro destino, la maturazione e l'integrazione di circuito. Cervelli possono essere raccolte in topi adulti e analizzati con una vasta gamma di analisi posthoc su cellule innestate, compreso immunohistochemical, elettrofisiologici e transcriptional profiling. Questo approccio generale fornisce gli investigatori con una strategia di test come distinti ambienti di cervello possono influenzare numerosi aspetti dello sviluppo del neurone e identificare se caratteristiche specifiche di un neurone sono principalmente guidate da programmi genetici hardwired o stimoli ambientali.
Introduction
La funzione corticale appropriata richiede un equilibrio tra neuroni di proiezione eccitatori e inibitori GABAergici, una popolazione estremamente eterogenea con morfologie distinte, proprietà elettrofisiologiche, connettività e neurochimici marcatori. Sviluppo anormale e funzione di interneuroni (e sottogruppi specifici Interneurone) è stato collegato a pathobiology di disturbi psichiatrici come la schizofrenia, autismo ed epilessia1,2,3. Inoltre, molti geni implicati in questi disordini del cervello sono fortemente arricchiti in interneuroni giovane4. Così, una maggiore comprensione dei meccanismi che regolano la maturazione e la determinazione di destino Interneurone è necessaria per comprendere lo sviluppo normale e potenziali eziologie delle numerose malattie del cervello.
Interneuroni del forebrain nascono principalmente da due strutture embrionali transitorie, le eminenze gangliare mediale e caudale (MGE e CGE, rispettivamente). Queste cellule postmitotic (precursori Interneurone) quindi subire una fase prolungata migrazione tangenziale per disperdere tutto il telencefalo dove si integrano in una vasta gamma di circuiti. Interneuroni MGE-derivati sono costituiti da tre sottogruppi in gran parte non sovrapposte, neurochemically definiti: veloce chiodare interneuroni parvalbumina (PV+), non-fast chiodare interneuroni della somatostatina (SST+) e tardi chiodare un neurone nitrico interneuroni ossido di sintetasi (nNOS+) che costituiscono le cellule hippocampal di neurogliaform ed edera. Numerosi laboratori hanno identificato parecchi meccanismi all'interno di MGE che regolano le decisioni iniziali destino in PV+ o SST + interneuroni, compresi gradienti spaziali di morfogeni, data di nascita dei precursori Interneurone e la modalità di divisione neurogena 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. è stato proposto che interneuroni inizialmente differenziano in 'Cardinale classi' e poi progressivamente maturano in 'definitive classi' come essi interagiscono con il loro ambiente11. La prova recente indica che alcuni sottotipi di Interneurone maturo possono essere geneticamente hardwired come queste cellule diventano postmitotic in eminenze gangliare, che indica che presto definiti programmi genetici intrinseci possono svolgere un ruolo più importante rispetto al passato apprezzata12,13. Tuttavia, la questione chiave di come l'intrinseci programmi genetici interagiscono con stimoli ambientali alla differenziazione di unità in sottotipi distinti Interneurone rimane in gran parte inesplorata.
Numerosi studi sono trapiantate cellule embrionali MGE direttamente in una varietà di regioni del cervello, con i risultati di consenso che innestano le cellule maturo e il rilascio di GABA per inibire generalmente il locale circuiti endogeni14,15, 16,17,18,19. Queste promettenti osservazioni hanno generato notevole interesse nell'utilizzo di cellule staminali umane pluripotenti indotte (hIPSC)-derivato interneuroni per trattare una varietà di malattie del cervello. Tuttavia, molto pochi di questi studi valutare se queste cellule innestate maturano in tipi previsti di interneuroni maturi, un componente critico quando uno pensa di approcci traslazionali.
Per affrontare come ambiente influenza la Interneurone differenziazione e maturazione, una strategia è stata ideata per trapiantare precursori immaturi Interneurone in nuovi ambienti di cervello al fine di esaminare se innestate interneuroni adottano funzionalità dell'host ambiente o conservano le caratteristiche del donatore ambiente20. MGE trapianti non sono adatti per affrontare questa domanda perché il MGE contiene una popolazione mista di Interneurone e cellule di proiezione GABAergici che disperdono nel corso di numerose regioni di cervello21. Senza sapere dove queste cellule MGE avrebbero migrato, uno non può pienamente valutare come questi trapianti sono colpiti dall'ambiente del cervello. Raccogliendo i precursori Interneurone timepoints postnatale precoce, questo problema è aggirato con l'ottenimento di cellule immature che hanno completato la loro migrazione e raggiunto la loro destinazione regione del cervello, ma hanno un'interazione minima con l'ambiente. Focalizzando l'attenzione sulle specifiche caratteristiche di interneuroni che sono differenzialmente espressi tra regioni distinte del cervello, si può quindi determinare come l'ambiente host cambia proprietà Interneurone. L'approccio generale descritto in questo protocollo dovrebbe essere applicabile a qualsiasi investigatore che vuole esaminare come i giovani neuroni si comportano quando ha sfidato in un nuovo ambiente.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state condotte secondo le linee guida del National Institutes of Health e sono state approvate dal NICHD Animal Care e uso Comitato (ACUC). Il protocollo descritto di seguito utilizza NKX 2.1-CreC / +; Ai9+ /- cuccioli per la raccolta dei precursori Interneurone MGE-derivato, ma può essere eseguita su qualsiasi linea di topo reporter fluorescente desiderata. Sia maschili che femminili primi topi postnatali (P0-P2) sono stati utilizzati indiscriminatamente per il tessuto donatore e host.
