Summary
Här presenterar vi protokoll för att visualisera kalcium (Ca2 +) Svaren framkallas av HeLa celler infekterade av Shigella. Genom att optimera parametrarna för bakteriell infektion och imaging med Ca2 + fluorescerande sonder, kännetecknasatypiska globala och lokala Ca 2 + signaler induceras av bakterier över ett stort spektrum av infektion kinetik.
Abstract
Ca2 + är en allestädes närvarande ion som är inblandade i alla kända cellulära processer. Medan globala Ca2 + svar kan påverka cell öde, reglera lokala variationer i gratis Ca2 + cytosoliska koncentrationer, kopplade för att släppa från interna butiker eller ett inflöde genom plasmamembranet kanaler, kortikal cellprocesser. Patogener som följer eller invadera värd celler utlösa en omorganisation av aktin cytoskelettet underliggande värd plasmamembranet, vilket sannolikt påverkar både globala och lokala Ca2 + signalering. Eftersom dessa händelser kan inträffa vid låga frekvenser i en pseudo stokastiska sätt över utökade kinetik, väcker analys av Ca2 + signaler induceras av patogener stora tekniska utmaningar som måste lösas.
Här rapporterar vi protokoll för detektion av globala och lokala Ca2 + signaler vid en Shigella infektion av epitelceller. I protokollen, artefakter kopplade till en långvarig exponering och åldrad hud är associerad med excitation av Ca2 + fluorescerande sonder är Felsökte genom att strikt Kontrollera parametrarna förvärv över definierade tidsperioder under en Shigella invasionen. Förfaranden genomförs för att noggrant analysera den amplitud och frekvens av globala cytosoliska Ca2 + signaler under förlängd infektion kinetik använder kemiska sonden Fluo-4.
Introduction
Ca2 + reglerar alla kända cellprocesser, inklusive cytoskeletal omorganisation, inflammatoriskt svar och cell death vägar besläktade med värd-patogen interaktioner1,2,3. Under fysiologiska betingelser, basal cytosoliska Ca2 + koncentrationerna är låga, i hundratals nM räckvidd, men kan bli föremål för övergående ökningar vid agonist stimulering. Dessa variationer visar ofta oscillerande beteende genom åtgärder av pumpar och kanaler på plasma och endoplasmatiska retiklet membran. Mönstret av dessa svängningar kännetecknas av tid, varaktighet och amplituden av Ca2 + ökar och dekrypteras av celler, som i sin tur utlöser specifika reaktioner i vad som kallas den Ca2 + kod4,5 . En ihållande ökning av cytosoliska Ca2 + koncentrationen under sjukdomstillstånd kan leda till celldöd som är associerad med permeabiliseringen av mitokondriell membran och frisläppandet av pro-apoptotiska eller nekrotiska faktorer6, 7.
Shigella, vilka smittämnen av bacillär dysenteri, invaderar epitelcellerna genom att injicera effektorer i värdceller använder en typ III sekretion system (T3SS)8,9. En Shigella invasion av värdceller associeras med lokala och globala Ca2 + signaler som framkallas av T3SS. När det gäller pore-bilda toxiner, den T3SS translocon som infogas i värd cellmembran och krävs för injektion av T3SS effektorer är troligen ansvarig för aktivering av PLC och inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-beroende Ca2 + släpp. Kombinationen av den lokaliserade PLC-stimuleringen och ackumulation av polymeriserat aktin på platser Shigella invasion resultat i ett onormalt långvariga InsP3-beroende Ca2 + släpp10. Den typ III effektor IpgD, en fosfatidyl 4,5 bisphosphate (PIP2) -4-fosfatas, begränsar det lokala PIP2, därmed styra mängden tillgängligt substrat för PLC att generera InsP3, vilket bidrar till förlossningen av lokala Ca2 + Svaren på bakteriell invasion platser11,12. Dessa lokala Ca2 + svar sannolikt bidra till aktin polymerisation Shigella invasion platser10. Globala Ca2 + svar som är också framkallas av Shigella, dock är överflödiga för bakteriell invasion processen men utlösa öppnandet av connexin hemichannels på plasmamembranet och lanseringen av ATP i den extracellulära fack. Släppta ATP agerar på ett sätt som parakrin, stimulerar i sin tur Ca2 + oscillerande svaren i cellerna bredvid den infektera cellen. IpgD ansvarar också för att forma globala Ca2 + svar till oberäkneligt isolerade svaren med långsam dynamik. Så småningom, efter en långvarig bakteriell infektion leder IpgD till hämning av InsP3-medierad Ca2 + signaler. Genom dess inblandning med Ca2 + signalering, IpgD försenar en Ca2 +-beroende calpain aktivering leder till demonteringen av fokal vidhäftning strukturer och den för tidig avlossning av infekterade celler13.
