Summary
Hier presenteren we protocollen om te visualiseren calcium (Ca2 +) Reacties ontlokte door HeLa cellen besmet door Shigella. Door het optimaliseren van de parameters van een bacteriële infectie en imaging met Ca2 + fluorescerende sondes, worden atypische globale en lokale Ca2 + signalen veroorzaakt door bacteriën over een groot bereik van de kinetiek van de infectie gekenmerkt.
Abstract
CA2 + is een alomtegenwoordige ion bij alle bekende cellulaire processen betrokken zijn. Terwijl de globale Ca2 + reacties kunnen invloed hebben op het lot van de cel, reguleren lokale variaties in gratis Ca2 + cytosolische concentraties, gekoppeld aan het bevrijden van interne winkels of een toestroom via plasmamembraan kanalen, corticale cel processen. Ziekteverwekkers die voldoen aan anders binnenvallen gastheer cellen trigger een reorganisatie van het cytoskelet van de actine ten grondslag liggen aan de host plasmamembraan, die waarschijnlijk van invloed op zowel lokale als globale Ca2 + signalering. Omdat deze gebeurtenissen bij lage frequenties in een pseudo-stochastische wijze over uitgebreide kinetiek voordoen, verhoogt de analyse van Ca2 + signalen veroorzaakt door pathogenen grote technische uitdagingen die moeten worden aangepakt.
Wij rapporteren hier protocollen voor de detectie van globale en lokale Ca2 + signalen op een Shigella besmetting van epitheliale cellen. In deze protocollen, artefacten gekoppeld aan een langdurige blootstelling en photodamage geassocieerd met de excitatie van Ca2 + fluorescerende sondes zijn daarvoor door strikt de overname parameters controle over bepaalde perioden tijdens een Shigella invasie. Procedures om te analyseren rigoureus de amplitude en frequentie van globale cytosolische Ca2 + signalen tijdens uitgebreide infectie kinetiek met behulp van de chemische sonde Fluo-4 ten uitvoer worden gelegd.
Introduction
CA2 + regelt alle bekende cel procédés, met inbegrip van cel dood trajecten aan gastheer-pathogeen interacties1,2,3gerelateerde cytoskeletal reorganisatie en inflammatoire reacties. Onder fysiologische omstandigheden, basale cytosolische Ca2 + concentraties zijn laag, in de honderden nM-bereik, maar kunnen worden onderworpen aan tijdelijke verhogingen op agonist stimulatie. Deze variaties tonen vaak oscillerende gedrag door het optreden van pompen en kanalen in het plasma en endoplasmatisch reticulum membranen. Het patroon van deze oscillaties wordt gekenmerkt door de periode, duur en amplitude van Ca2 + toeneemt, en wordt gedecodeerd door cellen die, op zijn beurt leiden specifieke reacties tot in wat bekend als de Ca2 + code4,5 staat . Een aanhoudende stijging van de cytosolische Ca2 + concentratie onder pathologische omstandigheden kan leiden tot de dood van de cel die is gekoppeld aan de permeabilization van de mitochondriale membraan en de vrijlating van de pro-apoptotic of necrotische factoren6, 7.
Shigella, de verwekker van bacillaire dysenterie, binnenvalt epitheliale cellen door het injecteren van effectoren in cellen van de gastheer met een type III secretie systeem (T3SS)8,9. Een Shigella -invasie van cellen van de gastheer wordt geassocieerd met lokaal en mondiaal Ca2 + signalen ontlokte door de T3SS. Wat betreft de porie-vormende toxinen, de T3SS translocon dat wordt ingevoegd in de celmembranen van de gastheer en is vereist voor de injectie van T3SS effectoren waarschijnlijk is verantwoordelijk voor de activering van PLC en de inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-afhankelijke Ca2 + release. De combinatie van de gelokaliseerde PLC stimulatie en de accumulatie van gepolymeriseerde actine bij plaatsen van een Shigella invasie resultaat in een opslagruimte langdurige InsP3-afhankelijke Ca2 + release10. Het type III effector IpgD, een fosfatidyl 4,5 difosfaat (PIP2) -4-fosfatase, beperkt de lokale hoeveelheid PIP2, waardoor de controle van de hoeveelheid beschikbaar materiaal voor PLC voor het genereren van InsP3, die aan de opsluiting van lokale Ca2 bijdraagt + Reacties op11,12van de sites van de bacteriële invasie. Deze lokale Ca2 + reacties waarschijnlijk bijdragen tot de actine polymerisatie op Shigella invasie sites10. Global Ca2 + antwoorden die ook door Shigella, echter ontlokte zijn zijn overbodig voor de invasie van bacteriën proces maar leiden tot de opening van connexin hemichannels op het plasma-membraan en de vrijlating van ATP in de extracellulaire compartiment. Vrijgegeven ATP handelen op een wijze van paracrine, op zijn beurt, stimuleert Ca2 + oscillerende reacties in de cellen naast de geïnfecteerde cel. IpgD is ook verantwoordelijk voor het vormgeven van globale Ca2 + reacties in grillige geïsoleerde reacties met langzame dynamiek. Uiteindelijk, na een langdurige bacteriële infectie leidt IpgD tot de remming van InsP3-gemedieerde Ca2 + signalen. Via haar bemoeienis met Ca2 + signalering, IpgD vertragingen een Ca2 +-afhankelijke calpain activering leidt tot de demontage van focal hechting structuren en de voortijdige detachement van geïnfecteerde cellen13.