1. soluzione preparazione
- Preparare il liquido cerebrospinale artificiale di saccarosio (sACSF) secondo la seguente ricetta (unità in mM): 87 NaCl, 26 NaHCO3, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 0,5 CaCl2, 7 MgCl2, 10 glucosio, saccarosio 75 saturo di 95% O 2, 5% CO2 a pH = 7,4.
- Riempire un bicchiere con 350 mL ddH puro2O basato sul volume finale desiderato (500 mL di sACSF dovrebbe essere sufficiente per 1-2 cucciolate), aggiungere un ancoretta magnetica e porre il becher sulla piastra stir.
- Peso di tutti i sali (NaCl, NaHCO3, KCl, NaH2PO4, glucosio, saccarosio), uno alla volta e aggiungere all'acqua secondo la seguente tabella. Gli importi possono essere regolati a seconda del volume finale desiderato.
Reagente Peso molecolare Concentrazione (mM) Grammi/500 mL Cloruro di sodio 58,44 87 2.54 Bicarbonato di sodio 84.01 26 1.09 Cloruro di potassio 74.55 2.5 0,09 Sodio fosfato monobasico 119.98 1.25 0.08 Glucosio 180,16 10 0.9 Saccarosio 342,3 75 12,84 - Bolla la soluzione con 95% O2, 5% CO2 (carboxygen) per almeno 20-30 minuti prima di aggiungere la quantità appropriata di CaCl2 (0,25 mL di una soluzione 1 M per sACSF 500 mL) e MgCl2 (3,5 mL di una soluzione 1 M per sACSF 500 mL) .
- Controllare il pH utilizzando un misuratore di pH standard. Se preparati correttamente, la soluzione dovrebbe avere pH = 7,4.
- Portare la soluzione a volume finale di 500 mL con ddH puro2O in un cilindro graduato.
- sACSF può essere preparata fino a 1-2 giorni di anticipo. Prima dell'uso, mettere sul ghiaccio e bolla con carboxygen per almeno 15 minuti prima di inizio della dissezione e tenere il flacone di sACSF bolle durante la dissezione.
2. dissezione preparazione
- Gli strumenti seguenti devono essere sterilizzati o porosi: almeno un piccole bene forbici affilate, forcipe fine 2 (stile n. 5), curvo forcipe fine, cervello matrice stampo e parecchie lamierine di rasoio di sezionamento. Una piccola spatola per rimuovere il cervello dal cranio è facoltativa.
- Impostare la stazione di lavoro vicino a microscopi di dissezione con capsule di Petri (9 cm e diametro di 4 cm), 50 mL provette coniche in plastica per raccogliere le regioni del cervello isolato e grande foro trasferimento in plastica pipette, tutti tenuti sul ghiaccio. Preparare diverse provette da 50 mL piena di carboxygenated sACSF su ghiaccio. Se più di una regione del cervello di dissezione, assicurarsi di correttamente e chiaramente sull'etichetta sia i tubi di raccolta e le pipette di trasferimento per evitare la contaminazione.
- Hanno un secchio di ghiaccio supplementare per l'anestesia di ghiaccio dei cuccioli via ipotermia e un sacchetto di rifiuti pericolosi corretto smaltimento delle carcasse.
- Preparare lucidati a fuoco vetro che pipette Pasteur per triturazione del tessuto. Utilizzare un becco Bunsen per sterilizzare e modellare la punta della pipetta. Preparare diversi pipette con foro diverse aperture: grande (~ 600 µm), medio (~ 300 µm) e piccolo (~ 100 µm). Prova fuori flusso attraverso suggerimenti per garantire velocità di triturazione diversi con l'acqua. Almeno una pipetta di ogni tipo è necessaria per ogni regione del cervello isolato, ma avendo diversi extra per ogni dimensione è consigliato in caso di intasamento o rottura suggerimenti.