Medan Ca2 + signaler är inblandade i kritiska aspekter av patogenes, väcker användning av en mikroorganism en rad tekniska utmaningar som inte uppstår i klassiskt agonist studier. De protokoll som beskrivs använder här vanliga lysrör Ca2 + kemiska indikatorn Fluo-4 som vi konstruerade för att karakterisera lokala Ca2 + signaler under en Shigella infektion. Steg som är kritiska för att upptäcka dessa signaler diskuteras, liksom förfaranden som genomförts för deras kvantitativ analys som krävs för att karaktärisera rollen av bakteriell effektorer i Ca2 + signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förberedelser
-
Bakterier förberedelse
- Tavla bakterier —Shigella vildtyp stam att uttrycka den AfaE adhesin (M90T-AfaE) — på en trypticase soy (TCS) agar tallrik innehållande 0,01% kongorött (SP) och inkubera dem i 18 timmar vid 37 ° C.
Obs: För att öka deras reproducerbarhet, Shigella plattorna erhölls i steg 1.1.1 lagras vid 4 ° C och bör användas inom en vecka, eftersom alla kolonier på CR medium blir så småningom röd över tid. - Inokulera TCS buljong före kultur genom att plocka 3 röda kolonier från strimma plattorna.
Obs: En inympning med 3 kolonier utförs för att begränsa sannolikheten för att plocka en enda klon vars virulens plasmid har genomgått en genetisk rekombination. - Växa flytande bakteriekulturer i en skakande inkubator för 16 h vid 37 ° C 200 rpm. Lägg till ampicillin med en slutlig koncentration på 75 mg/mL. Antibiotiska koncentrationerna bör inte överstiga 3 x den minsta hämmande koncentrationen, eftersom ett överskott av antibiotika kan leda till förlust av stora virulens Plasmiden.
Obs: Underhåll av Shigella virulens plasmiden bör kontrolleras av plätering bakteriekulturerna på CR tallrikar kompletteras med lämpliga antibiotiska koncentrationerna. Förekomsten av vita kolonier indikerar plasmid förlust. - Inokulera TCS kulturen med den pre bakterieodling vid en spädning 1: 100. Inkubera det vid 37 ° C i en skakande inkubator för 2 h på 200 rpm. Se till att den optiska densiteten vid 600 nm (OD600nm) är 0,2 - 0,4.
- Centrifugera bakteriella kulturen i 2 min på 13 000 x g vid 21 ° C och återsuspendera pelleten i en motsvarande volym av EM medium (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 5 mM glukos och 25 mM HEPES pH = 7,3).
- Späd bakteriesuspensionen i en EM-buffert på en slutlig OD600nm 0,1 och använda den direkt eller förvara den vid 21 ° C och Använd den inom de nästa 60 min.
- Tavla bakterier —Shigella vildtyp stam att uttrycka den AfaE adhesin (M90T-AfaE) — på en trypticase soy (TCS) agar tallrik innehållande 0,01% kongorött (SP) och inkubera dem i 18 timmar vid 37 ° C.
-
Cell förberedelse
- Kultur HeLa cells i DMEM med 1 g/L av glukos kompletteras med 10% fetalt kalvserum (FCS) och odla dem vid 37 ° C med 10% CO2. Växa TC-7 odlas i DMEM med 4,5 g/L av glukos, som innehåller 10% FCS och icke-essentiella aminosyror i en 37 ° C inkubator som innehåller 10% CO2.
- För cell underhåll, dela upp cellerna regelbundet för att undvika en inhibition av tillväxt-kontakt kopplad till konfluenta stater; Detta är avgörande för en hög Ca2 + sond lastning/transfection effektivitet.
- Tallrik HeLa cells på sterila 25 mm diameter cirkulär coverslips i 6 brunnar på en densitet på 3 x 105 celler per brunn dagen innan experimentet för HeLa cellerna.