Terwijl Ca2 + signalen bij kritieke aspecten van pathogenese betrokken zijn, verhoogt het gebruik van een micro-organisme een aantal technische uitdagingen die niet in klassieke agonist studies voordoen zich. De protocollen beschreven hier gebruik maken van de gebruikte TL Ca2 + chemische indicator Fluo-4 die we ontworpen om te karakteriseren van lokale Ca2 + signalen tijdens een Shigella -infectie. Stappen van cruciaal belang voor het opsporen van deze signalen worden besproken, evenals procedures voor hun kwantitatieve analyse die vereist is voor het karakteriseren van de rol van bacteriële effectoren in Ca2 + signalering geïmplementeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding
-
Voorbereiding van de bacteriën
- Plaat van de bacteriën —Shigella wild-type stam uiting geven aan de AfaE adhesine (M90T-AfaE) — op een trypticase (TCS) soja agar plaat met 0,01% Congo rood (CR) en hen Incubeer gedurende 18 uur bij 37 ° C.
Opmerking: Het vergroten van hun reproduceerbaarheid, de Shigella platen verkregen in stap 1.1.1 bij 4 ° C worden opgeslagen en moeten worden gebruikt binnen een week, omdat alle kolonies op de drager van de CR uiteindelijk rood zal na verloop van tijd. - Inoculeer TCS Bouillon pre cultuur door het plukken van 3 rode koloniën aan de streep platen.
Opmerking: Een inenting met 3 kolonies uitgevoerd om het beperken van de kans van het kiezen van een enkele kloon waarvan virulentie plasmide heeft ondergaan een genetische recombinatie. - Groeien vloeibare bacteriele kweken in een schudden incubator voor 16 h bij 37 ° C bij 200 omwentelingen per minuut. Ampicilline toevoegen om een eindconcentratie van 75 mg/mL. Antibiotica concentraties moeten niet meer bedragen dan 3 x de minimale remmende concentratie, omdat een overmaat aan antibioticum tot het verlies van de plasmide van grote virulentie leiden kan.
Opmerking: De handhaving van de Shigella virulentie plasmide moet worden geverifieerd door de bacteriële culturen op CR platen aangevuld met de juiste antibiotica concentratie plating. De aanwezigheid van witte kolonies geeft plasmide verlies. - Beënt de TCS cultuur met de pre bacteriecultuur bij een verdunning 1:100. Na het bebroeden bij 37 ° C in een schudden incubator voor 2 h bij 200 omwentelingen per minuut. Zorgen dat de optische dichtheid bij 600 nm (OD600nm) is 0,2 - 0,4.
- Centrifugeer de bacteriecultuur voor 2 min bij 13.000 x g bij 21 ° C en resuspendeer de pellet in een equivalent volume EM medium (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2, 5 mM glucose en 25 mM HEPES pH = 7.3).
- Verdun de bacteriële suspensie in de buffer van een EM op een definitieve OD600nm 0.1 en gebruik het onmiddellijk of opslaan bij 21 ° C en het binnen de volgende 60 min.
- Plaat van de bacteriën —Shigella wild-type stam uiting geven aan de AfaE adhesine (M90T-AfaE) — op een trypticase (TCS) soja agar plaat met 0,01% Congo rood (CR) en hen Incubeer gedurende 18 uur bij 37 ° C.
-
Voorbereiding van de cel
- Cultuur HeLa cellen in DMEM met 1 g/L van glucose aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en ze groeien bij 37 ° C met 10% CO2. TC-7 gegroeid in DMEM met 4,5 g/L van glucose, met 10% FCS en niet-essentiële aminozuren in een incubator van de 37 ° C met 10% CO2groeien.
- Voor de cel onderhoud, splits de cellen regelmatig om te voorkomen dat een remming van de groei-contact gekoppeld aan confluente Staten; Dit is essentieel voor een Ca2 + sonde laden/transfectie hoogrenderende.
- Plaat HeLa cellen op steriele 25-mm diameter circulaire coverslips in 6-Wells-platen bij een dichtheid van 3 x 105 cellen/put de dag voordat het experiment voor de HeLa cellen.