3. trapianto preparazione
- Utilizzare un estrattore di elettrodo per preparare punta fine vetro micropipette. Rompere o smussare la punta per fare un punto ad angolo tagliente, con la punta con un diametro di ~ 20-40 µm. Ispezionare visivamente le punte con un microscopio per non assicurarsi che nessuna polvere o particelle di vetro residuo ostacolano l'apertura.
- Usando un'ago sottile siringa, riempire completamente la micropipetta di vetro con olio minerale. Inserire la micropipetta nell'apparato Nanoject (o altro dispositivo di microiniezione). Per il Nanoject III, impostare il seguente programma: Volume = 60 nL, tasso = 30, cicli = 25, ritardo = 1 s.
- Proteggere il Nanoject per il manipolatore che è attaccato ad una base magnetica e regolare il manipolatore in modo che il Nanoject sta puntando dritto verso il basso, non inclinato lungo x o y asse.
- Allegare alcuni massa adesiva (~ 1-2 cm per i cuccioli di P0-P2) alla parte superiore del coperchio di una scatola di Petri creando una superficie sopraelevata per riposare testa del pup su.
- Tagliare ~ 6-8 cm lunghe strisce di lab nastro e fare un buco a forma di diamante al centro. Il nastro verrà utilizzato per stabilizzare la testa del cucciolo durante la procedura, mentre anche stretching la pelle e permettendo facile visualizzazione di punti di riferimento e dalla regione di destinazione.
- Preparare un termoforo accanto alla stazione di iniezione e accendere all'impostazione 'basso' prima di iniziare le iniezioni. Coprire il pad con alcuni asciugamani di carta o un pad di pannolino.
- Se eseguendo più condizioni di trapianto, hanno un paio di forbici piccola pronto ad eseguire ritaglio di punta/coda al tag cuccioli ricevente diverse iniezioni.
4. rimozione del cervello di topo P0-P2
- Proprio prima di iniziare la procedura, è necessario riempire diverse capsule di Petri con refrigerati, carboxygenated sACSF. Anche riempire le provette di raccolta con sACSF ~ 25 mL.
- Avvolgere un cucciolo di P0-P2 in alcuni parafilm o un guanto e il posto che ben coperto sotto il ghiaccio. Impostare un timer per 5 minuti e avviarlo. Dopo quel tempo, rimuovere il pup e controllare che non risponde a pizzichi del hindpaw.
- Decapitare il pup e raccogliere la testa in una capsula di Petri piena di sACSF. Tagliare la pelle lungo la linea mediana per esporre il cranio.
- Individuare l'apertura nel cranio del hindbrain/midollo e inserirne l'estremità della pinza lungo porzione dorsale del cranio. Delicatamente afferrare il cranio al midline e 'buccia' via pezzi lateralmente per esporre il cervello, facendo attenzione a non danneggiare il cervello.
- Dopo la rimozione delle porzioni dorsale e laterale del cranio, utilizzare il forcipe o la spatola per rimuovere delicatamente il cervello dal cranio di scavare sotto la superficie ventrale del cervello, cercando di non danneggiare qualsiasi area. Mettere il cervello in un'altra capsula di Petri piena di carboxygenated sACSF.
Nota: Presentiamo due diverse strategie per la dissezione ippocampo, corpo striato e corteccia. La prima strategia (passi 5.1-5.10) è utile per qualsiasi linea di mouse mentre la seconda strategia (passaggi 6.1-6,7) avrebbe bisogno di un mouse di reporter fluorescente per separare correttamente il corpo striato da pallidus di globus e altre strutture cerebrali. Se non è desiderato il corpo striato, quindi ignorare le parti specifiche del corpo striato delle due tecniche
Figura 1 : Disegno schematico e immagini per dissezione cerebrale, tecnica #1
Tecnica di dissezione descritto ai punti 5.1-5.10. Se tessuto striatale è desiderato, inserire P1 cervello nel lato ventrale di matrici di cervello fino. Inserire lame di rasoio in matrice slot attraverso anteriore del cervello per ottenere sezioni coronali attraverso corpo striato. Rimuovere striatal pezzi da entrambi gli emisferi, ripetere per tutte le sezioni contenenti striato anteriore ippocampo. Se non è desiderato il tessuto striatale, semplicemente Henna il cervello, posizionare il lato mediale di emisferi fino nel piatto e rimuovere le strutture ventrale-mediale del cervello (talamo, gangli basali, ecc.) per esporre l'ippocampo. Utilizzare una pinzetta per pizzicare dell'ippocampo, poi capovolgere emisfero e utilizzare una pinzetta per sezionare un pezzo di tessuto corticale. Le linee nere verticali attraverso gli emisferi schematici dove i tagli sarebbe quella di rimuovere le sezioni striatal. Barra della scala = 500μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
5. raccogliere il corpo striato, ippocampo e corteccia, tecnica #1
- Posto intero cervello sulla divisione matrice stampo, lato ventrale fino. Posto 1 lametta attraverso la porzione più anteriore del cervello (attraverso il tratto olfattivo anteriore).