- För TC-7 celler, trypsinize och räkna celler. Utsäde dem på 4 x 105 celler per brunn och inkubera dem 5-7 dagar vid 37 ° C i en 10% CO2-inkubator innan experimenten som möjliggör en polarisering.
- Uppdatera cellodlingsmedium varje dag fram till dagen för experimentet.
Obs: Glasbotten 35 mm diameter disponibla kamrarna kan också användas som ett alternativ till coverslips-innehållande brunnarna. Om dessa används, temperaturkontroll genom en uppvärmd scenen eller mål inte är tillräcklig och en termostat inkubation kammare monterad på krävs Mikroskop scenen.
- Uppdatera cellodlingsmedium varje dag fram till dagen för experimentet.
- Dagen av experimentet, ta bort mediet och tvätta cellerna 3 x med 1 mL EM medium vid 21 ° C.
- Ladda cellerna med 3 mM Fluo-4-AM14 i en EM-buffert för 30 min vid 21 ° C.
Obs: Medan lastning av sub konfluenta HeLa cells inte väcker stora problem, lastning av polariserade TC-7 celler är ofta heterogena och dåligt effektivt. För dessa celler, Vi hittade att lastning effektivitet förbättras genom tillägg av den spridning agenten — pluronic syra — med en slutlig koncentration på 0,1% och den anjontransportör hämmare bromosulfophtalein med en slutlig koncentration på 20 µM till den Fluo 4 AM-innehållande-EM. Användning av proportionerlig kemiska sonder eller genetiskt kodade-bandet sonder som kräver dubbla-förvärv inte är kompatibel med hastigheten på förvärvet krävs för bildtagning av lokala Ca2 + svar. - Tvätta proverna 3 x med EM buffert och ytterligare Inkubera dem i 1 mL EM buffert vid 21 ° C för hydrolys av i AM-delen. Användning Fluo-4 laddade celler omedelbart eller inom den nästa 90 min (underhålls vid 21 ° C).
2. infektion och bild förvärv av lokala Ca2 + Svaren
- Placera den täckglas som innehåller Fluo-4 laddade celler i en tänkbar kammare eller glas-botten kammare. Tvätta proverna i imaging kammaren eller glasbotten disponibel kammare 3 x med EM buffert att ta bort föreningar potentiellt följd cellys. Tillsätt 1 mL EM buffert.
- Placera kammaren på en inverterad fluorescens Mikroskop scenen uppvärmd till 33 ° C.
Obs: Denna temperatur är markerad som en kompromiss mellan de optimala temperaturerna kompatibel med Shigella invasion processen och sakta av Ca2 + svaren att visualisera lokala svaren. Vi använder en 63 X nedsänkning olja mål (NA = 1,25) utrustade med fas kontrast ringar. - Välj ett fält för mikroskopi och ställa in förvärv parametrar, inklusive exponeringstid och binning om nödvändigt, att optimera Fluo-4 fluorescerande signalen.
Obs: Den stora utmaning för lokala Ca2 + imaging är den låg amplituden och små varaktigheten av svaren, som kräver förvärv minst var 30 ms. flera kommersiellt tillgängliga back-belysta EM-CCD eller C-MOS kameror presentera den krävs känslighet att upptäcka lokala Ca2 + Svaren använder Fluo-4. Upptäckt känslighet är också en viktig fråga att begränsa photodamage eller artefakter såsom spontana svar kopplade till fluorescerande excitation av Fluo-4 med hög frekvens. Här, en LED-baserad belysning av 470 nm, med en 480 ± 40 nm band-passera excitationsfilter, 505-nm dikroiskt filter och en 527 ± 30 nm band-passera utsläpp används på 5% av dess maximal intensitet i kombination med en 1.0 neutral densitet filter användes för att minimera dessa problem under en ström av förvärv av begränsad varaktighet. En analys av lokala Ca2 + signaler partier på 120 s strömmar utfördes rutinmässigt. Dessa låg belysning villkor observerades fluorophore fotoblekning inte under 2 min-stream förvärven. Successiva förvärv på samma prov kan utföras, förutsatt olika fält som används. Som regel utförs en första förvärvet ström på ett kontrollfält i avsaknad av bakterier stimulans att säkerställa frånvaro av spontana svar. Om spontana Svaren observeras, tvättas proverna med EM buffert tills inga svar observeras. - Lägg till bakterier i provet, bort 500 µL av EM buffert från kammaren och tillsätt 500 µL av bakteriesuspensionen bereddes i steg 1.1.6 att erhålla en slutlig OD600nm 0,05, med lämplig omsorg att undvika flytta fältet valda mikroskopi. volymerna säkerställa en korrekt blandning av bakterierna och en homogen fördelning av bakterier på cellprover.