- Voor TC-7 cellen, trypsinize en cellen tellen. Zaad hen bij 4 x 105 cellen/well en broeden ze 5-7 dagen bij 37 ° C in een 10% CO2-incubator voor de experimenten te voorzien van een polarisatie.
- Vernieuw het kweekmedium cel elke dag tot de dag van het experiment.
Opmerking: Glazen-bodem 35-mm diameter wegwerp kamers kunnen ook worden gebruikt als alternatief voor de coverslips-bevattende putten. Als de laatste zijn gebruikt, temperatuurregeling door een verwarmde fase of doel niet voldoende is, en een thermostaat incubatie kamer gemonteerd op is het stadium van de Microscoop vereist.
- Vernieuw het kweekmedium cel elke dag tot de dag van het experiment.
- De dag van het experiment, verwijder het medium en wassen van de cellen 3 x met 1 mL EM medium bij 21 ° C.
- Laden van de cellen met 3 mM Fluo-4-AM14 in een buffer EM gedurende 30 minuten bij 21 ° C.
Opmerking: Terwijl het laden van sub confluente HeLa cellen er geen grote problemen, het laden van gepolariseerde TC-7 cellen is vaak heterogene en slecht efficiënt. Voor deze cellen, vonden we dat het rendement van het laden wordt versterkt door de toevoeging van de verspreiden agent — pluronic zuur — op een eindconcentratie van 0,1% en het anion-transporter remmer bromosulfophtalein op een eindconcentratie van 20 µM naar de Fluo-4-AM-bevattende EM. Het gebruik van ratiometric chemische sondes of genetisch gecodeerd-FRET sondes die dual-overname niet compatibel met de snelheid van verwerving nodig is voor de beeldvorming van lokale Ca2 + reacties is. - Wassen van de monsters 3 x met EM buffer en verder broeden ze in 1 mL EM buffer bij 21 ° C te voorzien in de hydrolyse van de AM-groep. Gebruik Fluo-4 geladen cellen onmiddellijk of binnen de komende 90 min (behouden bij 21 ° C).
2. infectie en beeldacquisitie van lokale Ca2 + antwoorden
- Plaats het dekglaasje aan met de Fluo-4 geladen cellen in een imaging kamer of een glazen-bodem cupje. Wassen van de monsters in de beeldvorming zaal of wegwerp glazen-bodem kamer 3 x met EM buffer om verbindingen mogelijk als gevolg van lysis van de cel. Voeg vervolgens 1 mL van EM buffer.
- Plaats van de kamer in een omgekeerde fluorescentie Microscoop werkgebied verhit tot 33 ° C.
Opmerking: Deze temperatuur is geselecteerd als een compromis tussen de optimale temperaturen die compatibel is met het proces van Shigella invasie en de vertraging van Ca2 + reacties te visualiseren van lokale reacties. We gebruiken een 63 X onderdompeling olie doelstelling (NB = 1,25) uitgerust met fase contrast ringen. - Selecteer een veld microscopie en overname parameters, met inbegrip van de blootstellingstijd en weggooien indien nodig te optimaliseren de Fluo-4 TL signaal instellen.
Opmerking: De belangrijkste uitdagingen voor lokale Ca2 + imaging zijn de lage amplitude en de kleine duur van de reacties, waarvoor overname ten minste elke 30 ms. verschillende verkrijgbare achterzijde verlicht EM-CCD of C-Mnd camera's presenteren de vereiste gevoeligheid te detecteren lokale Ca2 + reacties met Fluo-4. Detectie gevoeligheid is ook een belangrijk aandachtspunt te beperken photodamage of artefacten zoals spontane reacties gekoppeld aan de fluorescerende excitatie van Fluo-4 op een hoge frequentie. Hier, een LED-gebaseerde verlichting van 470 nm, met een 480 ± 40 nm band pass excitatie filter, een 505-nm dichroïde filter en een 527 ± 30 nm band pass emissie gebruikt op 5% van de maximale intensiteit gecombineerd met een 1.0 neutrale-opaciteitsfilter werden gebruikt om deze problemen te minimaliseren onder een stroom van verwervingen van beperkte duur. Een analyse van lokale Ca2 + signalen door partijen van 120 s streams werd routinematig uitgevoerd. Onder deze omstandigheden laag verlichting werd fluorophore photobleaching niet waargenomen tijdens de 2 min-stream acquisities. Opeenvolgende overnames op hetzelfde monster kunnen worden uitgevoerd, mits de andere velden worden gebruikt. Als algemene regel, wordt een eerste acquisitie-stream uitgevoerd op een veld van het besturingselement in de afwezigheid van bacteriën stimulatie om ervoor te zorgen het ontbreken van spontane reacties. Als spontane reacties worden waargenomen, worden de monsters gewassen met EM buffer totdat geen reacties worden waargenomen. - Te voegen bacteriën aan het monster, 500 µL van EM buffer verwijderen uit de zaal en voeg 500 µL van de bacteriële suspensie in stap 1.1.6 willen verkrijgen van een definitieve OD600nm van 0.05, met de juiste zorg om te voorkomen dat het verplaatsen van het veld geselecteerde microscopie; de volumes zorgen voor een goede menging van de bacteriën en een homogene verdeling van de bacteriën op de celsteekproeven.