- Inserire un'altra lama di rasoio appena posteriormente al primo per generare una fetta di 0,5 mm e porre una lama di rasoio ulteriore posteriore a questo.
- Trasferire queste fette di una capsula di Petri con carboxygenated sACSF e posto il resto del cervello per un piatto separato con sACSF. Trasferire le fettine striatali a un ambito di dissezione per visualizzare il corpo striato. Queste fette dovrebbero contenere grandi porzioni dello striato anteriore e mancanza di ippocampo. Utilizzare un fluorescente dissezione ambito con NKX 2.1-Cre+ /-; Ai9+ /- fette per differenziare il tdTomato striatal debole segnale dal segnale forte tdTomato del pallidus di globus.
- Con o senza fluorescenza, pizzico fuori nello striato da entrambi gli emisferi su tutte le sezioni e trasferimento striatal pezzi di tubo da 50ml correttamente etichettati con sACSF, memorizzare sul ghiaccio.
- Henna il cervello lungo il midline usando pinze o una lama di rasoio, e posare l'emisfero in modo che la superficie mediale è rivolto verso l'alto.
- Rimuovere il tessuto di cervello ventrale (talamo, gangli basali, ecc) da pizzicamento fuori questo tessuto con il forcipe. Quando completato, l'ippocampo (una struttura a forma di salsiccia che attraversa l'asse antero-posteriore lungo la corteccia dorsale) e ventricolare laterale della corteccia dovrebbe essere chiaramente visibile.
- Per rimuovere l'ippocampo, inserire le punte della pinza davanti l'ippocampo anteriore e separare delicatamente l'ippocampo dalla corteccia spostando il forcipe posteriorly e pizzicotti lungo il confine hippocampal-corticale. Trasferire l'ippocampo isolato al tubo da 50ml correttamente etichettati con sACSF, memorizzare sul ghiaccio.
- Per sezionare la corteccia, posizionare il lato mediale di corteccia di hemisected. Quindi utilizzare il forcipe per pizzicare più dorsale, ventrale, anteriore e posteriore porzioni della corteccia di lasciare un pezzo quadrato di corteccia somatosensory mediale, ~ 2 mm x 2 mm. Flip la corteccia quindi lato mediale è fino e pulito di qualsiasi tessuto in eccesso non corticale (talamo dei gangli basali, ecc.) sulla superficie mediale se necessario. Trasferire il pezzo di corteccia al tubo da 50ml correttamente etichettati con sACSF, memorizzare sul ghiaccio.
- Ripetere la procedura con l'altro emisfero per raccogliere la corteccia e dell'ippocampo regioni.
- Ripetere questa procedura per tutti i cuccioli, avendo cura di sostituire la sACSF nei piatti petri tra cuccioli per garantire che il sACSF rimane fredda e fresca.
Figura 2 : Disegno schematico e immagini per dissezione cerebrale, tecnica #2
Tecnica di dissezione descritto ai punti 6.1-6,7. Cervello di perno su una dissezione laterale dorsale piatto fino. Dopo il peeling della corteccia in avanti, l'ippocampo e striato sono visibili e possono essere rimossi, quindi una sezione della corteccia può essere rimosso come descritto nella tecnica precedente. A seconda della linea di topi transgenici, striato possa essere pulito per rimuovere pallidus di globus e altri tessuti. In Nkx2.1Cre; Ai9 linea di topo, pallidus di globus ha una densità significativamente maggiore di pomodoro + cellule rispetto al corpo striato. Barra della scala = 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
6. raccogliere il corpo striato, ippocampo e corteccia, tecnica #2
- Posizionare il lato ventrale del cervello in una capsula Petri rivestite con sylgard contenente sACSF e pin attraverso il cervelletto e la corteccia anteriore o bulbi olfattivi.
- A partire da un emisfero, utilizzare forcipe curvo per separare delicatamente la corteccia posteriore dall'ippocampo sottostante e altri tessuti. Appoggiare delicatamente la corteccia sbucciata sul piatto petri. Ripetere per l'altro emisfero. Ippocampi e striato deve essere chiaramente visibile nel cervello esposto.