- Utföra ett förvärv vid bakteriell tillägg. Alternativt utföra ett förvärv 10 min efter bakteriell tillägg, som motsvarar den tid som krävs för bakterier att sediment på celler enligt de villkor som används. I slutet av förvärvet strömmer, förvärva en faskontrast bild av det markerade fältet att visualisera bakterierna att kontakta cellerna och de membran volanger som är associerade med bakteriell invasion platser.
- Upprepa förfarandet förvärv som i steg 2.5, med mellanrum som är mottagliga för varaktigheten av den bild förvärv, filer besparingar och urval av ett nytt fält att täcka hela processen.
Obs: För Shigella, Vi hittade att förvärvet strömmar varje 5 min för 20 min, efter 10 min bakteriell sedimentation, får täcka merparten av händelserna som invasionen. - I slutet av förfarandet förvärv, lägga till en slutkoncentration av 2 µM av Ca2 + jonofor ionomycin proverna att bestämma maximal amplitud av Ca2 + signaler. Förvärva bilder alla 3-5 s tills signalen stabilisering, oftast för mindre än 10 min.
- Följ genom att lägga till Ca2 + kelator EGTA med en slutlig koncentration på 10 mM att bestämma fluorescens signalen i avsaknad av Ca2 +. Förvärva bilder alla 3-5 s tills signalen stabilisering, oftast för mindre än 10 min.
Obs: På grund av den relativt långsamma dynamiken i de globala Ca2 + variationerna, utföra dessa förvärv varje 3-5 s (inte i streaming-läge), vilket möjliggör Ca2 + imaging på samma mikroskopiska fält under de på varandra följande behandlingarna.
3. analys
- Express cytosoliska Ca2 + variationer över tiden som procentuella andelen ΔF/F0, där ΔF representerar variationen av genomsnittliga fluorescensintensiteten hos regionen av intresse (ROI) och F0 baslinjen fluorescensen i samma ROI, som en icke-relevant region i fältet saknar celler dras.
- Ta bort basala fluorescens nivåer för varje cell i olika områden, motsvarande till baslinjenivåerna; dessa nivåer kan fastställas entydigt på grund av den låga frekvensen och kort relativt varaktighet av lokala Ca2 + svaren i en viss ström förvärv.
Obs: Kvantifiera slående funktioner de svaren som rör frågorna och patogena modellen studerade. Klassiskt, beaktas olika parametrar att analysera Ca2 + signaler, inklusive frekvensen av celler som visar lokala eller globala Ca2 + svar, samt varaktighet, amplitud och frekvens av dessa svar. När det gäller Shigella och lokala svaren är en annan viktig aspekt av analysen rumsliga föreningen av svaren bakteriell invasion platser.
- Ta bort basala fluorescens nivåer för varje cell i olika områden, motsvarande till baslinjenivåerna; dessa nivåer kan fastställas entydigt på grund av den låga frekvensen och kort relativt varaktighet av lokala Ca2 + svaren i en viss ström förvärv.
- För att kvantifiera andelen lyhörd celler visar globala eller lokala svaren, rita ROIs i celler, i tidsserier motsvarar ljusstyrkevariationer Fluo-4.
- Strikt parametrarna att identifiera lokala Ca2 + svaren, till exempel en amplitud av three-fold ovanstående bakgrund variationer av genomsnittliga fluorescens intensitet cell baslinje eller en varaktighet på minst 200 ms, Undvik scoring ett falskt positivt.
Obs: Som en allmän regel, även små lokala Ca2 + Svaren kan skiljas från något bakgrundsbrus deras profil. ROIs bör vara tillräckligt stor för att integrera tillräckligt fluorescens-signaler för att möjliggöra detektion av lokala variationer. Beroende på intensiteten i Fluo-4 upptäckt, kan dessa ROIs motsvara cirklar med diametrar alltifrån 2-5 mM. - Mäta de genomsnittliga Fluo-4 fluorescensintensiteten i 2 regioner i ett distinkt område i samma cell, avgöra om svaren är lokala eller globala.