- Het uitvoeren van een overname op de bacteriële toevoeging. U kunt ook uitvoeren een overname 10 min na de bacteriële toevoeging, die correspondeert met de tijd die nodig is voor bacteriën om sediment op cellen onder de voorwaarden gebruikt. Aan het einde van de stream van de verwerving, door een fase contrast-beeld van het geselecteerde veld naar het visualiseren van de bacteriën die contact met de cellen en het membraan ruches gekoppeld van de sites van de bacteriële invasie te verwerven.
- Herhaal de overname procedure zoals in stap 2.5, met tussenpozen die zich lenen voor de duur van de afbeelding acquisities, de besparingen van de bestanden en de selectie van een nieuw veld ter dekking van het hele proces.
Opmerking: Voor Shigellavonden we dat verwerving stromen elke 5 min voor 20 min, na de 10 min bacteriële sedimentatie, toegestaan ter dekking van de meerderheid van de gebeurtenissen van de invasie. - Toevoegen aan het einde van de aankoop procedure, een eindconcentratie van 2 µM van de Ca2 + ionophore ionomycin monsters om te bepalen van de maximale amplitude van de Ca2 + signalen. Verwerven van beelden elke 3-5 s tot signaal stabilisatie, meestal voor minder dan 10 min.
- Volg door toevoeging van Ca2 + complexvormer EGTA aan een eindconcentratie van 10 mM tot het bepalen van het signaal van de fluorescentie bij gebrek aan Ca2 +. Verwerven van beelden elke 3-5 s tot signaal stabilisatie, meestal voor minder dan 10 min.
Opmerking: Vanwege de relatief trage dynamiek van de wereldwijde Ca2 + variaties, voeren deze acquisities elke 3-5-s (niet in streaming modus), waardoor voor Ca2 + imaging op hetzelfde microscopische veld tijdens de opeenvolgende behandelingen.
3. analyse
- Express cytosolische Ca2 + variaties na verloop van tijd als het percentage van ΔF/F0, waarbij ΔF staat voor de variatie van de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde van de regio van belang (ROI) en F0 de basislijn fluorescentie in de dezelfde ROI, waaraan een niet-relevante regio van het veld verstoken van cellen wordt afgetrokken.
- Verwijderen van de basale fluorescentie-niveaus voor elke cel in verschillende velden, overeenkomt met de basislijn niveaus; deze niveaus ondubbelzinnig kunnen worden vastgesteld als gevolg van de lage frequentie en relatief korte duur van lokale Ca2 + reacties in de verwerving van een bepaalde stroom.
Opmerking: Kwantificeren opvallende kenmerken van de antwoorden aan de vragen gerelateerde en de pathogene model studeerde. Klassiek, worden verschillende parameters in aanmerking genomen om te analyseren van Ca2 + signalen, met inbegrip van de frequentie van cellen met lokale of globale Ca2 + reacties, evenals de duur, amplitude en frequentie van deze antwoorden. In het geval van Shigella en lokale reacties is een ander belangrijk aspect van de analyse de ruimtelijke vereniging van de reacties met sites van de bacteriële invasie.
- Verwijderen van de basale fluorescentie-niveaus voor elke cel in verschillende velden, overeenkomt met de basislijn niveaus; deze niveaus ondubbelzinnig kunnen worden vastgesteld als gevolg van de lage frequentie en relatief korte duur van lokale Ca2 + reacties in de verwerving van een bepaalde stroom.
- Tekenen om te kwantificeren het percentage responsieve cellen weergegeven: globale of lokale reacties, ROIs in cellen, in de tijd-serie overeenkomt met de variaties van Fluo-4 intensiteit.
- Stel strikte parameters te identificeren lokale Ca2 + reacties, zoals een amplitude van drievoudig bovenstaande verschillen in de achtergrond van de gemiddelde fluorescentie basislijn voor de cel van de intensiteit, of een duur van ten minste 200 ms, om te voorkomen dat het scoren van een vals positief.
Opmerking: Als een algemene regel, zelfs kleine lokale Ca2 + reacties van elke achtergrondgeluiden kunnen worden onderscheiden door hun profiel. De ROI moet groot genoeg zijn om te integreren genoeg signalen van de fluorescentie te voorzien in de opsporing van lokale variaties. Afhankelijk van de intensiteit van de detectie van Fluo-4, kunnen deze ROIs overeen met cirkels met een diameter variërend van 2-5 mM. - Het meten van de variaties van de gemiddelde Fluo-4 intensiteit van de fluorescentie in 2 regio's in een afzonderlijke ruimte van dezelfde cel, om te bepalen of de antwoorden lokaal of globaal zijn.