- Utilizzare pinze per pizzicare un ippocampo al midline e sbucciare ippocampo lateralmente da rimuovere. Inserire nella fiala di raccolta sul ghiaccio e ripetere con altri ippocampo.
- Per corpo striato, raschiare delicatamente intorno ai bordi dello striato per allentarlo dal tessuto circostante. Quindi rimuovere lo striato pizzicando esso fuori da sotto e aggiungere alla provetta di raccolta sul ghiaccio. Ripetere per altre striato.
- Sezioni di corticale possono essere raccolto come descritto al punto 5.8.
- Se si utilizza una linea di topo transgenico reporter (ad es., NKX 2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP, ecc.), trasferimento striato a una capsula di Petri con sACSF e mostra sotto fluorescenti ambito di dissezione. Utilizzare pinze per rimuovere qualsiasi tessuto non-striatale dal corpo striato (in NKX 2.1-Cre; Ai9 topi, rimuovere tutto il tessuto 'luminoso', come pallidus di globus ha densità molto più alta MGE-derivato, tdTomato + cella rispetto al corpo striato). Ripetere per tutti i corpo striato.
- Ripetere questa procedura per tutti i cuccioli, avendo cura di sostituire la sACSF nei piatti petri tra cuccioli per garantire che il sACSF rimane fredda e fresca.
7. generazione della singola cella dissociazioni
- Dopo la dissezione è completa, preparare un 1 mg/mL soluzione Pronase pesando 10 mg Pronase e dissoluzione in 10 mL carboxygenated sACSF.
- Trasferimento del tessuto dai flaconcini di collezione di 50 mL a 5 mL rotondo fondo tubi da 2 mL della soluzione Pronase-sACSF. Incubare il tessuto per 20 min a temperatura ambiente, agitando/sfogliando il tubo di 3 - 4 volte con il dito durante l'incubazione per mescolare i campioni.
- Durante questa incubazione, preparare la soluzione di ricostituzione: 1% FBS (100 μL) + dnasi (1 μL di 1: 10.000 borsa DNasi) in 10 mL carboxygenated sACSF.
- Dopo i 20 minuti, con attenzione rimuovere la soluzione di pronase per non disturbare il tessuto nella parte inferiore e sostituirlo con 1-2 mL di soluzione di ricostituzione (il volume totale è dipendente a partire di quantità di tessuto).
- Meccanicamente è possibile dissociare il tessuto mediante triturazione del tessuto con la pipetta di Pasteur lucidati a fuoco precedentemente preparato. A partire con la pipetta con foro grande (~ 600 µm), aspirare ed espellere la soluzione tessuto almeno dieci volte per rompere il tessuto. Non introdurre bolle nella soluzione. Ripetere questo processo per il mezzo foro pipetta e il piccolo foro pipetta. La soluzione dovrebbe essere nuvolosa e nessun chiaro pezzo di tessuto deve essere visibile nelle provette di raccolta.
- Dispensare la soluzione di lisato cellulare attraverso un filtro di 50 µm in provette coniche da 5 mL per rimuovere qualsiasi cella ciuffi. Procedere con queste soluzioni di singola cellula per citometria a flusso (o potenzialmente direttamente alla cella contando se nessun ordinamento è necessario).
8. preparazione delle soluzioni di FACS-purificato delle cellule per trapianto
- Dopo aver ricevuto le soluzioni di cella dal citometro a flusso, trasferire la soluzione in uno (o più) provette coniche da 1,5 mL e girare le cellule a 500 g per 5 min a 4oC. Dopo la centrifugazione, rimuovere supporti così che ~ 20-40 µ l rimangono nel tubo. Ricostituire le cellule in questo restanti media (e combinare soluzione se erano necessari tubi multipli).
- Su un piccolo pezzo di parafilm, mescolare insieme 2 µ l di soluzione di cella + 8 µ l sACSF + 10 µ l di macchia blu di trypan. Pipettare 10 µ l in un emocitometro con coperchio scorrevole.
- Contare il numero di cellule vive in ciascuna delle 4x4 griglie quadrate negli angoli dell'emocitometro utilizzando un contatore di mano del riscontro standard di laboratorio (cellule morte sarà blue dal colorante), e la media di questi 4 conteggi. Moltiplicare questo numero per 100 per determinare il numero di cellule per µ l.
- Se necessario, regolare il volume così le cellule sono ad una concentrazione di 10.000-30.000 cellule / µ l di soluzione di ricostituzione. Concentrazione finale dipende dalla quantità totale di cellule e numero desiderato dei trapianti. Mantenere le cellule in ghiaccio per trapianto
9. trapianto nel WT P0-2 cuccioli
- Avvolgere un pup WT in alcuni parafilm o un guanto e il posto che ben coperto sotto il ghiaccio. Impostare un timer per 5 min e avviarlo. Dopo quel tempo, rimuovere il pup e controllare che non risponde a pizzichi del hindpaw.