Obs: Analys av ett stort antal celler underlättas genom användning av tänkbar mjukvaran tillåter den on-line skärm uppvisning av variationer av genomsnittliga fluorescensintensiteten över tid för utvalda regioner. Kommersiellt tillgängliga bildprogram har ett sådant alternativ, men detta kan också utföras med Icy freeware, använder ROI intensitet Evolution plugin. - Bestämma procentandelen av celler som visar lokala svaren.
Obs: Denna procentsats beräknas utifrån det totala antalet celler som analyseras i fältet mikroskopi, som bör vara i tillräckligt antal till stöd för ett statistiskt betydelse med ett icke-parametriska test. - Fastställa varaktigheten av de lokala svaren.
Obs: Lokal Ca2 + svar kan ytterligare urskiljas enligt deras varaktighet varierar (dvs. mindre än 500 ms, mellan 5 och 10 s, eller över 10 s) och deras samband med Shigella invasion platser.
- Strikt parametrarna att identifiera lokala Ca2 + svaren, till exempel en amplitud av three-fold ovanstående bakgrund variationer av genomsnittliga fluorescens intensitet cell baslinje eller en varaktighet på minst 200 ms, Undvik scoring ett falskt positivt.
- Kvantifiera amplituden av svaren. Först kalibrera maximal Ca2 + och cell bakgrundsnivåer bestäms som i steg 2.1.7. Eftersom Fluo-4 belastningen kan variera för varje cell, utföra dessa bestämningar för enskilda celler i fältet.
- Express amplituden av svaren som relativa andel av den maximalt svaren.
- Utföra statistiska tester med en normalitet test, följt av en parametrisk test att analysera potentiella skillnader i amplituden av svaren mellan prover.
- Bestämma associering av dessa svar i förhållande till bakteriell invasion webbplatser genom deras respektive lokalisering till de bakterie-inducerad membran volanger visualiseras i motsvarande fas kontrast bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Shigella invasion är associerade med atypiska långvariga lokala Ca2 + svaren:
Efter de protokoll som nämns ovan, Fluo-4-loaded HeLa cells utmanades med WT Shigella och stream förvärv utfördes för att analysera Ca2 + signaler. Ett representativt experiment visas i figur 1, med time-lapse bilder serie fluorescensintensiteten hos Fluo-4 sonden i genomsnitt i en region av intresse för en enda cell, och motsvarande fas kontrast bilden (figur 1A, vänster panelen). Shigella invasion platsen kännetecknas av membran volanger upptäckts i fas kontrast bilden (figur 1A, pil). Atypiska lokala ökar i gratis cytosoliska Ca2 + observeras vid Shigella invasion platsen med en varierande amplitud och löptider som sträcker sig från 2,5-5 s (figurerna 1A och 1B, pilar), följt av globala ökningar i de smittade cellen (figur 1B, pilspetsar).
Den typ III effektor IpgD reglerar övergången från lokala till globala Ca2 + svar induceras av Shigella i HeLa celler:
Analys av Ca2 + signaler induceras av vildtyp Shigella och en syngena mutant stam deficient för typ III effektor IpgD, en fosfatidyl 4, 5 bisphosphate fosfatas, anges att denna sistnämnda stam inducerad mer globala och mindre atypiska lokala svaren med långa löptider (RATPs) med 11,3 ± 4,4 (SEM) % och 40,3 ± 7,5 (SEM) % av cellerna lyhörd med globala svar när det gäller en WT och ipgD mutant, respektive (figur 1 d)15. Denna ipgD mutant erhåller lokala svar på en liknande frekvens som WT stammen.
Shigella hämmar InsP3-beroende globala Ca2 + ökar i HeLa cells under långvarig infektion kinetik:
Bildtagning av globala Ca2 + svar över utökade infektion kinetik pekade på en minskning i frekvensen av svaren 30 min efter utmaningen med vildtyp Shigella (figur 2A). En liknande minskning i frekvensen av Ca2 + svar observerades i TC-7 celler som smittats i 30 min med vildtyp Shigella15. Kvantifiering av dosberoende cell Svaren till Ca2 + agonist histaminen illustrerar hämning av en InsP3-beroende Ca2 + release i sena skeden i Shigella infektioner. WT Shigella leder till atypiska isolerade Ca2 + Svaren under de första 30 min av infektionen och efter ytterligare inkubation, en drastisk minskning i amplitud och frekvens av Ca2 + svar observerades (figur 2B).