Opmerking: De analyse van een groot aantal cellen wordt vergemakkelijkt door het gebruik van beeldbewerkingssoftware toelaat de on-line schermweergave van de variaties van de intensiteit van de gemiddelde fluorescentie na verloop van tijd voor de geselecteerde regio's. Commercieel verkrijgbare imagingsoftware heeft een dergelijke optie, maar dit kan ook worden uitgevoerd met behulp van de Icy freeware, de ROI intensiteit Evolution -plug-in gebruiken. - Het bepalen van het percentage cellen met lokale reacties.
Opmerking: Dit percentage is berekend op basis van het totale aantal cellen geanalyseerd op het gebied van de microscopie, die in voldoende mate moet ter ondersteuning van een statistisch belang met behulp van een niet-parametrische test. - Bepaal de duur van de lokale reacties.
Opmerking: Lokale Ca2 + reacties kunnen worden verder onderscheiden volgens hun duur bereiken (dat wil zeggen, minder dan 500 ms, tussen 5 en 10 s, of boven 10 s) en hun associatie met Shigella invasie sites.
- Stel strikte parameters te identificeren lokale Ca2 + reacties, zoals een amplitude van drievoudig bovenstaande verschillen in de achtergrond van de gemiddelde fluorescentie basislijn voor de cel van de intensiteit, of een duur van ten minste 200 ms, om te voorkomen dat het scoren van een vals positief.
- Kwantificeren van de amplitude van de reacties. Eerst, moet u de maximale Ca2 + en cel achtergrondniveaus bepaald zoals in stap 2.1.7 kalibreren. Aangezien de Fluo-4 belasting voor elke cel variëren kan, worden deze bepalingen voor afzonderlijke cellen in het veld uitvoeren.
- De amplitude van de reacties wordt uitgedrukt als een relatieve percentage van de maximale respons.
- Uit te voeren statistische tests met een test van de normaliteit, gevolgd door een parametrische test voor het analyseren van mogelijke verschillen in de amplitude van de reacties tussen de monsters.
- Het bepalen van de vereniging van deze reacties ten opzichte van de sites van de bacteriële invasie door hun respectieve localization voor de bacteriële-geïnduceerde membraan ruches in de overeenkomstige fase contrast beelden gevisualiseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Shigella invasie wordt geassocieerd met atypische langdurige lokale Ca2 + antwoorden:
Naar aanleiding van het bovengenoemde protocol, Fluo-4-loaded HeLa cellen werden uitgedaagd met WT Shigella en stream acquisities werden uitgevoerd om te analyseren van Ca2 + signalen. Een representatieve experiment is afgebeeld in Figuur 1, met time-lapse beelden serie van de intensiteit van de fluorescentie van de sonde van de Fluo-4 gemiddeld in een regio van belang voor een enkele cel, en de overeenkomstige fase contrast afbeelding (figuur 1A, links deelvenster). De site van de invasie Shigella wordt gekenmerkt door membraan ruches gedetecteerd in de fase contrast-afbeelding (figuur 1A, pijl). Atypische lokale verhoogt in gratis cytosolische Ca2 + worden waargenomen bij de Shigella invasie site met een verschillende amplitude en duur variërend van 2,5-5 s (figuren 1A en 1B, pijlen), gevolgd door de wereldwijde toename van de besmette cel (figuur 1B, pijlpunten).
Het type III effector IpgD regelt de overgang van lokale tot globale Ca2 + reacties geïnduceerd door Shigella in HeLa cellen:
De analyse van Ca2 + signalen geïnduceerd door wild-type Shigella en een gebrekkige isogene gemuteerde stam voor het type III effector IpgD, een fosfatidyl 4, 5 difosfaat fosfatase, aangegeven dat deze laatste soort meer globaal en minder geïnduceerde atypische lokale reacties met een lange duur (RATPs) met 11.3 ± 4.4 (SEM) % en 40.3 ± 7.5 (SEM) % van de cellen reageren met wereldwijde reacties in het geval van een mutant WT en ipgD, respectievelijk (Figuur 1 d)15. Deze mutant ipgD krijgt lokale reacties met een vergelijkbare frequentie als de WT-stam.
Shigella remmen InsP3-afhankelijke global Ca2 + verhoogt in HeLa cellen tijdens langdurige infectie kinetiek:
De beeldvorming van globale Ca2 + reacties over uitgebreide infectie kinetiek gewezen op een afname van de frequentie van reacties 30 min na de uitdaging met wild-type Shigella (figuur 2A). Een soortgelijke daling van de frequentie van Ca2 + reacties werd waargenomen in TC-7 cellen besmet voor 30 min met wild-type Shigella15. De kwantificering van de dosis-afhankelijke cel reacties op de histamine Ca2 + agonist illustreert de remming van een InsP3-afhankelijke Ca2 + release op late stadia van een Shigella -infectie. WT Shigella leidt tot atypische geïsoleerde Ca2 + reacties tijdens de eerste 30 min van de infectie en na verdere incubatie, een drastische afname van de amplitude en frequentie van Ca2 + reacties werd waargenomen (figuur 2B).