- Mentre il cucciolo è il ghiaccio, miscelare la soluzione delle cellule pipettando parecchie volte per garantire la sospensione cellulare è ben miscelata prima dell'imbarco (mescolare le celle prima di caricare la micropipetta per ogni iniezione). Quindi svuotare la micropipetta dell'olio minerale e riempirlo completamente con la sospensione cellulare.
- Appoggiate il pup anestetizzato di Petri con la sua testa sdraiato sulla massa adesiva in modo che la parte superiore della testa è relativamente piatta. Posizionare il metro con il foro del diamante in tutta la testa del cucciolo, tirandolo teso affinché la pelle è tesa e la testa è ferma, ma che il mouse è confortevole e respirare bene. Lambda deve essere visibile attraverso il foro del diamante.
Figura 3 : Disegno schematico e immagini per trapianto
(A) immagini dell'installazione di iniezione. Si noti che lambda è chiaramente visibile attraverso il cranio di pup e dovrebbe essere usato per l'azzeramento della micropipetta. Barra della scala = 1 pollice. (B) schema raffigurante la procedura di iniezione per indirizzare l'ippocampo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Spostare il pup protetto sotto il Nanoject e abbassare la micropipetta in modo che la punta della micropipetta è su direttamente sopra lambda. Registrare le coordinate x-y sul manipolatore.
- Regolare le manopole del manipolatore per spostare la micropipetta le coordinate desiderate lungo il mediolateral e l'asse antero-posteriore della testa: S1 corteccia → 1,0 mm anteriore e laterale di 1,0 mm, ippocampo → 0.75-1.0 mm anteriore e laterale di 1.0-1.2 mm, corpo striato → 2.0-2.2 mm anteriore e laterale di 1,5 mm. Coordinate possono essere regolate leggermente per compensare l'età del cucciolo (ad es., P0 vs P2) o il ceppo di topi (ad es., CD1 topi sono più grandi e C57/B6 a P2).
- Abbassare la micropipetta fino a formare una piccola concavità sulla pelle. Quindi ruotare la manopola di manipolatore asse z saldamente ma delicatamente per guidare la micropipetta attraverso la pelle e il cranio di entrare nel cervello. Quando la micropipetta entra nel cervello, uscirà la pressione sul cranio e la concavità scomparirà.
- Ritirare la micropipetta leggermente fino a quando la punta è circondata da un cono di pelle, a forma di come una tenda. Leggere le coordinate lungo gli assi z: questo sarà il punto di asse z zero.
- Abbassare la micropipetta alla profondità desiderata: corteccia → 0.75-1.0 mm, ippocampo → 1.2-1.5 mm, can 2.0-2.5 mm. profondità di corpo striato → essere regolato leggermente per compensare età o ceppo del cucciolo.
- Iniettare la sospensione cellulare utilizzando il programma di Nanoject III sopra descritto. Dopo l'iniezione il programma è completo, aspettare 15-20 s prima lentamente ritraendo la micropipetta per ridurre al minimo la soluzione fuoriuscita fuori del sito di iniezione.
- Se eseguendo iniezioni bilaterali, re-zero la micropipetta sopra lambda e spostare le coordinate appropriate in altro emisfero. In alternativa, si possono fare due iniezioni nella corteccia dell'emisfero stessa spostando la micropipetta anteriore della prima iniezione di 1 mm.
- Una volta che il trapianto è completo, rimuovere il nastro e trasferire il cucciolo sul blocchetto di riscaldamento. Se necessario, applicare i tag il pup ritaglio punta o coda. Una volta che il cucciolo ha riacquisito un colore rosso e si sta muovendo, posizionarlo nella gabbia con la madre.
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Representative Results
Questo protocollo viene illustrato come raccogliere regioni specifiche del cervello dal cervello postnatale precoce (Figura 1-2), raccogliere dissociazioni singola cella dei precursori Interneurone e trapianto di queste cellule in varie regioni del cervello in ingenuo WT cuccioli postnatali (Figura 3). Per l'analisi posthoc, cervelli che hanno ricevuto gli innesti Interneurone precursore sono state raccolte tra P30-35 per caratterizzare la morfologia delle cellule, marcatori neurochimici e proprietà elettrofisiologiche. Questi tipi di analisi sono spesso effettuati tra P21-P30 in topi normali, ma dato che la maturazione delle cellule trapiantate potrebbe essere leggermente ritardata a causa della procedura di dissezione/dissociazione, in attesa di ulteriori 5-10 giorni è consigliabile compensare questo maturazione in ritardo. Il tipo di analisi deve essere eseguita a dettare la strategia corretta per raccogliere il cervello. In particolare, non abbiamo osservato la morte delle cellule preferenziale di sottogruppi specifici Interneurone che potrebbe bias per o contro alcuni sottotipi20.