Figur 1 . Lokala och globala Ca2 + Svaren under Shigella invasion. HeLa celler var laddad med Fluo-4-AM och utmanade med WT Shigella. (A), den vänstra panelen visar faskontrast bilder. Den högra panelen visar tidsserier av Fluo-4 genomsnittliga fluorescensintensitet med den färgkod som avbildas till höger. Tiden från början av förvärv anges i sekunder, 10 min efter Bakterieutmaningen. Pilen anger de invasion foci. Cirklarna skildras motsvarar regionerna analyseras i (B) där spåren med motsvarande färg representerar variationerna i Fluo-4 genomsnittliga fluorescensintensiteten över baslinjen. Pilarna anger lokala svaren. Pilspetsar visar globala svar. (C) Detta är ett system som skildrar fastställandet av varaktigheten av Ca2 + svaren. Den vågräta streckade linjen visar de basala Ca2 + nivåerna (F0); lodräta staplarna visar bakgrunden variationer. Den vertikala streckade linjen visar den maximal amplituden av svar; de vågräta strecken ange varaktigheten för svaret bestäms vid halv maximal amplitud. (D) Detta är procentandelen av lyhörd celler ± SEM visar lokala svaren och globala Ca2 + svar inducerad 5 min efter infektion med de WT Shigella (mörk grå staplar) eller ipgD mutant (ljus grå staplar). RATPs är lokala Ca2 + svaren som håller för mer än 5 s. N = 4; > 60 celler för varje gång. Wilcoxon test, *P < 0,05; P < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Hämning av globala Ca2 + svar under utökade kinetik av Shigella infektion. (A), den övre blå pilarna representerar tidsskalan för bakteriell och histamin utmaningen vid de angivna koncentrationerna. I denna panel visas representativa tracesna av enstaka cell globala Ca2 + variationer efter infektionen av de WT Shigella (grön) och ipgD mutant stam (orange). (B) i denna panel visas procentandelen av amplituden av Ca2 + svaren i förhållande till den maximalt svaren, vid en stimulering på 0,5 μM histamin celler infekterade med de angivna stammarna för 90 min. Den fasta vågräta fältet representerar den genomsnittliga maximala procentsatsen. Wilcoxon test, **P < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript beskriver de protokoll som vi konstruerade för att följa lokala Ca2 + signaler under relativt kort kineticsen av en Shigella invasion, liksom globala Ca2 + svar under utökade kineticsen av Shigella. Nedan, nyckel finns problem som behöver åtgärdas för att optimera upptäckt av Ca2 + signaler samtidigt minimera eventuella störningar med de biologiska processerna.
Kemiska vs. kodade genetiskt Ca2 + sonder:
För att bild lokala Ca2 + variationer, använde vi Fluo-4 kemiska sonden på grund av dess höga kvantutbyte och dess snabb respons dynamik. Den hastighet som krävs för förvärvet även utesluter användning av proportionerlig sonder, eftersom en spektrofotometer förvärv inte kan utföras. Användning av patogena mikroorganismer, kan dock störa standardförfaranden som använder Ca2 + kemisk sonder. Exempelvis förhindrar en långvarig cell infektion över 60 min av Shigella någon cell som laddar med kemiska sonder, förmodligen på grund av patogen-inducerad ändringar av plasma värd cellmembranen. Konsekvent, observeras en minskning av cell-associerade Fluo-4 fluorescens under lång infektion kinetik, på grund av cytoplasmisk förlusten av denna sond. Genomföra en kontroll såsom tillägg av ionomycin att bestämma fluorescensen vid maximal Ca2 + koncentrationerna i slutet av förvärven är därför avgörande för att identifiera cellerna som är lyhörd. Också, polariserade tarmepitelceller relevant för en patogen infektion verkar vara refraktära mot en lastning av Ca2 + sonden och kräver särskilda lastning förfaranden. Medan användningen av en genetiskt kodade Ca2 + reporter (GECR) kan hjälpa till att lösa några av dessa frågor, introducerar det också andra utmaningar. Transfection effektiviteten i cell värdsystem kan utgöra en allvarlig begränsning, särskilt om det lägger med en dålig smittsamma avkastning. Dessutom är vad som kännetecknar en lyhördhet för Ca2 + varianter av de flesta GECRs inte kompatibla med snabb kinetik krävs för lokala Ca2 + analys. Slutligen, ett uttryck för GECR kan störa patogener-medierad processer. Vi kommer inte att diskutera användningen av GECR för studien av Ca2 + signalering under en host-patogen interaktion. Senaste och pågående konstruktion av olika ”snabb-svarar” GECR skulle förmodligen förtjänar forskare för att granska deras användning i framtida studier.