Figuur 1 . Lokale en globale Ca2 + reacties tijdens Shigella invasie. HeLa cellen werden geladen met Fluo-4-AM en uitgedaagd met WT Shigella. (A) het linker paneel toont fase-contrast beelden. Het rechter paneel toont tijdreeksen van Fluo-4 fluorescentie gemiddelde intensiteit met de kleurcode hiernaast afgebeeld. De tijd vanaf het begin van de verwerving is aangegeven in seconden, 10 min na de bacteriële uitdaging. De pijl geeft de invasie foci. De cirkels afgebeeld komen overeen met de regio's geanalyseerd in (B) waar de sporen met de overeenkomstige kleur vertegenwoordigen de variaties in Fluo-4 gemiddelde fluorescentie intensiteit boven de basislijn. De pijlen geven aan lokale reacties. Lijn de pijlpunten uit geven aan wereldwijde reacties. (C) Dit is een regeling die de bepaling van de duur van de Ca2 + antwoorden. De horizontale stippellijn geeft aan de basale Ca2 + niveaus (F,0); de verticale balken geven aan verschillen in de achtergrond. De verticale stippellijn geeft de maximale amplitude van het antwoord; de horizontale balken geven de duur van de reactie die is vastgesteld op de helft-maximale amplitude. (D) Dit is het percentage van de responsieve cellen ± SEM tonen van lokale reacties en globale Ca2 + reacties geïnduceerde 5 min na infectie met de WT Shigella (donkere grijze balken) of de mutant ipgD (licht grijze balken). RATPs zijn lokale Ca2 + reacties die duren voor meer dan 5 s. N = 4; > 60 cellen voor elke keer. Wilcoxon toets, *P < 0,05; P < 0,01. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Remming van de wereldwijde Ca2 + reacties tijdens uitgebreide kinetiek van Shigella besmetting. (A) de bovenste blauwe pijlen staan voor de tijdschaal van de bacteriële en histamine uitdaging bij de aangegeven concentraties. Dit paneel toont de representatieve sporen van eencellige global Ca2 + variaties na de infectie door de WT Shigella (groen) en ipgD gemuteerde stam (oranje). (B) dit paneel toont het percentage van de amplitude van Ca2 + reacties ten opzichte van de maximale reactie, op een stimulatie op 0,5 μM histamine van de cellen besmet met de aangegeven stammen voor 90 min. De ononderbroken horizontale balk geeft het gemiddelde maximale percentage. Wilcoxon toets, **P < 0,01. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript wordt het protocol dat we ontworpen om te volgen van lokale Ca2 + signalen tijdens de relatief korte kinetiek van een Shigella -invasie, evenals global Ca2 + reacties tijdens de uitgebreide kinetiek van Shigellabeschreven. Hieronder signalen kwesties kunnen worden gevonden die moeten worden aangepakt om het optimaliseren van de opsporing van Ca2 + toets terwijl het minimaliseren van elke bemoeienis met de biologische processen.
Chemische vs. gecodeerd genetisch Ca2 + sondes:
Naar image lokale Ca2 + variaties, gebruikten we de Fluo-4 chemische sonde vanwege haar hoge quantumrendement en de dynamiek van snelle reactie. De snelheid die nodig zijn voor de verwerving ook verzet zich tegen het gebruik van ratiometric de sondes, aangezien de verwerving van een dubbele golflengte kan niet worden uitgevoerd. Het gebruik van pathogene micro-organismen, maar storen met behulp van Ca2 + chemische sondes standaardprocedures. Bijvoorbeeld, een infectie langdurig cel meer dan 60 min door Shigella voorkomt u dat een willekeurige cel laden met chemische sondes, vermoedelijk vanwege de pathogeen-geïnduceerde veranderingen van de host plasma celmembranen. Consequent, is een daling van cel-geassocieerde Fluo-4 fluorescentie waargenomen tijdens de lange infectie kinetiek, als gevolg van de cytoplasmatische verlies van deze sonde. Vandaar, uitvoering van een besturingselement zoals de toevoeging van ionomycin om te bepalen van de fluorescentie bij de maximale Ca2 + concentraties aan het einde van de acquisities is cruciaal voor het identificeren van de reagerende cellen. Gepolariseerde intestinale epitheliale cellen relevant zijn voor een infectie van de pathogeen worden ook weergegeven worden vuurvaste een lading van de Ca2 + sonde en specifieke laden procedures vereisen. Hoewel het gebruik van een genetisch gecodeerde Ca2 + verslaggever (GECR) helpen kan enkele van deze kwesties op te lossen, introduceert het ook andere uitdagingen. De efficiëntie van de transfectie van cel hostsystemen kan vertegenwoordigen een ernstige beperking, vooral als het met een slechte besmettelijke rendement superimposes. Bovendien zijn de kenmerken van een alertheid op Ca2 + variaties van de meeste GECRs niet compatibel met de snelle kinetiek vereist voor lokale Ca2 + analyse. Ten slotte kan de uitdrukking van de GECR interfereren met ziekteverwekkers-gemedieerde processen. We zullen niet het gebruik van GECR voor de studie van Ca2 + signalering tijdens een host-pathogen interactions. De recente en gaande engineering van verschillende 'fast-reageert' GECR verdient waarschijnlijk onderzoekers om opnieuw hun gebruik in toekomstige studies.