Per l'analisi di immunohistochemical, topi sono stati irrorati con paraformaldeide al 4% e i cervelli sono stati rimossi. 50 μm vibratome fette erano preparati attraverso la regione del cervello mirato e memorizzati nella soluzione antigelo e/o trattati per immunostaining come descritto in precedenza20. Alcuni cervelli non conteneva alcun pomodoro + cellule, che potrebbero essere a causa di targeting (ad es. iniezione troppo in profondità nel ventricolo) improprio, cellule perdite o che subiscono gli apoptosi durante la procedura d'innesto o rigetto delle cellule trapiantate dall'host. Basato su conteggi di cella finale, si stima che solo il 2-5% delle cellule innestate sopravvivere20, che è in linea con altri22,procedure di trapianto23.
Non sorprendentemente, non c'era significativa variabilità del numero totale di cellule di pomodoro + nel trapianto di successo, che vanno da decine a diverse migliaia di pomodoro + celle (Figura 4A). Le cellule innestate sono state localizzate nelle regioni corrette, con molti visualizzazione Interneurone morfologie e marcatori neurochimici Interneurone ben caratterizzati (Figura 4B). Profili di maturazione e numeri di sopravvivenza delle cellule simili sono stati osservati anche quando le cellule sono state innestate in nuovi ambienti in heterotopic trapianti (Figura 4).
Oltre alle analisi immunohistochemical, analisi elettrofisiologica sulle cellule innestate è stato effettuato per confermare che essi hanno integrato nei circuiti cerebrali e visualizzare le proprietà intrinseche e cottura prevista. Cervelli sono state raccolte dai topi P30-35 e fette preparato per le registrazioni fisiologiche come precedentemente descritto20. Gli interneuroni innestate presentato adulto-come le proprietà fisiologiche e cottura distinto modelli potrebbero essere caratterizzato che fossero rappresentative di ben caratterizzati Interneurone sottotipi (Figura 5A), suggerendo che innestano interneuroni sono stati in grado di maturare correttamente nell'ambiente host. Per verificare che le cellule trapiantate sono state integrate in una rete neuronale, sEPSC sono stati anche registrati (figura 5B). Inoltre, un sottoinsieme dei trapianti sono stati eseguiti con interneuroni esprimendo ChR2 seguita da registrazione da cellule piramidali localizzate vicino a interneuroni trapiantati. Questi dati hanno dimostrato che correnti postsinaptiche GABAergici sono evocate da luce blu (Figura 5-D).
Figura 4 : Innestate Interneurone precursori popolano regioni cerebrali host sezioni rappresentative da topi WT P30 che sono stati trapiantati con pomodoro + precursori Interneurone P1. (A) In omotope trapianti di corteccia di corteccia, le cellule innestate compilare tutti gli strati corticali e visualizzare morfologie che imitano interneuroni endogeni. Immagini selezionate evidenziano la variabilità nei numeri delle cellule da diversi trapianti, con l'immagine di sinistra avendo un numero molto maggiore di pomodoro + celle per ogni sezione rispetto al trapianto sul lato destro. (B) ingrandimento basso (a sinistra) e sezioni rappresentative ad alto ingrandimento (a destra) da innesti di ippocampo-a-ippocampo eterologhe. Si noti che la maggior parte delle cellule di pomodoro + nella strato oriens (così) esprime SST (cellule probabile O-LM) mentre molti pomodoro + cellule nel corneum pyramidale (SP) esprimono PV (cellule probabile cestino), simili a interneuroni hippocampal endogeni. (C) esempio di un trapianto heterotopic (Cortex-a-corpo striato) con pomodoro + presenti nel corpo striato. Scala bar = 200 μm nella A nel pannello di mag basso in B, 50 μm in C e ad alta potenza mag in B. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Interneuroni innestate sono electrophysiologically maturi e di integrare in una rete neuronale di host