Timing förvärv av lokala Ca2 + Svaren under bakteriell infektion:
Bildtagning av lokala Ca2 + svar kräver en hög hastighet för bild förvärv ifrågasätta en ihållande fluorescens excitation av sonden Fluo-4. På grund av den photodamage kopplade till högfrekvent förvärvet, är det viktigt att intensiteten av fluorophore magnetiseringen ljus hålls till ett minimum som krävs för att erhålla en tillräcklig signal-brus-förhållande med en exponeringstid som inte överstiger 30 ms. vi hade bra resultat med hjälp av en LED-system på 5% av dess maximala intensitet, kombinerat med en 1.0 optiska densitet filter med förvärvet set-up som beskrivs i steg 2.1.4. Även under dessa förhållanden, men hittade vi att kontinuerlig belysning krävs för ström läge förvärvet inte tillät en anskaffningsperioden över 2 min. En starkare belysning eller förvärv period som överstiger denna gräns kan resultera i icke-specifika globala Ca2 + svar hämning av bakteriell invasion processerna, förmodligen kopplat till åldrad hud. Medan avbildning av lokala Ca2 + Svaren över längre kinetik kan vara möjligt med mer känslig detektion medel, nuvarande tillstånd sådan avbildning kan endast utföras under en begränsad tid bråkdel av de 15 min Shigella invasion processen. För att täcka hela processen, utfört vi successiva serie 2-min streaming förvärv. Detta tidsintervall är tillräckligt att följa första lokala och globala Ca2 + svar på uppkomsten av infektionsprocessen och fastställa signifikanta skillnader i Shigella vildtyp stam och dess syngena ipgD mutant16. Utvecklingen av en mycket känslig kamera får tillåta forskare att ytterligare minska intensiteten i fluorophore belysning och utföra lokala Ca2 + imaging över längre perioder, vilket förbättrar tidsupplösningen av mer övergående Ca2 + signaler.
Rumslig korrelation mellan lokala Ca2 + svaren och bakteriell invasion webbplatser:
På grund av den lokala aspekten av signalering händelser orsakade av mikroorganismer, är det viktigt att studera lokala Ca2 + signaler med avseende på deras förening med platser av patogen-host cell interaktioner. Detta upp två typer av överväganden. Först, alla celler kan inte vara smittad, och alla mikroorganismer kan inte utlösa signalering. För Shigella, bara en minoritet av bakterier utlöser en invasion, och alla celler kan inte vara infekterad. I vårt experiment, MOI justerades så att en cell bildar en 0,7 - 1 fokus av bakteriell invasion. Higher numrerar av foci deponicell kan leda till en eventuell inblandning för analys av enskilda invasion händelser och, omvänt, lägre siffror kan göra analysen alltför komplex, särskilt när man studerar normalnivå transfekterade celler. Vi hittade att transfection effektivitet måste uppgå till minst 30% av cellerna för att få ner antalet replikera experiment till hanterbara nummer. För det andra, Shigella invasion platser kan upptäckas lätt av fas kontrast mikroskopi. För andra processer, kunde andra fluorescens-baserad detektionsmetoder användas. En viktig aspekt, är dock att förvärvet strömmen krävs för lokala Ca2 + imaging i mest experimentella uppställningar, utesluter andra typer av förvärv under perioden. Detta ifrågasätter att processen analyseras inte bör visar betydande rörelse under denna ström att tillåta deras rumslig korrelation med lokala Ca2 + signaler. Även om detta är fallet för Shigella invasion händelser som lokaliserar till samma cellområde under flera minuter, mycket rörliga processer kanske inte hanterbart eller skulle förmodligen kräva kortare förvärv strömmar.