Timing verwerving van lokale Ca2 + reacties tijdens bacteriële infectie:
De beeldvorming van lokale Ca2 + reacties vereist een hoge snelheid van Beeldacquisitie we een duurzame fluorescentie excitatie van de sonde Fluo-4. Vanwege de photodamage verbonden aan de verwerving van hoge-frequentie, is het van cruciaal belang dat de intensiteit van de lichte fluorophore-excitatie is gehouden tot het minimum dat is vereist om een voldoende signal-to-noise verhouding met een belichtingstijd niet meer dan 30 ms. hadden We goede resultaten met behulp van een LED systeem op 5% van de maximale intensiteit, gecombineerd met een 1.0 optische dichtheid filter met de overname set-up zoals beschreven in stap 2.1.4. Zelfs onder deze omstandigheden, echter, vonden we dat de continue verlichting nodig is voor de stream modus overname niet mogelijk een overname gedurende meer dan 2 min. Een sterkere verlichting of overnames periode overschrijdt deze limiet kan resulteren in niet-specifieke global Ca2 + reacties en/of de remming van de invasie van bacteriën processen, vermoedelijk gekoppeld aan photodamage. Terwijl de beeldvorming van lokale Ca2 + reacties over langere kinetiek mogelijk met meer gevoelige detectie middelen, bij huidige stand die dergelijke beeldvorming kan alleen worden uitgevoerd over een fractie van de beperkte tijd van de 15 min Shigella invasie proces. Ter dekking van het hele proces, we uitgevoerd opeenvolgende reeks 2-min streaming acquisities. Dit tijdsinterval is voldoende om te volgen de eerste lokale en globale Ca2 + reacties aan het begin van het proces van de infectie en om aanzienlijke verschillen in de stam van de wild-type Shigella en haar isogene ipgD mutant16. De ontwikkeling van een zeer gevoelige camera mogelijk onderzoekers verder te verminderen de intensiteit van de fluorophore verlichting en uitvoeren van lokale Ca2 + imaging gedurende langere perioden, dus de verbetering van de resolutie van de tijd van meer voorbijgaande Ca2 + signalen.
Ruimtelijke correlatie tussen lokale Ca2 + reacties en sites van de bacteriële invasie:
Vanwege het lokale aspect van signalering gebeurtenissen geïnduceerd door micro-organismen, is het belangrijk om te studeren van lokale Ca2 + signalen met betrekking tot hun associatie met sites van het pathogene agens-gastheer cel interacties. Deze twee soorten overwegingen aan de orde gesteld. Eerst alle cellen niet kunnen worden besmet, en alle micro-organismen kunnen niet leiden tot signalering. Shigella, slechts een minderheid van bacteriën leiden tot een invasie en alle cellen niet kunnen worden besmet. In onze experimenten, de MOI was aangepast zodat die een cel een 0,7 vormt - 1 focus van de invasie van bacteriën. Hogere aantallen foci/cel kan leiden tot een mogelijke storingen voor de analyse van individuele invasie gebeurtenissen en, omgekeerd, hoe lager het getal kunnen maken van de analyse te ingewikkeld, met name bij de studie van Transient transfected cellen. We vonden dat de efficiëntie van de transfectie oplopen tot ten minste 30% van de cellen moet te verlagen van het aantal repliceren experimenten naar beheersbaar nummers. Ten tweede, Shigella invasie sites kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd door fase contrast microscopie. Voor andere processen, kunnen andere fluorescentie gebaseerde detectiemethoden worden gebruikt. Een belangrijk aspect, is echter dat in de meest experimentele opstellingen, de verwerving stream vereist voor lokale Ca2 + imaging zich verzet tegen andere soorten overname tijdens de periode. Dit impliceert dat het proces geanalyseerd mag geen significante beweging tonen tijdens deze stroom toe te staan hun ruimtelijke correlatie met lokale Ca2 + signalen. Terwijl dit het geval voor Shigella invasie gebeurtenissen die naar hetzelfde gebied cel over enkele minuten is lokaliseren, kunnen zeer motile processen niet beheersbaar of kortere overname stromen waarschijnlijk zou vereisen.