(A) esempi rappresentativi delle più alte frequenze di infornamento registrato da interneuroni innestate. Sinistra, Fast Spiking Interneurone da un innesto di anca-a-Ctx, iniettato corrente passi:-100 pA e pA 520; giusto, Non-Fast Spiking Interneurone da un innesto di Ctx-a-Ctx, iniettato corrente passi: -100 pA e 360 PA. (B) esempio di sEPSC registrato in un interneurone tardi chiodare da un trapianto per Hip Hip. (C) immagine rappresentativa visualizzazione NKX 2.1-Cre; Ai32 trapianto di cellule (YFP) da un Ctx-a-Ctx con una cellula piramidale (rossa) biocitina-riempito. Barra della scala = 50 μm. (D) esempio di una correnti postsinaptiche GABAergici evocata da impulsi di luce blu registrato in cellule piramidali, registrato con un [145 mM Cl-]. Nelle tracce di nere, media; in rosso, la risposta media registrata in presenza di Gabazine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Un aspetto critico di questo protocollo è massimizzare le possibilità di sopravvivenza delle cellule. Garantire che i tessuti e le cellule siano sempre in ghiaccio freddo carboxygenated sACSF è necessario promuovere la sopravvivenza delle cellule. Ciò richiede una strategia di dissociazione per ridurre al minimo la lunghezza del tempo che le cellule spendono in varie soluzione e all'esterno dell'ambiente di cervello e di dissezione efficiente. A seconda del numero di regioni del cervello essere sezionato e trapiantato, può essere utile avere un partner di aiuto nei passaggi dissezione e/o trapianto per diminuire la durata dell'esperimento. Per garantire la salute e la sopravvivenza del cucciolo, è anche fondamentale per ridurre al minimo il tempo di anestesia di ghiaccio (< 4 min) e tenere il cucciolo riscaldato con luce durante la procedura di trapianto.
Non ci può essere significativa variabilità nei cervelli trapiantati, alcuni possono non contenere eventuali cellule innestate mentre altri cervelli conterrà migliaia. Combinando diverse cucciolate di P0-P2 per dissezione può aumentare il numero di cellule raccolte per l'innesto, che permette di aumentare la densità delle cellule del trapianto e/o aumentare il numero di cuccioli innestati, entrambi i quali migliorerà la probabilità di trapianti di successo. Per impostare come destinazione la regione del cervello corretta, è fondamentale che la testa di pup è stabilizzato e non si sposta quando si abbassa la micropipetta nel cervello. Qualsiasi spostamento della testa o flessione dell'albero micropipetta può causare iniezioni mistargeting e imprecise (come la perdita delle cellule nel ventricolo laterale). Inoltre, eseguendo più siti di iniezione al pup (unilateralmente o bilateralmente) può migliorare le percentuali di successo nel caso in cui un sito di iniezione è mistargeted. In futuro, sarebbe ottima per sviluppare una strategia più efficiente stereotassica per stabilizzare il pup e fornire iniezioni più accurate e coerenti.
Lasso di tempo di TH P0-P2 è stato scelto per motivi sia scientifici che tecnici. A questa età, la maggior parte Interneurone precursori hanno migrato ai loro siti terminale ma hanno minime interazioni ambientali. Questo lasso di tempo può non valere per altri tipi di un neurone delle cellule e le regioni del cervello, così si potrebbe desiderare di regolare questi punti temporali per i loro scopi specifici. Ad esempio, sarebbe interessante confrontare il potenziale terapeutico di questi precursori di Interneurone P0-P2 raccolte con le cellule raccolte MGE: un'età può avere ulteriori benefici e/o meno effetti collaterali indesiderati rispetto agli altri. Inoltre, potrebbe essere interessante eseguire trapianti eterocronico (ad es., raccolta di cellule a P0-P2 e il trapianto in P7-10 cervelli, o viceversa) per identificare le modifiche come temporale nell'ambiente potrebbero influenzare il destino delle cellule e maturazione. Il vantaggio di eseguire iniezioni a P0-2 è che il teschio è relativamente sottile e può essere facilmente penetrato con una micropipetta tagliente. Eventuali iniezioni sopra P5 richiederà la rimozione o l'assottigliamento del cranio.
L'analisi descritta in questo protocollo è limitato a specifiche caratteristiche dei sottotipi di Interneurone differenzialmente espressi tra regioni del cervello. In futuro, uno potrebbe utilizzare la potenza di sequenziamento di singola cellula per caratterizzare il trascrittoma completo delle cellule innestate. Questo approccio imparziale in grado di identificare geni specifici (o più grandi cascate di segnalazione) che sono fortemente arricchiti o impoveriti in cellule trapiantate rispetto ai controlli, che fornirebbero spaccato candidato stimoli ambientali che avrebbero influenzato il destino determinazione o maturazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health (K99MH104595) e il programma di ricerca intramurale NICHD a T.J.P. Ringraziamo Gord Fishell, nel cui laboratorio questo approccio originalmente è stato stabilito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
References
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