Scoring och analys av lokala Ca2 + svaren:
Även globala Ca2 + Svaren lätt upptäcks, kräver detektion av lokala Ca2 + Svaren liten amplitud och varaktighet optimering av förvärvet av fluorescerande signaler som beskrivs ovan. Det är också viktigt att strikta kriterier tillämpas för att skilja signaler över bakgrunden variationer. Som regel Poäng vi som Ca2 + signal en ökning av genomsnittligt Fluo-4 fluorescensintensiteten som når minst 3 x utgångsvärdet variationerna i tre på varandra följande 30 ms förvärv. Detta svar är ansedd som lokala om en annan region i cellen visar samma genomsnittliga fluorescensintensiteten inte visar en sådan ökning. Poängsättning av lokala Ca2 + svaren i olika prover bör inte orsaka stora svårigheter om dessa regler tillämpas systematiskt. I våra händer, den låga frekvensen av lokala Ca2 + signaler är associerade med bakteriell invasion och från 5-20% av cellen analyseras representerade ett stort hinder. Utöver de biologiska variationer som beskrivs i föregående punkt, det faktum att endast en ström motsvarande en bråkdel av den analyserade invasion processen också bidrar till detta låg frekvens. På grund av detta låg frekvens, kan att upprätta skillnader mellan prover implicerade utför ett power test på pilot experiment för att beräkna stickprovsstorleken för att nå en statistisk signifikans.
Framtida tillämpningar:
Vi tror att protokollen fungerat att analysera lokala Ca2 + signaler under en Shigella invasion kommer att vara bra att bilden lokala Ca2 + Svaren för alla processer som förblir rumsligt begränsad under perioden förvärv. Ca2 + signalering är mångsidig, kan lokala Ca2 + signalering vara mest relevanta för processer som sker på plasma eller intracellulära membran där de inledande punktkällor av signaler bosatta. Således under mikrobiell-värdcell interaktioner, lokala Ca2 + signaler kan vara relevanta för självhäftande eller invasiv processer på plasmamembranet eller förekommande på intracellulära membran av patogen-innehållande vakuoler. Däremot, kan de protokoll som vi utformade för att analysera globala Ca2 + signaler över utökade infektion kinetik vara relevanta för processer som påverkar den allmänna cellfysiologi under en infektion, till exempel reglering av ett transkriptionell program eller cell death vägar av patogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att deklarera.
Acknowledgments
Vi tackar Jenny-Lee Thomassin för hennes hjälp i redigering manuskriptet. Arbetet stöddes av ANR beviljar MITOPATHO och PATHIMMUN, bidrag från Labex Memolife och PSL IDEX Shigaforce. Chunhui Sun är en mottagare av en Ph.D. bidrag från Kina stipendium rådet. Laurent Combettes och Guy Tran Van Nhieu är mottagare av en WBI-Frankrike exchange Tournesol programmet N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche dans le cadre des partnerskapen Hubert Curien).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| Metamorph version 7.7 | Universal Imaging | ||
| CoolLED illumination system pE-2 | Roper Scientific | ||
| micro-dish 35 mm, high | IBIDI | 81156 | |
| Trypticase Soy (TCS) broth | Thermofisher | B11768 | |
| TCS agar | Thermofisher | B11043 | |
| Congo red | Sigma-Aldrich | 75768 | |
| M90T-AfaE | Sun et al. 2017 | Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin | |
| ipgD-AfaE | Sun et al. 2017 | isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin |
References
- Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier. Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
- Strehler, E. E. Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2). Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).
- Muallem, S. Decoding Ca2+ signals: a question of timing. Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).
- Uhlen, P., Fritz, N. Biochemistry of calcium oscillations. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).
- Carneiro, L. A., et al. Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells. Cell Host & Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).
- Horng, T. Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome. Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells. Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).
- Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles. Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).
- Tran Van Nhieu, G., et al. Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion. Nature Communications. 4, 1567 (2013).
- Niebuhr, K., et al. Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology. The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).
- Konradt, C., et al. The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism. Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).
- Friedrich, P. The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).
- Thomas, D., et al. A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals. Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).
- Sun, C. H., et al. The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells. The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).
- Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus. Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).