Scoring en analyse van lokale Ca2 + antwoorden:
Terwijl globale Ca2 + reacties gemakkelijk worden gedetecteerd, vereist de detectie van lokale Ca2 + reacties kleine amplitude en duur van de optimalisatie van de overname van fluorescerende signalen zoals hierboven beschreven. Het is ook belangrijk dat er strenge criteria worden toegepast zodat u kunt onderscheiden van de signalen boven de verschillen in de achtergrond. Als een regel scoren we een Ca2 + signaal een stijging van de gemiddelde Fluo-4 intensiteit van de fluorescentie die minstens 3 x de basislijn variaties in drie opeenvolgende 30 ms acquisities bereikt. Deze reactie wordt beschouwd als lokale als een andere regio van de cel tonen dezelfde gemiddelde fluorescentie intensiteit niet een dergelijke verhoging toont. Het scoren van lokale Ca2 + reacties in verschillende monsters moet geen grote problemen veroorzaken als deze regels systematisch worden toegepast. In onze handen, de lage frequentie van lokale Ca2 + signalen die is gekoppeld aan de invasie van bacteriën en variërend van 5 tot 20% van de cel geanalyseerd vertegenwoordigd een grote hindernis. Buiten de biologische variaties gedetailleerd beschreven in de vorige paragraaf, het feit dat alleen een stream die overeenkomt met een fractie van het geanalyseerde invasie proces ook aan deze lage frequentie bijdraagt. Vanwege deze lage frequentie, kan tot oprichting van de verschillen tussen monsters betrekken een kracht test uitvoeren op proefprojecten te schatten van de omvang van de steekproef te bereiken een statistische significantie.
Toekomstige toepassingen:
Wij zijn van mening dat de protocollen uitgewerkt voor het analyseren van lokale Ca2 + signalen tijdens de invasie van een Shigella zal nuttig zijn om de afbeelding lokale Ca2 + reacties voor alle processen die het ruimtelijk blijven beperkt blijven gedurende de periode van de verwerving. Terwijl Ca2 + signalering veelzijdig is, kan lokale Ca2 + signalering voor processen die zich voordoen bij de plasma of intracellulaire membranen waar de eerste signalen uit puntbronnen woont meest relevant zijn. Dus, tijdens microbiële-gastheercel interacties, lokale Ca2 + signalen mogelijk relevant voor zelfklevende of invasieve processen op het plasma-membraan of voorkomende bij intracellulaire membranen van de pathogeen-bevattende vacuolen. Aan de andere kant, kunnen de protocollen waarmee we analyseren van globale Ca2 + signalen over uitgebreide infectie kinetiek belang zijn om processen op het gebied van de algemene celfysiologie tijdens een infectie, zoals de regulering van een transcriptionele programma of cel dood paden door ziekteverwekkers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te verklaren.
Acknowledgments
Wij danken Jenny-Lee Thomassin voor haar hulp bij het bewerken van het manuscript. Het werk werd gesteund door de ANR verleent MITOPATHO en PATHIMMUN, verleent de Labex Memolife en PSL IDEX Shigaforce. Chunhui Sun is een ontvanger van een subsidie van de Ph.D. van de China Scholarship Raad. Laurent Combettes en Guy Tran Van Nhieu zijn ontvangers van een beurs van WBI-France Tournesol programma N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche dans le cadre des Partenariats Hubert Curien).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| Metamorph version 7.7 | Universal Imaging | ||
| CoolLED illumination system pE-2 | Roper Scientific | ||
| micro-dish 35 mm, high | IBIDI | 81156 | |
| Trypticase Soy (TCS) broth | Thermofisher | B11768 | |
| TCS agar | Thermofisher | B11043 | |
| Congo red | Sigma-Aldrich | 75768 | |
| M90T-AfaE | Sun et al. 2017 | Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin | |
| ipgD-AfaE | Sun et al. 2017 | isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin |
References
- Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier. Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
- Strehler, E. E. Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2). Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).
- Muallem, S. Decoding Ca2+ signals: a question of timing. Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).
- Uhlen, P., Fritz, N. Biochemistry of calcium oscillations. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).
- Carneiro, L. A., et al. Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells. Cell Host & Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).
- Horng, T. Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome. Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells. Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).
- Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles. Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).
- Tran Van Nhieu, G., et al. Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion. Nature Communications. 4, 1567 (2013).
- Niebuhr, K., et al. Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology. The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).
- Konradt, C., et al. The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism. Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).
- Friedrich, P. The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).
- Thomas, D., et al. A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals. Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).
- Sun, C. H., et al. The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells. The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).
- Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus. Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).
